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高效液相色谱（HPLC）基础知识我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：方法项目数量1985年版1990年版1995年版2000年版HPLC法鉴别9 34 150 检查12 40 160 含量测定7 60 117 387鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。
它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。
又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。
也称现代液相色谱。
二、HPLC的特点和优点HPLC有以下特点：高压——压力可达150~300 Kg/cm2。
色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。
高速——流速为0.1~10.0 ml/min。
第一章高效液相色谱仪的特点混合物最有效的分离、分析方法。
俄国植物学家茨维特在1906年分离叶绿素，色谱法是一种分离技术。
混合物分离过程：试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配。
一相固定不动，称为固定相。
另一相是携带试样混合物流过固定相的流体(气体或液体)，称为流动相。
特点：高压、高效、高速、高灵敏适合高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
与GC 互补性三、液相色谱组成：（一）、输液系统泵、进样阀、色谱柱、检测器、工作站（记录仪）（二）、附件过滤装置、脱气装置、柱温箱、收集装置等等。
（三）、工作程序：液体进入泵-压力传感器-脉动缓冲器-进样阀-色谱柱检测器（四）、泵体组成部分：电机、马达、双柱塞串联泵腔、缓冲器、压力传感器、面贴（五）、检测器组成部分：1、电器部分（变压器、氘灯板、系统电源伴、控制板、显示板、前置板、面贴）2、光学部分（氘灯、灯箱、光学盒、凹面镜、分光镜、小参比、单色器、流通池、前置板）（六）、HPLC的分类1、吸附色谱Adsorption Chromatography用固体吸附剂作固定相，以不同极性溶剂做流动相依据样品中各组分在吸附剂上吸附性能的差别来实现分离。
2、分配色谱Partition Chromatography用载带在固相基体上的固定液做固定相，以不同极溶剂作流动相。
依据样品中各组分在固定液上分配性能的差别来实现分离。
3、离子色谱Ion Chromatography用高效微粒离子交换剂作固定相，以具有一定PH值的缓冲液做流动相，依据离子型化合物中各离子组分与离子交换剂上表面带电荷基团进行可逆离子交换能力的差别来实现分离。
4、体积排阻色谱Size Exclusion Chromatography用化学惰性的多孔性凝胶做固定相，按固定相对样品中组分分子体积阻滞作用的差别来实现分离。
又分：a、Gel Filtration Chromatography（GFC）以水为流动相的体积排阻色谱b、Gel Permeation Chromatography（GPC）以有机溶剂为流动相的体积排阻色谱5、亲和色谱以在不同基体上，键合多种不同特性的特性的配位体做固定相用具有不同PH值的缓冲溶液作流动相，依据生物分子（氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核酸、核苷酸、酶等）与基体上键合的配位体之间存在的特异性亲和作用能力的差别而实现对具有生物活性的生物分子的分离。
高效液相色谱提纲色谱的基础知识第一章色谱分析法概述一、色谱分析法发展简介二、色谱法分类1、按两相状态分类2、按操作形式分类3、按分离原理分类三、HPLC与其他方法的比较1. 色谱法与精馏、萃取分离比较2. 色谱法与光谱、质谱分析方法比较3. 高效液相色谱与经典色谱的比较4. 液相色谱与气相色谱的比较四、色谱法特点五、现代色谱法应用领域六、有关色谱主要期刊与书籍第二章色谱分析法的理论基础一、色谱流出曲线二、色谱图中的基本术语三、分配平衡四、色谱法的基本理论五、色谱法基本分离方程第三章色谱定性分析和定量分析一、定性分析二、定量分析高效液相色谱的知识第四章高效液相色谱仪第五章色谱分离系统一、液相色谱分离原理及分类（一）分离原理（二）高效液相色谱法的主要类型二、高效液相色谱的固定相1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类2.高效液相色谱固定相按孔隙深度分类3. 高效液相色谱固定相以化学组成来分类三、流动相1.对流动相溶剂的要求：2. 流动相及流动相的极性3. 流动相的组成四、色谱柱1. 色谱柱的构型2. 色谱柱寿命第六章液固色谱法和液液色谱法一、液一固吸附色谱法(LSAC)1．分离原理 2.固定相 3.流动相二、液一液分配色谱法（LLPC）1．分离原理 2.固定相 3.流动相第七章化学键合相色谱法一、化学键合固定相二、反相键合相色谱法三、正相键合相色谱法四、离子性键合相色谱法第八章离子交换和离子色谱法一、离子交换色谱法1．离子交换色谱原理2．固定相3．流动相二、离子色谱法1.离子色谱法原理2.离子色谱具有以下优点3.离子色谱装置类型4.离子色谱的应用第九章体积排阻色谱法高效液相色谱同时测定食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、维生素C高效液相色谱同时测定药品中的苯甲酸与水杨酸样品处理、条件优化及应用第十章色谱分析样品处理一、样品的采集二、常用样品制备技术（一）溶剂萃取***1. 液-液萃取液-液萃取新技术——液相微萃取2. 液-固萃取3. 液-气萃取（溶液吸收）4. 萃取溶剂的选择（二）蒸馏1. 简单蒸馏2. 分馏3. 减压蒸馏4. 水蒸气蒸馏（三）固相萃取***1. 固相萃取的模式及原理2. 固相萃取的常用吸附剂3. 固相萃取的装置及操作程序4. 固相萃取技术的应用（四）膜分离（五）衍生化技术*（六）其它样品制备技术*1. 超临界流体萃取2. 微波萃取技术第十一章衍生化技术及浓缩柱一、衍生化技术（一）按衍生化反应分类1.衍生化反应满足条件2. 按衍生化反应类别分类（二）按衍生化的方式分类1. 柱前衍生2. 柱后衍生二、浓缩柱第十二章高效液相色谱分离条件的优化及建立分析方法的一般步骤一、高效液相色谱分离条件的优化（一）高效液相色谱中色谱参数的相关性1. 色谱参数的分类2. 色谱参数的相关性（二）色谱分离条件优化标准的选择1. 难分离物质对的峰对分离优化标准2. 整体色谱图的优化标准二、建立HPLC分析方法的一般步骤（一）样品的性质及柱分离模式的选择1. 样品的溶解度2. 样品的分子量范围3. 样品的分子结构和分析特性（二）分离操作条件的选择1. 容量因子和死时间的测量2. 色谱柱操作参数的选择3. 样品组分保留值和容量因子的选择4. 相邻组分的选择性系数和分离度的选择第十三章高效液相色谱法的实验技术和分析应用一、高效液相色谱法的实验技术1. 溶剂的纯化技术2. 色谱柱的装填技术3. 色谱柱的平衡、保护与清洗、再生技术二、HPLC法的分析应用第十四章液相制备色谱。
一、基本原理高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。
高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。
在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。
高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
二、高效液相色谱分析原理（1）、高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（2）、高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
高效液相试题及答案文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-高效液相色谱基础知识测试一、填空题1、我们公司所用的高效液相色谱仪的品牌是：安捷伦1260 。
高效气相色谱仪的型号是安捷伦 7890 。
2、高效液相色谱系统由恒温器、四元泵、进样器、色谱柱、检测器和分析系统组成。
3、本公司所用的高效液相，为防止压力过大导致柱内填料空间发生变化，影响分离效果。
一般采用C18（十八烷基硅烷键合硅胶）填料的色谱柱，最高工作压力为400 bar。
4、高效液相根据流动相与固定相极性分为：正相高效液相色谱和反相高效液相色谱。
5、开机步骤：接通电源，依次开启不间断电源、真空脱气机、四元泵、检测器，待泵和检测器自检结束后，打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。
6、高效液相的维护：最后一次进样完成后，应用流动相冲洗20分钟，以保证洗脱完全，若流动相中含有无机盐类，应用高纯水冲洗30分钟，。
7、进样器的保养：每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。
8、气相色谱仪常用的检测器有热导检测器，氢火焰检测器，电子捕获检测器和火焰光度检测器。
二、选择题1.在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（ D ）A.提高柱温B.降低板高C.降低流动相流速D.减小填料粒度2. 在高固定液含量色谱柱的情况下，为了使柱效能提高，可选用 ( A )A.适当提高柱温B.增加固定液含量C.增大载体颗粒直径D.增加柱长3. 在液相色谱中, 为了提高分离效率, 缩短分析时间, 应采用的装置是 ( B )A. 高压泵B. 梯度淋洗C. 贮液器D. 加温4. 在液相色谱中, 最通用型检测器是 ( A )A.示差折光检测器B.极谱检测器C.荧光检测器D.电化学检测器5. 在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是 ( A )A.直形填充柱B.毛细管柱C.Ｕ形柱D.螺旋形柱6. 实验室常用气相色谱仪的基本组成是（ B ）。
1 液相色谱基础知识1.1 液相色谱名词术语Mobile phase：流动相，在色谱柱中存在着相对运动的两相，一相为固定相，一相为流动相。
流动相是指在色谱过程中载带样品（组分）向前移动的那一相。
Stationary phase：固定相，柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相。
Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。
Detection wavelength：检测波长，retention time：保留时间，被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间Peak:峰Peak Base：峰基线，经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴Peak Height：峰高，色谱峰顶点至峰底的距离。
Peak Width：峰宽，色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离Peak Width at Half Height：半峰高宽Peak Area：峰面积Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰Ghost Peak: 假峰，并非由试样所产生的峰Baseline Drift:基线漂移Baseline Noise:基线噪音Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象. 1.2 流动相1.2.1 流动相类型正相液相色谱流动相：一般正相色谱固定相极性大于流动相极性，采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），极性小的组分先出柱。
反相液相色谱流动相：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
高效液相色谱法教案
一、课时安排
课时安排| 教学内容
1 | 液相色谱基础知识介绍
2 | 实验工艺要求及操作细节介绍
3 | 数据分析与结果评价
二、教学目标
1. 掌握高效液相色谱的原理及实验步骤；
2. 学会如何用高效液相色谱检测物质的实验方法；
3. 能够正确评价液相色谱的结果和数据分析；
4. 掌握液相色谱在实际生产中的应用。
三、教学内容
1. 高效液相色谱的原理及实验步骤：
介绍高效液相色谱的操作原理，建立色谱柱，确定检测射入方式，调节pH值，控制升温排量率，调节流速等步骤；
2. 实验工艺要求及操作细节介绍：
通过理论讲解及实际操作，让学生熟练掌握操作和实验注意事项；
3. 数据分析与结果评价：
通过给出的数据让学生灵活分析，结合实际情况，来判断实验的成果是否达到要求，进行正确评价。
四、活动组织
以理论讲解结合实实操作的方式，依次完成操作过程和检测结果，批改数据分析结果，综合实验结果判断实验成果。
此帖与GC版的对应，是为了让大家更好的学习和了解LC主要内容包括：1.高效液相色谱法（HPLC）的概述2. 高效液相色谱基础知识介绍（1——13楼）3. 高压液相色谱HPLC发展概况、特点与分类4. 液相色谱的适用性5.应用高效液相色谱法（HPLC）的概述以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。
由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用X围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）为最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
系统组成：（一）高压输液系统由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。
1.贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。
贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。
高效液相色谱基础知识测试一、填空题1、我们公司所用的高效液相色谱仪的品牌是：安捷伦1260 .高效气相色谱仪的型号是安捷伦7890 。
2、高效液相色谱系统由恒温器、四元泵、进样器、色谱柱、检测器和分析系统组成。
3、本公司所用的高效液相，为防止压力过大导致柱内填料空间发生变化,影响分离效果.一般采用C18（十八烷基硅烷键合硅胶）填料的色谱柱,最高工作压力为400 bar.4、高效液相根据流动相与固定相极性分为：正相高效液相色谱和反相高效液相色谱。
5、开机步骤：接通电源，依次开启不间断电源、真空脱气机、四元泵、检测器，待泵和检测器自检结束后,打开电脑显示器、主机，最后打开色谱工作站。
6、高效液相的维护：最后一次进样完成后，应用流动相冲洗20分钟，以保证洗脱完全，若流动相中含有无机盐类，应用高纯水冲洗30分钟,。
7、进样器的保养：每次分析结束后,要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。
8、气相色谱仪常用的检测器有热导检测器，氢火焰检测器，电子捕获检测器和火焰光度检测器。
二、选择题1.在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是( D ）A。
提高柱温B。
降低板高C。
降低流动相流速 D.减小填料粒度2。
在高固定液含量色谱柱的情况下，为了使柱效能提高，可选用( A ) A.适当提高柱温B。
增加固定液含量C。
增大载体颗粒直径D。
增加柱长3。
在液相色谱中，为了提高分离效率，缩短分析时间, 应采用的装置是（B )A. 高压泵B。
梯度淋洗C。
贮液器D。
加温4. 在液相色谱中，最通用型检测器是（A ）A.示差折光检测器B.极谱检测器C.荧光检测器D。
电化学检测器5。
在液相色谱中, 为了获得较高柱效能, 常用的色谱柱是( A ）A.直形填充柱B。
毛细管柱C。
Ｕ形柱D。
螺旋形柱6。
实验室常用气相色谱仪的基本组成是( B ）。
（1)光源;(2）气路系统;（3)单色器系统；(4)进样系统；(5)分离系统；(6)吸收系统；(7)电导池；（8)检测系统;（9）记录系统.A 1-3—6-8-9B 2—4-5-8—9C 2-4—5—7—9D 2-4—6—7—97.在气相色谱定性分析中，实验室之间可以通用的定性参数是（ D ）.A 调整保留时间B 校正保留时间C保留时间D相对保留值三、判断题:(正确—————√；错误-——-×）1. 确基线噪音和漂移是检测器稳定性的主要技术指标( √）2. 灵敏度是检测器的主要性能指标( √）3。
