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酸性磷酸酶的检测实验报告一．实验目的1.以Gomori铅法为例学习细胞化学方法检测水解酶的原理和方法。
2.掌握小鼠等实验动物腹腔巨噬细胞采集和制片的方法。
3.观察巨噬细胞内酸性磷酸酶的分布进一步了解溶酶体的结构和功能。
二．实验原理1.向小鼠腹腔内注射无菌淀粉肉汤，排异反应使小鼠产生大量巨噬细胞，且巨噬细胞吞噬淀粉肉汤后不会对细胞造成伤害，反而被“喂养”。
连续多天注射使小鼠腹腔内聚集大量巨噬细胞。
2.由于无法直接观察酸性磷酸酶的分布，可以通过检测酸性磷酸酶代谢产物的方法间接观察。
酸性磷酸酶催化反应。
再通过福尔马林-钙固定，再通过显色与染色过程。
在光镜油镜下可观察到黑色颗粒，也就是硫化铅沉淀，从而观测酸性磷酸酶在巨噬细胞中的分布。
三．实验材料及设备1.实验材料：a)连续三天向腹腔中注射1mL6%淀粉肉汤的小鼠一只b)酸性磷酸酶工作液，c)福尔马林-钙固定液d)2%硫化铵溶液e)0.1%沙黄染液2.实验设备：a)普通光学显微镜b)载玻片若干c)4摄氏度冷藏柜d)染色皿若干、吸水纸、滴管、剪刀、白瓷板等四．实验方法及步骤（一）实验组：1.巨噬细胞采集与附着a)配置6%淀粉肉汤，连续三天向小鼠腹腔内注射，注意不要伤害小鼠器官。
b)用脊髓脱臼法快速处死小鼠。
在白瓷板上用剪刀打开小鼠腹腔，用适量生理盐水冲洗小鼠内脏。
c)用胶头滴管吸取生理盐水冲洗液，滴于洁净的载玻片上，注意不要涂抹，每个载玻片各滴两滴，注意做好编号与正反标记。
d)将载玻片置于有U形玻璃支架的大型培养皿中。
培养皿在4摄氏度的冷藏柜中放置30min。
用吸水纸吸去多余生理盐水，注意不要让细胞完全干燥。
2.酶的反应将玻片置于37摄氏度的酸性磷酸酶工作液中，温浴30min。
生理盐水小心冲洗，吸去多余水分。
3.细胞的固定将玻片置于福尔马林-钙固定液的染缸中，固定5min。
蒸馏水冲洗，吸去多余水分。
4.显色a)2%硫化铵溶液中处理3~5min，取出载玻片，用蒸馏水漂洗。
巨噬细胞功能检测讲解学习巨噬细胞功能检测单核－巨噬细胞吞噬功能测定单核－巨噬细胞在机体免疫反应中起着重要作用，因此，检测单核－巨噬细胞功能对于了解机体的免疫功能状态具有重要意义。
小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体外法）1、原理巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。
2、方法(1)．小鼠巨噬细胞制备实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1 ml。
实验时眼球放血、断椎处死小鼠，碘酒、洒精消毒皮肤，剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意避开血管)用生理盐水(或1640)灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清，沉积细胞用生理盐水(或1640)洗二次，离心转速、时间同上。
最后沉积细胞用含10％小牛血清1640配成适当浓度备用(1~2×106／ml)。
(2)被吞噬物的制备1）．鸡红细胞制备从鸡翼下抽取静脉血，加入5倍量Alsever液(2.05 g葡萄糖，0.42 g NaCl，0.8 g枸橼酸钠5H2O、0.55 g枸椽酸，加双蒸水到100 ml，加热溶解后过滤分装，8磅高压灭菌，4℃保存)，置4℃可以保存1个月。
用前取适量鸡红细胞悬液，用PBS洗涤二次后配成1％的浓度备用。
2）．白色念珠菌制备将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min 灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。
3、操作取巨噬细胞0.5 ml加1％鸡红细胞或l×l08／ml白色念珠菌悬液0.5ml，置37℃温育30min。
取2滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数，或离心1000r／min,10min，取细胞沉淀混悬液制成涂片，甲醇固定，姬姆萨染色、油镜观察计数。
实验八巨噬细胞吞噬现象的观察
一、实验原理
巨噬细胞由骨髓干细胞分化生成, 然后进入血液到达各组织内, 并进一步分化为各种巨噬细胞, 当病原微生物或其它异物侵入机体时, 能招引巨噬细胞, 而巨噬细胞又有趋化性, 能响应招引因子的招引, 产生活跃的变形运动, 主动向病原体和异物移行, 在接触到病原体和异物时, 即伸出伪足, 将之包围并内吞入胞质, 形成吞噬体, 继而细胞质中的初级溶酶体与吞噬泡发生融合, 形成吞噬性溶酶体, 通过其中水解酶等作用下, 将病原体杀死, 消化分解, 最后将不能消化的残渣排了出细胞外。
台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂, 台盼蓝染料进入细胞, 细胞变蓝, 即为坏死。
如果细胞膜完整, 细胞不为台盼蓝染色, 则为正常细胞或凋亡细胞。
此方法对反映细胞膜的完整性, 区别坏死细胞有一定的帮助。
二、实验步骤
1. 在小鼠腹腔注射6%淀粉肉汤（含台盼蓝）1ml。
2．24h后注射1%鸡红细胞悬液1ml, 轻按腹部使分散。
3. 20分钟后脱颈骨处死小鼠。
4. 开腹取腹腔液（慎防小鼠血污染）。
5．腹腔液滴于载玻片上, 盖上盖玻片。
6. 显微镜观察吞噬现象。
三、实验结果
四. 结果讨论。
巨噬细胞功能检测单核－巨噬细胞吞噬功能测定单核－巨噬细胞在机体免疫反应中起着重要作用，因此，检测单核－巨噬细胞功能对于了解机体的免疫功能状态具有重要意义。
小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体外法）1、原理巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物(鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等)共同温育，染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。
2、方法(1)．小鼠巨噬细胞制备实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1 ml。
实验时眼球放血、断椎处死小鼠，碘酒、洒精消毒皮肤，剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口(注意避开血管)用生理盐水(或1640)灌注腹腔，收集腹腔液于试管中(约4 ml)，1500 r/min，离心10 min，去上清，沉积细胞用生理盐水(或1640)洗二次，离心转速、时间同上。
最后沉积细胞用含10％小牛血清1640配成适当浓度备用(1~2×106／ml)。
(2)被吞噬物的制备1）．鸡红细胞制备从鸡翼下抽取静脉血，加入5倍量Alsever液(2.05 g葡萄糖，0.42 g NaCl，0.8 g枸橼酸钠5H2O、0.55 g枸椽酸，加双蒸水到100 ml，加热溶解后过滤分装，8磅高压灭菌，4℃保存)，置4℃可以保存1个月。
用前取适量鸡红细胞悬液，用PBS洗涤二次后配成1％的浓度备用。
2）．白色念珠菌制备将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌，用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活，离心去掉上清，再用1％美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml菌悬液，4℃冰箱保存备用。
3、操作取巨噬细胞0.5 ml加1％鸡红细胞或l×l08／ml白色念珠菌悬液0.5ml，置37℃温育30min。
取2滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数，或离心1000r／min,10min，取细胞沉淀混悬液制成涂片，甲醇固定，姬姆萨染色、油镜观察计数。
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实验三 酸性磷酸酶的显示方法
一、实验原理
酸性磷酸酶分解磷酸脂而释放出磷酸基。
在PH5.0的环境中，磷酸基与铅盐反应形成磷酸铅。
但磷酸铅是无色的，所以再与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
二、实验步骤
1.取洋葱内表皮（1cm ×0.6cm 每瓶放3片）沉于10%中性富尔马林液中，4℃下
固定30分钟，（置冰箱贮藏室），对照实验置50℃烘箱中。
（加液至青霉素瓶1/3体积）
2.去福尔马林液，自来水漂洗5分钟。
（青霉素瓶水加满，换3次）
3.去水，加酸性磷酶作用液，室温下置30分钟。
（加液至青霉素瓶1/3体积）
4.去作用液，自来水漂洗10分钟。
（青霉素瓶水加满，换3次）
5.去水，加1%硫化铵处理3-5分钟。
（加液至青霉素瓶1/3体积）
6.去硫化铵，加水漂洗。
（青霉素瓶水加满，换1次）
7.置载玻片上，加盖玻片。
8.显微镜观察（注意液泡中标黑色的小颗粒，表示有酸性磷酸酶的活力）。
三、实验结果（画酸性磷酸酶在细胞中的分布图）
四、结果讨论。
实验八-酸性磷酸酯酶活力的测定实验目的通过对酶促反应速度的测定，计算出酶的活力，掌握可见分光光度计的使用。
实验原理酸性磷酸酯酶（Acid Phosphatase，E．C．3．1．3．2．）存在于植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽的酸性磷酸酯酶为材料，磷酸苯二钠为底物。
磷酸苯二钠经过酸性磷酸酯酶作用，水解后生成酚和无机磷，其反应式如下：：由上式可见，当有足量的底物磷酸苯二钠存在时，酸性磷酸酯酶的活力越高，所生成的产物酚和无机磷也越多。
根据酶活力单位的定义，在酶促反应的最适条件下每min生成1微摩尔（μmol）产物所需要的酶量为一个活力单位，因此可用Folin-酚法测定产物酚或用定磷法测定无机磷来表示酸性磷酸酯酶的活力。
本实验所采用的是Folin-酚法。
实验操作检查试管内是否干燥、洁净；若否，将其洗净并置于干燥箱内120℃烘干。
1.标准曲线的制作取试管6支，按0到5的顺序逐管编号，空白为0号。
按照表8-3-1，向各试管中依次加入0.4mmol/L酚标准应用液、0.2mol/L的pH5.6的乙酸盐缓冲液、1mol/L碳酸钠溶液和Folin-酚试剂，注意加样顺序不得搞错，否则显不了色。
摇匀，在35℃保温10min以上（先用烧杯盛35℃的水，置于水浴锅中，再将试管放入烧杯中保温，以防试管滑落入水中），参见实验八（2）的图8-2-4。
以0号试管为空白，在可见光分光光度计上680nm波长处读取各管的吸光度A680，以A680为横坐标、酚标准应用液的mL数为纵坐标作一条标准曲线，它应该是一条直线。
保留该数据，以便实验八（4）直接引用。
以上操作总结为表8-3-1。
表8-3-1标准曲线的制作试管123450.4mmol/L酚标准应用液（mL）0.10.20.30.40.50.2mol/L的pH5.6的乙酸盐缓冲液（mL）0.90.80.70.60.511mol/L碳酸钠溶液（mL）5Folin-酚试剂（mL）0.5摇匀，在35℃保温显色10min以上A680图8-3-7酶促反应加热操作2.酶活力的测定取2支试管，编号1＇、0＇，将0＇号试管作为空白。
实验5 巨噬细胞酸性磷酸酶的显示姓名：李思露学号：131140040一、实验目的以小鼠腹腔巨噬细胞为材料，通过显示其溶酶体代表酶—酸性磷酸酶，学习酶细胞化学的一般原理及方法。
二、实验原理酸性磷酸酶是动物吞噬细胞溶酶体的标志性酶。
其能分解磷酸脂（常用β-甘油磷酸钠）而释放出磷酸基。
在pH5.0的环境中，磷酸基能与铅盐（硝酸铅，捕捉剂）反应形成无色的磷酸铅（微细沉淀，可在电镜下观察），再经过与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀（可在光镜下观察），以此显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。
三、实验材料、试剂及用品（一）材料小白鼠：6~8周龄小白鼠。
处理1：小鼠实验前2天，腹腔注射4%淀粉肉汤1 mL诱导及活化巨噬细胞；处理2：小鼠实验前2天，腹腔注射生理盐水1 mL。
（二）试剂（1）4％淀粉肉汤：牛肉膏0.3g,蛋白胨1.0g，氯化钠0.5g，可溶性淀粉4g，蒸馏水100mL，高压蒸汽灭菌20min，保存于4℃冰箱。
（2）10％中性福尔马林（pH6.8~7.1）。
（3）酸性磷酸酶作用液（现配）：蒸馏水90mL，0.2mol/L乙酸缓冲液（pH4.6）12mL,5%硝酸铅2mL,3.2%β-甘油磷酸钠4mL。
配法：先将蒸馏水和乙酸缓冲液混合，随后成分大致相等的2份，向其中一份加硝酸铅溶液混匀，向另一份加β-甘油磷酸钠溶液混匀；然后将其中一份溶液缓缓加入另一份溶液中，且边加边用玻璃棒搅拌。
用乙酸调pH为4.8~5.0。
注意：配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀；最好在临用前配制，不能储存。
（4）1％硫化铵溶液。
（三）用品水浴箱（50℃，37℃）、低温冰箱、普通光学显微镜、小剪刀、5mL一次性注射器、10mL玻璃离心管、试管架、胶头滴管、载玻片染色盒（缸）、5片装玻璃染色缸、载玻片。
四、实验操作1.巨噬细胞：腹腔注射生理盐水2mL，3min后抽取腹腔液。
2.细胞黏附及酶灭活：每人3片，标示1、2、3。
在1和2中央位置滴加处理1小鼠腹腔液2~3滴，在3中央位置滴加处理2小鼠腹腔液2~3滴；将1和3置4℃冰箱黏附30min，将2置湿盒（铺有数层湿纱布的不锈钢饭盒）内，50℃水浴或恒温箱30min，灭活酸性磷酸酶。
实验十五酸性磷酸酶的显示
【实验目的】
了解Gomori硝酸铅改良法显示细胞内酸性磷酸酶的方法和原理
【实验用品】
一、材料 427细胞
一、器材温箱、冰箱、显微镜、乳头吸管
三、试剂冷丙酮或95％乙醇，Gomori硝酸铅作用液，2％甲基绿、1％硫化铵
【实验内容】
一、原理
酸性磷酸酶广泛存在于各种动物组织细胞，以前列腺、肝及脾含量最丰富。
酸性磷酸酶在组织的退变过程中活性增强。
在大部分组织中，它主要存在于溶酶体内，在溶酶体膜稳定完整时底物不易渗入溶酶体中，溶酶体内的酸性磷酸酶活力微弱或无活性。
细胞经固定后，在合适的pH条件下，膜变得不稳定而改变其透性，底物渗透入溶酶体中，酶显现活力。
故在研究溶酶体异常时有意义。
Gomori硝酸铅改良法是根据：以磷酸酯为底物，其被磷酸酶水解后释放出磷酸基，在pH5左右和铅盐结合成磷酸铅盐，但磷酸铅无色，须经硫化铵作用使其变成棕黄色至棕黑色的硫化铅沉淀。
二、方法
1．将培养的427细胞在冷丙酮或95％乙醇中固定15～30分钟。
2．待片干燥。
3．移入已预热(37℃)的作用液中孵育2小时。
4．蒸馏水洗。
5．移入2％醋酸酸化1分钟，蒸馏水快速漂洗。
6．移入l％硫化铵1分钟，自来水漂洗数次。
7．必要时用甲基绿复染。
三、结果观察
酸性磷酸酶活性结构呈棕黄色至棕黑色。
