实验六 酸性磷酸酶的显示

酸性磷酸酶的显示方法
酸性磷酸酶是一种酶类物质，它在人体细胞内起着重要的催化作用，并具有重要的调节作用。

因此，在许多疾病的诊断中，检测酸性磷酸酶的活性和浓度是非常重要的。

以下是关于酸性磷酸酶的显示方法的中文介绍。

常见的酸性磷酸酶显示方法包括酶活力测定、基础染色和免疫染色等。

这些方法可以通过不同的化学试剂和仪器设备来实现，从而得出酸性磷酸酶的活性和浓度。

2. 酶活力测定法
酶活力测定法是用于检测酸性磷酸酶活性的一种方法，其原理是通过一系列的化学反应来形成可测定的产物。

这种方法通常使用p-nitrophenyl phosphate（pNPP）作为酶活力测量底物，它可以转化为p-nitrophenol。

测量产生的p-nitrophenol的光密度可以用于计算样品中酸性磷酸酶的活性。

3. 基础染色法
基础染色法是通过将酸性磷酸酶活性产生的颜色染到细胞和组织切片上来显示酸性磷酸酶的分布和浓度。

这种方法使用基础染料如甲基绿、苏木精、尤红和新绿等来染色，然后通过显微镜观察染色后的细胞和组织切片来判断样品中是否含有酸性磷酸酶。

免疫染色法是通过使用抗体来检测酸性磷酸酶的存在和浓度的方法。

该方法使用细胞和组织切片，将其与具有特异性抗体的二抗结合，然后用荧光素或酶标记的标记剂来标记结合的二抗。

最终，通过荧光显微镜或酶标的方法来检测抗体与酸性磷酸酶的结合情况。

总结：。

实验九 酸性磷酸（酯）酶活性测定1．目的要求掌握酸性磷酸（酯）酶活性测定的原理和方法。

2．方法原理酸性磷酸（酯）酶是一种存在于生物体内水解有机磷酸酯键的酶。

以对硝基酚磷酸钠作为底物，在酸性磷酸酯酶的作用下，在碱性条件下水解生成黄色的对硝基酚，可用分光光度计进行比色测定。

它们在各类种子中普遍存在，且含量较多，在萌发前期，随着种子的萌发进程活性增加，通常酸性磷酸酶活性与种子活力呈正比。

3．主要实验仪器及材料干种子或吸胀种子、电子天平、分光光度计、恒温水浴箱、带塞刻度试管、小烧杯、研钵、塑料管、剪刀。

4．掌握要点掌握常用的测定酸性磷酸（酯）酶活性的方法——对硝基酚磷酸钠法。

5．实验内容（1）酶液提取。

称取1g 样品，用5mL 研磨缓冲液在研钵中冰浴研磨成浆，再用5mL 研磨缓冲液冲洗，转移至离心管中，在20000rpm 下离心10min 。

吸出上清液，即为酶粗提液。

可放在冰箱中储存备用。

（2）活力测定。

取酶液0.1—1mL （视酶含量多少而定），加水至1mL ，然后加入缓冲液1mL 和对硝基酚磷酸钠溶液0.1mL 。

空白对照用1mL 研磨缓冲液代替酶制剂。

充分混匀后，放在30℃恒温箱中保温10min ，时而摇动。

10min 后，加入1m0.5mol/LNaOH 溶液，充分混合，终止反应，并使对硝基酚呈黄色。

在400nm 波长下测吸光度A 。

（3）计算酶活性，以每毫克种子每分钟水解底物的nmol 数表示。

酶活性nmol/min.mg=）（）（试样的g W V V A ⨯⨯⨯min 1011.3019.0 式中0.019为pH=14时，对硝基酚的µmol 吸光系数，即对硝基酚的浓度为1mol/L 时，其A=0.019；3.1为0.0031×1000，反应混合液的体积为3.1，将µmol 化为nmol 乘上1000；V为酶制剂总体积；V1为每次用酶体积。

在实验中要保持酶制剂处于低温下以免酶活性下降，可在冰箱中提取和保存。

细胞生物学实验讲义河池学院化生系生物教研室2011年3月目录1.细胞生物学实验简介2.实验一细胞膜的通透性观察3.实验二植物细胞骨架的观察4.实验三线粒体的超活染色与观察5.实验四细胞融合6.实验五叶绿体的分离与观察7.实验六酸性磷酸酶的显示方法8．实验七联会复合体的染色与观察9．实验八死、活细胞鉴别10.附录：生物绘图法细胞生物学实验简介细胞生物学是当前生命科学中核心学科之一，也是重要的专业基础课，其理论与实验技术已广泛地用于研究细胞的形态结构、基因表达与克隆、病毒、细菌、胚胎发育、远缘杂交、人类疾病的发病机制、药物机理等领域，随着分子生物学的研究渗入，分子细胞生物学也得到了突飞猛进的发展。

目前许多综合大学、农业、医学及药科大学把细胞生物学作为本科生和研究生的必修课或基础理论课，同时也开设了专门的细胞生物学实验课，学生们通过实验，进一步地加深了对理论课的理解，也为今后的专业实验课和毕业论文实验奠定了基础。

本讲义精心选择了细胞生物学中的常规实验，作为教材面向本系生物专业本科生进行讲授。

实验一细胞膜的通透性观察一、实验目的1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。

2.了解溶血现象及其发生机制。

二、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。

它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。

各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。

渗透作用是细胞膜的主要功能之一。

将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。

将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。

因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。

本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。

植物组织中酸性磷酸酶与多酚氧化酶的组织定位一、实验目的（1）熟悉酸性磷酸酯酶与多酚氧化酶的功能；（2）掌握两种酶的组织定位方法及原理（3）观察酸性磷酸酯酶与多酚氧化酶在植物组织中的分布。

二、实验原理通常酸性磷酸酶在pH5.0左右发生作用，能分解磷酸酯而释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅沉淀物。

但因其是无色的，需再经过与硫化铵作用，形成棕黄到棕黑色的硫化铅沉淀，由此能显示酸性磷酸酶在细胞中的存在与分布；PO43-+Pb2-→ Pb3(PO4)2 ↓（沉淀）；Pb3(PO4)2+(NH4) 2S→PbS(棕黑色)↓邻苯二酚在多酚氧化酶的作用下生成褐色的邻苯二醌，通过显微镜观察褐色的部分即为多酚氧化酶在组织中的位置。

三、实验材料与实验试剂材料与仪器：玉米根，甘蓝叶，蒜苔，显微镜；冰箱；保温箱试剂：底物溶液；丙酮；0.5% (NH4) 2S溶液；PH 7.2 磷酸缓冲液；1%邻苯二酚。

四、实验步骤1、酸性磷酸酶（酯酶）的组织定位（1）取完整根系或叶片的表皮；（2）将材料放置在冰冻的丙酮中，固定15min之后用水冲洗1~2次；（3）将固定好的材料移入底物液中，37℃，反应1h；（4）将上述材料移入0.5%(NH4)2S中年浸泡1~2min;（5）将材料做成切片，在显微镜下观察，被染成黑色部位即多酚氧化酶作用的部位。

2、多酚氧化酶的组织定位（1）取完整根系或叶片的表皮；（2）滴一滴PH7.2的磷酸缓冲液，在冷藏室中放置5min;（3）将上述材料移入1%的邻苯二酚中，进行染色，37℃，保温30min；（4）将材料做成切片，在显微镜下观察，被染成棕色的部位即多酚氧化酶作用的部位。

五、实验结果六、注意事项1、实验过程中要用到许多有机毒性试剂，在操作时一定要注意通风；2、作用液中铅离子的浓度至关重要的，必须现配现用，当铅离子浓度过低时产生的磷酸离子不能被捕捉而引起弥散，并可进入细胞核内造成细胞核染色的假阳性，孵育时间过长也可发生酶扩散和核染色的现象。

酸性磷酸酶编辑本段酸性磷酸酶（ACP）(酶学检测)酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内。

在溶酶体膜稳定完整时，底物不易渗入，ACP活力微弱或无活性，经固定，在合适pH条件下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗透性，底物可以渗入，酶活力被显示。

ACP在酸性条件下（pH4.7）可使作用液中的底物β-甘油磷酸钠的磷酸根解离出来，进而与溶液中硝酸铅结合形成磷酸铅沉淀，因其是难溶解的无色沉淀物，需要与黄色的硫化铵作用，生成棕黑色PbS沉淀而被显示出来。

正常值King-Armstrong法117～467nmol·s-1／L Bodansky法0～1.1U Roy Brower和Hayden法0.11～0.50U／L (1.8～10.0nmol·s-1／L) 前列腺(RIA)法＜3.0μg／L临床意义增高：前列腺癌者常显著升高，故血清ＡＣＰ测定主要用于本病的辅助诊断。

甲亢、乳腺癌、溶血性贫血、骨硬化症亦可升高，但程度不及前列腺癌。

超敏反应（hypersensitivity ），即异常的、过高的免疫应答。

即机体与抗原性物质在一定条件下相互作用，产生致敏淋巴细胞或特异性抗体，如与再次进入的抗原结合，可导致机体生理功能紊乱和组织损害的免疫病理反应。

又称变态反应。

目录应原的性质、进入机体的途径、参与因素、发生机制和个体反应的部分肾小球肾炎，外源性哮喘等。

阿尔图斯反应是一种局部的Ⅲ型超敏反应。

在反复注射抗原（如狂犬病疫苗、胰岛素）后，局部可出现水肿、出血、坏死等炎症反应。

Ⅳ型超敏反应又称迟发性变态反应。

为细胞介导免疫的一种病理表现。

它是由T细胞介导的。

常见的类型是：化学药品（例如染料）与皮肤蛋白结合或改变其组成，成为抗原，能使T细胞致敏。

再次接触该抗原后，T 细胞便成为杀伤细胞或释放淋巴因子引起接触性皮炎。

另一个类型称为传染性变态反应，是由某些病原体作为抗原性刺激引起的，见于结核病、梅毒等。