高效液相色谱的基础知识 PPT

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高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt

色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验色谱法原理色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ，低压汞灯。
② 可调波长： 190 ～ 800mm ，钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱石英窗光电倍增管
废液
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高效液相色谱HPLC简介.ppt

种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
2
操作过程图示
3
色谱分离的机理
分离是一个物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
4
项目进样方式流动相分离原理检测器
14
液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反；固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
15
液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
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色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2）和氰基团（CN）的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。
9
检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD）原理：监测溶液的电导率变化的检测器。特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。

《高效液相色谱仪》课件

《高效液相色谱仪》ppt课件
目录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分析复杂混合物中各组分的仪器，基于物质在固定相和流动相之间的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱和柱切换技术，提高了分离效率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微粒固定相和新型检测器，提高了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行检测，并将信号记录下来，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之间的分配平衡是实现物质分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与流动相中的溶解度差异导致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如范德华力、氢键等）影响组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。

高效液相色谱培训ppt

有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存防止有机相的挥发
选用适宜的容器
1．梯度洗脱的特点
（1）改善分离, 加快分析速度；（2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕量组分的检测；（3）增加峰容量；（4）强烈滞留的组分不容易残留在柱上, 保持柱性能长期良好；（5）下次分析时, 流动相需要一段平衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有差异, 可能会引起基线漂移
用无机盐配制的缓冲液。脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡气泡对测定的影响：
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用：低温下密封保存，一般不超过3天防止微生物生长
灯的保养：
在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。
样品池要保养
谢谢！
今天用的图片都为摄影协会王诏同学所拍摄
H20 with 0.1% TFA
50% ACN with 0.1% TFA
210.00
220.00
230.00
240.00
250.00 nm
260.00
270.00
280.00
290.00
溶剂混合的基线噪音
色谱条件
色谱柱： C18, 5 µm, 3.9x150mm at 35º C.
流动相： A: 0.1% TFA in Water. B: 0.1% TFA in Acetonitrile.
采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再生。

高效液相色谱法培训PPT课件

注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯度斜率，使各组分在合适的保留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分能够充分分离，同时避免过长的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度，确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测组分浓度在该范围内时，测定结果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性，确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控制图，包括平均值、标准差和控制限等指标。
VS
发展历程及应用领域

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高效液相色谱的基础知识
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高效液相色谱法的特点高效液相色谱法仪器工作原理高效液相色谱仪的维护高效液相色谱法仪的注意事项
4
5
高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70 年代初发展起来的一种新型分离分析技术。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面进行比较：
• 高压输液系统 • 进样系统 • 分离系统 • 检测系统
高效液相色谱仪工作原理
其工作过程如下：
高效液相色谱仪的维护泵的使用和维护
1.防止任何固体微粒进入泵体，输液泵的滤器应经常清洗或更换。 2.流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内。泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 3.泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。 4.流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作
高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法速度灵敏度高速高灵敏度经典液相色谱法极慢低
自动化
进料方式效率
高自动化
高压输液设备高效
低
重力加料低
如对氨基酸分离，用经典色谱法，需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。
高效液相色谱仪工作原理
CAP2000+粘度计使用说明书（下）
• • 样品应完全覆盖锥转子底部表面，并且溢出其边沿 1.0mm。 8. 等待约 1至 3分钟，使锥转子、加热板及样品的温度到达设置温度。
•
•
9. 设置运行时间及保持时间。
10. 若使用打印机，使仪器与打印机连机。
•
•
11. 按下 RUN键开始测量。
12. 读取及打印测量结果。
指示剂
甲基橙石蕊酚酞
酸碱指示剂变色范围
< 3.1 红 3.1 — 4.4橙色色 <5.0红色 5.0—8.0紫色
< 8.0 无 8.0—10.0浅红色色
> 4.4黄色
> 8蓝色 > 10红色
PH试纸的使用
用PH试纸测定溶液的PH值,一般先把一小块放在表面皿或玻璃片上，用沾有待测液的玻璃棒点试纸的中部，不能把试纸放在待测液中，也不能用水湿润再测定PH值。
5、不要高压冲洗柱子；
高效液相色谱仪的维护
流动相的脱气
HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。
紫外灯的保养
在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。
高效液相色谱仪的注意事项
一、流动相
流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水
酸碱液及缓冲液需经过滤后使用。
PH计------电位法
ห้องสมุดไป่ตู้
方法原理用pH计测定溶液pH时，常用玻璃电极为指示电极，甘汞电极为参比电极。当pH玻璃电极和甘汞电极插入溶液时，构成一电池反应，两者之间产生一个电位差，由于参比电极的电位是固定的，因而该电位差的大小决定于试液中的氢离子活度，氢离子活度的负对数即为pH，可在pH 计上直接读出pH值。
仪器及设备
pHSJ-3F计
操作步骤
1.待测液的制备 2.测量前校正：把电极插入缓冲溶液中，使标准溶液的pH值与仪器标度上的pH值相一致。然后移出电极，用水冲洗、滤纸吸干后插入另一标准缓冲溶液中，检查仪器的读数。最后移出电极、用水冲洗、滤纸吸干后待用。
操作步骤
• 3.测定：把玻璃电极的球泡浸入待测样品的下部悬浊液中，并轻微摇动，然后将饱和甘汞电极插在上部清液中，待读数稳定后，记录待测液 pH值。 • 4.测量中校正：每个样品测完后，立即用水冲洗电极，并用干滤纸将水吸干再测定下一个样品。在精确的测定中，每测定5～6个样品后，需要将饱和甘汞电极的顶端在饱和氯化钾溶液中浸泡一下，然后用pH标准缓冲溶液重新校正仪器。
二、样品
采用过滤或离心方法处理样品，确保中不含
固体颗粒。
高效液相色谱仪的注意事项三、操作过程
1、先以所用流动相冲洗系统一定时间。正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；
2、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护。
3、实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分
•
•
13. 提起手柄，取下锥转子，并且清洁干净。
14. 清洁加热板。
粘度计使用图解
1未接通电之前
2接通电源
3打开电源开关
4系统初始化
8设置运行参数
7加热完成
6压下转子加热
5初始化完成
粘度计使用图解
9放置样品
10压下转子
11放下护罩
12点击开始（RUN）键
16清洁加热板
15提起手柄
14读取数据
高效液相色谱仪的注意事项
柱的使用和维护
1、使用前注意适用范围，如pH值范围、不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
2、使用符合要求的流动相；
3、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％
甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。 4、注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。
13运行中
粘度计使用图解
17断开电源
18关机完成
19拔下插销
PH值的测定
PH的测定方法
•
测定溶液PH值的方法：
• （1）酸碱指示剂用于粗测溶液PH值范围；
• （2）PH试纸用以精略地测定溶液酸碱性的强弱；
• （3）PH计用以精确地测定溶液的PH值。
PH的测定
酸碱指示剂一般是弱的有机酸或弱的有机碱，它们的颜色变化是在一定的pH值范围内。我们把指示剂发生颜色变化的pH值范围叫做指示剂的变色范围。
钟以上，再用甲醇冲洗。冲洗过程中关闭D灯、W灯；
粘度计使用说明书
CAP2000+粘度计使用说明书（上）
1. 打开电源开关，若仪器已关闭电源有一段时间(如一个晚上)，应先预热30分钟 • • • • • • • 2. 装上锥转子。 3. 设置转子编号。 4. 设置温度 5. 设置转速 6. 压下手柄，使锥转子接近加热板，并且使手柄位于最低位置。等待约 10分钟，使锥转子与加样板温度接近。 7. 提起手柄，把样品加至加热板上，样品量请参考附录 A。轻轻地压下手柄，样品