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工业微生物育种的基本原理（2）工业微生物育种的基本原理（2）来源：青岛海博二、基因突变一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换，而导致的遗传变化称为基因突变，其发生变化的范围很小，所以又称点突变或狭义的突变。
染色体畸变是指大段染色体的缺失、重复、倒位、易位。
广义的突变包括染色体畸变和点突变。
从自然界分离得到的菌株一般称野生型菌株，简称野生型。
野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，称突变株。
(一)基因突变的类型基因突变的类型极为多样。
人们可从不同的角度对基因突变进行分类，并给以不同的名称。
根据突变体表型不同，可把突变分成以下几种类型：1.营养缺陷型：某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法在基本培养基（MM）上正常生长繁殖的变异类型，称为营养缺陷型，它们可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出。
营养缺陷型突变株在遗传学、分子生物学、遗传工程和育种等工作中十分有用。
2.抗性突变型：抗性突变型是指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型，它们可在加有相应药物或用相应物理因子处理的培养基平板上选出。
抗性突变型普遍存在，例如对一些抗生素具抗药性的菌株等。
抗性突变型菌株在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程等研究中极其重要。
3.条件致死突变型：某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖，这种突变类型称为条件致死突变型。
广泛应用的一类是温度敏感突变型。
这些突变型在一定温度条件下并不致死，所以可以在这一温度中保存下来。
它们在另一温度下是致死的，通过它们的致死作用，可以用来研究基因的作用等问题。
4.形态突变型：形态突变型是指由突变引起的个体或菌落形态的变异，一般属非选择性突变。
例如，细菌的鞭毛或荚膜的有无，霉菌或放线菌的孢子有无或颜色变化，菌落表面的光滑、粗糙以及噬菌斑的大小、清晰度等突变。
第一章绪论1.什么是工业微生物？作为工业微生物应具备哪些特征？答：工业微生物：对自然环境中的微生物经过改造，用于发酵工业生产的微生物。
具备特征：(1)菌种要纯(2)遗传稳定且对诱变剂敏感(3)成长快，易繁殖(4)抗杂菌和噬菌体的能力强(5)生产目的产物的时间短且产量高(6)目的产物易分离提纯2.工业微生物育种的基础是什么？答：工业微生物育种的基础是遗传和变异。
3.常用的工业微生物育种技术有哪些？答：常用技术：(1)自然选育【选择育种】(2)诱变育种(3)代谢控制育种(4)杂交育种(5)基因工程育种第二章微生物育种的遗传基础1.基因突变的类型有哪些？答：有碱基突变，染色体畸变2.叙述紫外线诱变的原理？答：原理：紫外线对微生物诱变作用，主要引起DNA的分子结构发生改变（同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体），从而引起菌体遗传性变异。
3.基因修复的种类有哪些？答：种类：(1)光复活修复(2)切除修复(3)重组修复(4)SOS修复4.真核微生物基因重组的方式有哪些？答：方式：(1)有性杂交(2)准性生殖(3)原生质体融合第三章出发菌株的分离与筛选1.什么是富集培养？答：富集培养：指在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境中的优势种，以利于分离到所需要的菌株。
2.哪些分离方法能达到“菌落纯”？哪些分离方法能达到“细胞纯（菌株纯）”？答：菌落纯：稀释分离法、划线法、组织法细胞纯：单细胞或单孢子的分离法3.分离好氧微生物常用的方法有哪些？答：(1)稀释涂布法(2)划线分离法(3)平皿生化反应分离法4.平皿生化反应分离法有哪些？分别用来筛选哪些菌？各自原理如何？答：(1)透明圈法原理：在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊，能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小可以放映该菌株利用底物的能力。
⼯业微⽣物育种全解1.⼯业微⽣物育种在发酵⼯业中的作⽤如何？其⽬的是什么？⼯业微⽣物育种建⽴在：（1）遗传和变异（微⽣物遗传学）的基础之上；（2）物理和化学诱变剂的发现和应⽤；（3）⼯业⾃动化（⾃动仪表装置和微机）。
⼯业微⽣物育种在发酵⼯业中占有重要地位，是决定该发酵产品能否具有⼯业化价值及发酵过程成败与否的关键。
2.⼯业微⽣物发展经历了哪⼏个阶段？1)⾃然选育阶段2)⼈⼯诱变选育阶段3)杂交育种阶段4)代谢控制育种阶段5)基因⼯程育种阶段3.⼯业微⽣物育种的核⼼指标有哪些？1)在遗传上必须是稳定的。
稳定性。
2)易于产⽣许多营养细胞、孢⼦或其它繁殖体。
3)必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬菌体。
4)种⼦的⽣长必须旺盛、迅速。
5)产⽣所需要的产物时间短。
转化率。
6)⽐较容易分离提纯。
7)有⾃⾝保护机制，抵抗杂菌污染能⼒强。
8)能保持较长的良好经济性能。
产率。
9)菌株对诱变剂处理较敏感，从⽽可能选育出⾼产菌株。
10）在规定的时间内，菌株必须产⽣预期数量的⽬的产物，并保持相对地稳定。
4.⾰兰⽒阳性和阴性菌的细胞壁结构有何差异？它们对溶菌酶和青霉素的敏感有何不同？5.缺壁细菌有哪些类型和异同？制备缺壁细菌主要有哪些途径？原⽣质体：G+菌经溶菌酶或青霉素处理；球状体：G-菌，残留部分细胞壁。
是研究遗传规律和进⾏原⽣质体育种的良好实验材料。
L型细菌：⾃发突变形成细胞壁缺陷菌株；6.原⽣质体制备时，为什么不同微⽣物要选择不同的酶？举例说明。
酶在原⽣质体制备中主要⽤来酶解细胞壁的，不同的微⽣物其细胞壁成分及含量可能不同，所以要⽤不同的酶。
酵母菌的细胞壁主要成分有葡聚糖、⽢露聚糖蛋⽩质、⼏丁质。
霉菌的细胞壁：主要成分是纤维素、⼏丁质、葡聚糖等。
藻类的细胞壁：主要成分有纤维素构成结构⾻架。
7.基因组、基因、密码⼦、简并、同义密码⼦的概念是什么？⼀、基因组1. 原核⽣物就是它的整个染⾊体，原核⽣物的基因组较⼩，DNA的含量低，如E.coli的DNA分⼦质量为2.4×109Da，相当于4.2×106bp，含有3000-4000个基因，SV40病毒仅5个基因。
现代工业微生物育种一、诱变育种诱变育种是通过使用物理或化学方法，如紫外线、X射线、化学诱变剂等，诱导微生物发生基因突变，从而产生具有新性状的菌株。
这种方法可以大幅度提高微生物的变异频率，为育种工作提供了丰富的材料。
二、基因工程育种基因工程育种是通过人工构建基因表达载体，将其导入到微生物中，从而实现基因的转移和表达。
这种方法可以定向地改造微生物的遗传物质，使其表达出所需的性状。
基因工程育种具有高度定向性和可预测性，是现代工业微生物育种的重要手段之一。
三、代谢工程育种代谢工程育种是通过改变微生物的代谢途径，提高其代谢产物的产量或改变代谢产物的性质，从而获得所需的菌株。
这种方法需要对微生物的代谢过程有深入的了解，并能够精确地调控其代谢网络。
代谢工程育种在现代工业微生物育种中具有重要的应用价值。
四、组合生物合成育种组合生物合成育种是通过构建多个基因的组合文库，并筛选出具有所需性状的菌株。
这种方法类似于基因工程育种，但具有更高的遗传复杂性，可以创造出更丰富的变异类型。
组合生物合成育种在现代工业微生物育种中已经成为一种重要的策略。
五、定向进化育种定向进化育种是一种模拟自然进化过程的育种方法。
它通过对大量随机突变体进行筛选和选择，以实现所需性状的定向进化和优化。
定向进化育种可以在短时间内获得高度适应特定条件的优良菌株，具有很高的应用价值。
六、菌种保藏与复壮菌种保藏与复壮是工业微生物育种的重要环节。
通过科学的保藏方法，可以保持菌种的活力和遗传稳定性；而复壮则是通过一定的手段使保藏的菌种恢复活力，以保证其用于生产的性能。
七、基因组编辑育种基因组编辑育种是利用基因编辑技术对微生物基因组进行精确的编辑和改造，以实现定向改良和创造新品种的目的。
目前常用的基因组编辑技术包括CRISPR-Cas9系统、ZFNs和TALENs等。
基因组编辑育种具有高度精确性和可控性，为现代工业微生物育种提供了强有力的工具。
1.工业微生物育种在发酵工业中的作用如何？其目的是什么？工业微生物育种建立在：（1）遗传和变异（微生物遗传学）的基础之上；（2）物理和化学诱变剂的发现和应用；（3）工业自动化（自动仪表装置和微机）。
工业微生物育种在发酵工业中占有重要地位，是决定该发酵产品能否具有工业化价值及发酵过程成败与否的关键。
2.工业微生物发展经历了哪几个阶段？1)自然选育阶段2)人工诱变选育阶段3)杂交育种阶段4)代谢控制育种阶段5)基因工程育种阶段3.工业微生物育种的核心指标有哪些？1)在遗传上必须是稳定的。
稳定性。
2)易于产生许多营养细胞、孢子或其它繁殖体。
3)必须是纯种，不应带有其他杂菌及噬菌体。
4)种子的生长必须旺盛、迅速。
5)产生所需要的产物时间短。
转化率。
6)比较容易分离提纯。
7)有自身保护机制，抵抗杂菌污染能力强。
8)能保持较长的良好经济性能。
产率。
9)菌株对诱变剂处理较敏感，从而可能选育出高产菌株。
10）在规定的时间内，菌株必须产生预期数量的目的产物，并保持相对地稳定。
4.革兰氏阳性和阴性菌的细胞壁结构有何差异？它们对溶菌酶和青霉素的敏感有何不同？5.缺壁细菌有哪些类型和异同？制备缺壁细菌主要有哪些途径？原生质体：G+菌经溶菌酶或青霉素处理；球状体：G-菌，残留部分细胞壁。
是研究遗传规律和进行原生质体育种的良好实验材料。
L型细菌：自发突变形成细胞壁缺陷菌株；6.原生质体制备时，为什么不同微生物要选择不同的酶？举例说明。
酶在原生质体制备中主要用来酶解细胞壁的，不同的微生物其细胞壁成分及含量可能不同，所以要用不同的酶。
酵母菌的细胞壁主要成分有葡聚糖、甘露聚糖蛋白质、几丁质。
霉菌的细胞壁：主要成分是纤维素、几丁质、葡聚糖等。
藻类的细胞壁：主要成分有纤维素构成结构骨架。
7.基因组、基因、密码子、简并、同义密码子的概念是什么？一、基因组1. 原核生物就是它的整个染色体，原核生物的基因组较小，DNA的含量低，如E.coli的DNA分子质量为2.4×109Da，相当于4.2×106bp，含有3000-4000个基因，SV40病毒仅5个基因。
2. 真核生物能够维持配子或配子体正常功能的最低数目的一套染色体，称为基因组。
分子大，达到5×108－1010bp。
重复序列是基因组结构的一个特点，原核生物少，真核生物多，真核生物DNA序列（1）单一序列：单拷贝；（2）轻度重复序列：2-10个拷贝；（3）中度重复序列：10-几百个拷贝；（4）高度重复序列：几百-几万个拷贝。
二、基因基因：是一个遗传信息单位，对应着一段编码多肽氨基酸顺序的不连续DNA片段。
基因家族：由一个基因通过基因重复而产生两个或更多的拷贝而构成的一组基因。
操纵子：乳糖操纵子多基因家族：简单多基因家族（每个重复单元含有单一的转录和非转录区），复杂多基因家族（每个重复单元含有多个不同的转录区和非转录区）。
中心法则：遗传信息以DNA→RNA→蛋白质这种方向进行传递；反转录病毒可以由RNA合成DNA。
基因的编码序列在DNA分子上是不连续的，为一系列DNA片段所隔开，编码序列称为外显子，把外显子割裂的DNA片段称为内含子。
拟基因：某些基因因DNA序列发生变化，在序列上与活性基因相似，但不具有功能、不能编码蛋白质。
转座子：能在同一细胞的不同染色体之间或者同一染色体的不同位点之间转移的一些DNA序列。
转座因子的转座会引起极性效应插入突变、缺失和倒位等多种遗传效应。
三、遗传密码密码子：mRNA上三个连续的核苷酸决定一个特定的氨基酸，这三个核苷酸称为密码子。
简并：几种密码子编码同一种氨基酸的现象。
同义密码子：对应于同一氨基酸的不同密码子。
基因组:个体或细胞所含的全套基因的总和。
在原核生物中为整个染色体。
基因:DNA 分子的一个片段。
密码子:mRNA 分子中以三个核苷酸为一组，决定一种氨基酸以及多肽链合成起始与终止的信号。
简并:两种或多种核苷酸三联体决定同一种氨基酸。
同义密码子:对应同一氨基酸的不同密码子。
8.起始密码子和终止密码子有哪些？起始密码子：AUG 终止密码子：UAA UAG UGAmRNA上的碱基顺序每3个碱基用解读框架划分开，可决定其所生成蛋白质的氨基酸顺序，为了使碱基顺序作为遗传信息能正确转译，通常需要从某个特定的位置开始转译。
这个起始点的密码子就叫做起始密码子。
起始密码子是定位翻译开始位置的信号标记。
AUG 少数细菌(属于原核生物)以GUG(缬氨酸)或UUG为起始密码子。
蛋白质翻译过程中终止肽链合成的信使核糖核酸(mRNA)的三联体碱基序列。
一般情况下为UAA、UAG和UGA，它们不编码氨基酸。
9.什么是可读框？密码子阅读的方向是沿着mRNA的什么方向进行？可读框是以起始密码子开始，在三联体读框的倍数后出现终止密码子之间的一段序列。
可读框有可能编码一条多肽链或一种蛋白质。
当没有已知蛋白质产物时，该区域被称为可读框,而当确知该可读框编码某一蛋白时，它就被称为编码区，即一个可读框是潜在的编码区。
很多情况下，可读框即指某个基因的编码序列。
自起始密码子到终止密码子之间的核苷酸三联体序列。
一般情况下，可读框即指某个基因的编码序列。
由起始子AUG(甲硫氨酸)开始，每三个为一个密码子翻译，直至遇到终止子。
10.基因突变的特征有哪些，请做简单解释。
1、突变的稀有性自然突变频率很低，细菌10-4～10-10，高等生物10-5～10-8，不同的生物，不同的基因其突变率相差较大。
2、突变的重演性和可逆性指同种生物的同一基因突变为相同的表型，可以在不同个体间重复出现。
3、突变的平行性即可发生回复突变，显性基因Ａ可以突变为隐性基因ａ，而隐性基因ａ也可以突变为显性基因Ａ，前者称为正向突变，后者称为回复突变。
4、突变的多方向性与复等位基因亲缘关系相近的物种由于遗传物质相近，而发生相似的基因突变，基因的突变可以向多个方向进行，一个基因Ａ可以突变为a1、a2、a3……an等而构成所谓的复等位基因。
这些复等位基因可以从野生型基因突变产生，也可以从其它任何一个突变基因突变产生。
5、突变的有害性和有利性突变大多数是有害的。
这是因为生物经长期的自然选择，产生了与外界环境相同协调的关系，这种关系一旦因突变而改变便可能干扰内部的生理生化过程，所以大部分突变对生物体是不利的。
少数的突变能促进和加强某些生命活力，所以是有利的突变。
例如作物抗病性，微生物的抗药性等，这些突变为生物进化提供了最有利的条件。
11.突变发生后，细胞内有哪些修复突变的机制？DNA结构被改变后：一种是DNA分子在复制过程中排除或克服修复系统的作用而成为突变体；另一种是经修复系统修补后恢复原有DNA分子结构，不能形成突变体。
微生物修复系统：光修复和暗修复（复制前修复和复制后修复）紫外线诱变作用：主要是使DNA单股链上的邻近两个嘧啶碱基结合形成嘧啶二聚体，DNA链的结构发生变形，失去碱基正常配对，DNA 复制、RNA转录都不能正常进行，成为一条有缺口的DNA链。
12.什么是表型延迟？怎样避免表型延迟现象？表型延迟：是指微生物通过自发突变或人工诱变而产生新的基因型个体所表现除了的遗传特性不能在当代出现，其表型的出现必须经过2代以上的复制。
（1）与诱变剂性质和细胞壁结构组成有关，有些诱变剂渗入细胞的速度相当慢。
（2）若突变发生在多核细胞中的某一个核，该细胞就成为杂核细胞了。
如果该核突变的基因是唯一控制突变表型的基因，那么突变是隐性的，只有几代繁殖分裂得到纯的核突变细胞，才能出现由该基因控制的突变表型。
（3）原有基因产物的影响原有基因产物在子细胞中的浓度随着繁殖逐步稀释到最低限度后，突变表型才显现。
13.诱变剂主要有哪三类？诱变剂：凡能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质。
（1）物理诱变剂，例如，电离辐射、紫外线、电磁波等（2）化学诱变剂，如药品、农药、食品添加剂、调味品、化妆品、洗涤剂、塑料、着色剂、（3）生物诱变剂，如真菌的代谢产物、病毒、寄生虫等。
（4）生物体内还有一些内源性诱变剂。
内源性诱变剂是在人体健康异常的情况下产生的，如遗传因素、内分泌紊乱等。
14.简述紫外线照射诱变育种的原理、方法和基本步骤。
1. 紫外线的诱变机制紫外线引起：DNA与蛋白质的交联；胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用；DNA链的断裂；嘧啶二聚体的形成（单链上相邻两个胸腺嘧啶之间或双链相对应的两个胸腺嘧啶之间）。
最有效波长为253.7 nm（2537Å），即260 nm的紫外线。
绝对剂量单位：erg/mm2相对剂量单位：用照射时间或杀菌率表示。
一般认为杀菌率在90%~99.9%时，诱变效果较好。
不同微生物所需杀菌时间15W功率的紫外灯管和固定距离为30cm的条件下照射微生物，要使杀菌率达到90％～99.9％的效果：芽孢菌约需10 min；照射短小芽孢杆菌的营养体来获得缺陷型需要1～3 min；一般微生物营养体照射3～5min；无芽孢菌和革兰氏阳性菌只需0.5～2 min。
紫外线诱变的步骤与方法：（1）出发菌株，把细菌斜面培养到对数期，霉菌或放线菌则培养到孢子刚成熟。
（2）前培养，营养丰富的培养基，同时加入抑制修复的物质（咖啡碱或异烟肼），达到最佳生理状态。
（3）制备菌悬液；（4）紫外线照射，暗室进行，或诱变后立即浸入冰水中1～2 h，低温抑制突变修复。
（5）后培养，根据延迟现象的原理，照射完毕的菌悬液加入到适合于正突变体繁殖的培养基，在适宜温度下培养1.5～2 h。
（6）稀释涂皿，后培养结束后，从中取一定量培养物，作不同稀释度，涂皿，并且以未经紫外线照射过的菌悬液作对照，培养后，挑取菌落，以待筛选。
15.化学诱变剂主要有哪四类？化学诱变剂：是一类能对DNA起作用、改变起结构、并引起遗传变异的化学物质。
包括：碱基类似物、烷化剂、移码突变剂以及其他种类等。
化学突变剂具有专一性，只对基因的某部位发生作用。
化学诱变剂的剂量主要决定于其浓度和处理时间。
剂量使用原则：以诱变效应大，而副反应小为原则。
注意：90％以上的化学诱变剂都是致癌物质或极毒药品。
使用时注意自身安全，并防止污染环境。
一、碱基类似物是一类和天然的嘌呤嘧啶等四种碱基分子结构相似的物质。
既能诱发正向突变，又能诱发回复突变。
二、烷化剂活性烷基易取代DNA分子中活泼的氢原子，从而改变DNA分子结构，引起突变。
三、脱氨基亚硝酸的诱变机制亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子，脱去碱基中的氨基变成酮基，改变碱基氨氢键的电位，引起转换而发生变异。
还可引起DNA两条单链之间交联。
四、移码诱变剂移码诱变剂与DNA相互结合引起碱基增添或缺失而造成突变。
五、羟化剂羟胺（HA）1. 羟胺的诱变机制：G:C→A:T2. 羟胺的处理方法六、金属盐类七、其他化学诱变剂1. 秋水仙碱：诱变辅助剂2. 抗生素: 链黑霉素、争光霉素、丝裂霉素、放线菌素、正定霉素、光辉霉素、阿霉素，诱变辅助剂。
