实验三+酸性磷酸酶的组织器官定位

酸性磷酸酯酶的组织定位一、目的1.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作步骤;2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。

二、原理酸性磷酸酯酶(Acid Phosphatase)存在于植物的种籽、霉菌、肝脏和人体的前列腺之中，能专一性地水解磷酸单酯键。

PO43-+Pb(NO3)2 -----Pb3(PO4)2↓（沉淀）Pb3(PO4)2+(NH4)2S----PbS ↓(棕黑色)三、实验材料、试剂和仪器1、材料新鲜蒜苔，新鲜青菜的全根系组织；2、试剂磷酸缓冲液PH=7.2，丙酮，底物溶液，(NH4)2S试剂，邻苯二酚，蒸馏水等3、仪器和用具恒温水箱、显微镜、烧杯、大小培养皿、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸等等。

四、实验方法与步骤1、新鲜蒜苔的酸性磷酸酶组织定位：A. 徒手切片蒜苔（使切片尽量薄而透明），将切片放入装有干净蒸馏水的培养皿中备用；B. 挑选适宜的蒜苔切片，将其放入4℃的丙酮中，固定15 min后用蒸馏水清晰切片1-2次；C. 将洗好的切片移入装有底物溶液的试管中，在37℃下水浴1h；D. 水浴完成后，将切片用蒸馏水洗3次，加入0.5%的(NH4)2S溶液，放置1-2 min后，再次用水将切片洗净；E. 将切片转移至载玻片上后，进行镜检。

2、新鲜青菜根系的酸性磷酸酶组织定位：A. 将完整的青菜根系用蒸馏水清洗干净，放入装有PBS（磷酸缓冲液，PH=7.2）的烧杯中，在室温下放置5 min；B. 将根系放入1%的邻苯二酚液中，在37℃下水浴1h-2h;C. 水浴过后将根系取出，观察并拍照。

五、实验结果与分析1、新鲜蒜苔的酸性磷酸酶组织定位：■将蒜苔进行徒手切片：■将切片放入底物溶液中进行水浴：■在10×的放大倍数下对切片进行观察：在视野中很明显有棕黑色的地方，说明蒜苔切片中酸性磷酸酶的主要分布区即为如图所示的棕色部分。

■在40×的放大倍数下对切片进行观察：观察到在蒜苔细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。

报告成绩实时记录成绩实验三细胞吞噬和酸性磷酸酶染色（Gomori氏法）学生姓名学号班级座位号：同组同学日期： 2014 年 10 月 21 日备注：【Introduction】（1）细胞吞噬在生命活动中的作用和意义：吞噬细胞可以抵御外来物质的入侵，也能发挥特异性免疫的作用。

单细胞动物通过细胞吞噬作用摄取营养物质；高等动物通过巨噬细胞的吞噬作用防御微生物的侵入，消除衰老和死亡的细胞。

（2）溶酶体的概念和生理作用：溶酶体是普遍存在于所有动物细胞（哺乳动物的成熟红细胞除外）中的细胞器。

主要功能有：消化营养保护作用、对细胞内吞物质的消化、对细胞自身物质的消化、参与机体组织器官的变态和退化、参与受精作用、参与激素的合成和浓度调节。

（3）酶细胞化学实验技术的原理及其实验注意点：酶细胞化学是利用细胞内酶具有催化某种反应的特性来检测酶活性。

在一定条件下酶进行催化产生可见的沉淀物，最后被光镜或电镜识别，以此来研究酶的定位及活性变化。

在实验时，要注意实验的温度、pH值、固定剂、抑制剂或激活剂、底物浓度、作用时间、避免扩散，使细胞的形态结构保存良好，并保持酶的活性。

【Materials&methods】实验仪器：复式双筒显微镜（带油镜）；Motic数码互动系统；擦镜纸/盖玻片；载玻片/镊子；记号笔；小片滤纸；移液器/吸头；香柏油/二甲苯；高速离心机2台；温箱1台（30℃）；水浴锅2台（37℃）；烘箱1台（100℃）。

实验材料：四膜虫培养液（500μl）；0.1%油烟墨汁（500μl）；2%豆奶液（200μl）。

实验试剂：10%甲醛溶液；酸性磷酸酶作用液；0.2%硫化铵水溶液（现用现配）；蒸馏水；亮绿。

实验操作：1．ACP染色：（1）吞噬：吸取200μl四膜虫培养液加入豆奶中→离心→快速弃去上清液。

（2）制片：吸取10μl悬浮液滴在载玻片上→设置对照组→干燥→在甲醛中固定→蒸馏水浸洗。

（3）反应：空白对照在100度烤箱中干烤→所有标本放入酶作用液→实验组37度水浴10分钟，对照组采用其他温度→反应完毕在自来水中浸泡。

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实验三 酸性磷酸酶的显示方法
一、实验原理
酸性磷酸酶分解磷酸脂而释放出磷酸基。

在PH5.0的环境中，磷酸基与铅盐反应形成磷酸铅。

但磷酸铅是无色的，所以再与硫化铵作用，形成棕黑色的硫化铅沉淀，由此就能显示酸性磷酸酶在细胞内的存在与分布。

二、实验步骤
1.取洋葱内表皮（1cm ×0.6cm 每瓶放3片）沉于10%中性富尔马林液中，4℃下
固定30分钟，（置冰箱贮藏室），对照实验置50℃烘箱中。

（加液至青霉素瓶1/3体积）
2.去福尔马林液，自来水漂洗5分钟。

（青霉素瓶水加满，换3次）
3.去水，加酸性磷酶作用液，室温下置30分钟。

（加液至青霉素瓶1/3体积）
4.去作用液，自来水漂洗10分钟。

（青霉素瓶水加满，换3次）
5.去水，加1%硫化铵处理3-5分钟。

（加液至青霉素瓶1/3体积）
6.去硫化铵，加水漂洗。

（青霉素瓶水加满，换1次）
7.置载玻片上，加盖玻片。

8.显微镜观察（注意液泡中标黑色的小颗粒，表示有酸性磷酸酶的活力）。

三、实验结果（画酸性磷酸酶在细胞中的分布图）
四、结果讨论。

酸性磷酸酯酶的组织定位一、目的1.了解并掌握酸性磷酸酶定位的原理及操作步骤;2.观察酸性磷酸酶在细胞中的分布。

二、原理酸性磷酸酯酶(Acid Phosphatase)是能专一性地水解磷酸单酯键。

PO43-+Pb(NO3)2 -----Pb3(PO4)2↓（沉淀）Pb3(PO4)2+(NH4)2S----PbS ↓(棕黑色)三、实验材料、试剂和仪器1、材料新鲜蒜苔，新鲜青菜的全根系组织；2、试剂底物溶液：0.1mol/l磷酸缓冲液（PH=5.1），10mlPb(NO3)2，30ml2%甘油磷酸钠丙酮，60mlH2O 。

(NH4)2S试剂，丙酮，蒸馏水等。

3、仪器和用具恒温箱、显微镜、大小培养皿、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸、胶头滴管等。

四、实验方法与步骤1、新鲜蒜苔的酸性磷酸酶组织定位：A. 徒手切片蒜苔（使切片尽量薄而透明），将切片放入装有干净蒸馏水的培养皿中备用；B. 挑选适宜的蒜苔切片，将其放入4℃的丙酮中，固定15 min后用蒸馏水清晰切片1-2次；C. 将洗好的切片移入装有底物溶液中，在37℃恒温箱中保温1h；D. 完成后，将切片用蒸馏水洗3次，加入0.5%的(NH4)2S溶液，放置1-2 min后，再次用水将切片洗净；E. 盖上盖玻片，进行镜检。

五、实验结果与分析新鲜蒜苔的酸性磷酸酶组织定位：■在40×的放大倍数下对切片进行观察：观察到在蒜苔细胞的细胞质中，出现许多棕色或棕黑色的颗粒和斑块。

部分细胞内，如筛管细胞中（图中颜色最深的部分）酸性磷酸酶极为丰富。

筛管、导管周围的薄壁细胞区域也呈棕色。

实验一 酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定[原理]酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。

它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。

酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。

它能专一性水解磷酸单酯键。

本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。

以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸。

在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于405nm 处光吸收强烈，而底物没有这种特性。

利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。

即测定单位时间内405nm 处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性。

酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol 产物所需的酶量。

要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。

可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。

本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。

从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。

随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。

要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。

求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。

[试剂和器材] 1、试剂：（1）酸性磷酸酯酶原酶液取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g ，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加0.2mol/L 乙酸盐缓冲液4mL ，置冰箱6小时以上。

将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液3 000r/min 离心15min ，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h 以上。

将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽茎克数相等，以3 000r/min 离心30min ，所得的上清液即为原酶液，置冰箱待用。

植物组织中酸性磷酸酶与多酚氧化酶的组织定位一、实验目的（1）熟悉酸性磷酸酯酶与多酚氧化酶的功能；（2）掌握两种酶的组织定位方法及原理（3）观察酸性磷酸酯酶与多酚氧化酶在植物组织中的分布。

二、实验原理通常酸性磷酸酶在pH5.0左右发生作用，能分解磷酸酯而释放出磷酸基，磷酸基能与铅盐反应形成磷酸铅沉淀物。

但因其是无色的，需再经过与硫化铵作用，形成棕黄到棕黑色的硫化铅沉淀，由此能显示酸性磷酸酶在细胞中的存在与分布；PO43-+Pb2-→ Pb3(PO4)2 ↓（沉淀）；Pb3(PO4)2+(NH4) 2S→PbS(棕黑色)↓邻苯二酚在多酚氧化酶的作用下生成褐色的邻苯二醌，通过显微镜观察褐色的部分即为多酚氧化酶在组织中的位置。

三、实验材料与实验试剂材料与仪器：玉米根，甘蓝叶，蒜苔，显微镜；冰箱；保温箱试剂：底物溶液；丙酮；0.5% (NH4) 2S溶液；PH 7.2 磷酸缓冲液；1%邻苯二酚。

四、实验步骤1、酸性磷酸酶（酯酶）的组织定位（1）取完整根系或叶片的表皮；（2）将材料放置在冰冻的丙酮中，固定15min之后用水冲洗1~2次；（3）将固定好的材料移入底物液中，37℃，反应1h；（4）将上述材料移入0.5%(NH4)2S中年浸泡1~2min;（5）将材料做成切片，在显微镜下观察，被染成黑色部位即多酚氧化酶作用的部位。

2、多酚氧化酶的组织定位（1）取完整根系或叶片的表皮；（2）滴一滴PH7.2的磷酸缓冲液，在冷藏室中放置5min;（3）将上述材料移入1%的邻苯二酚中，进行染色，37℃，保温30min；（4）将材料做成切片，在显微镜下观察，被染成棕色的部位即多酚氧化酶作用的部位。

五、实验结果六、注意事项1、实验过程中要用到许多有机毒性试剂，在操作时一定要注意通风；2、作用液中铅离子的浓度至关重要的，必须现配现用，当铅离子浓度过低时产生的磷酸离子不能被捕捉而引起弥散，并可进入细胞核内造成细胞核染色的假阳性，孵育时间过长也可发生酶扩散和核染色的现象。

酸性磷酸酶的组织定位学院：植物保护学号：2019050226 姓名：薛雨欣指导老师：曹翠玲时间：2019.10.151 引言植物根可向根际分泌许多有机化合物, 其中有许多物质都能促进植物对矿质养分的吸收.作为必需大量营养元素的P, 在土壤中以无机磷酸盐阴离子的形式被吸收, 而有机磷酸酯必须被水解成无机 P 后才能进入植物根, 在这一过程中有一非常重要的步骤, 就是由微生物、菌根外真菌和植物根分泌酸性磷酸酶。

诱导并分泌酸性磷酸酶是植物应对低磷环境的重要适应性反应之一。

酸性磷酸酶可以从不同的有机磷底物上水解磷酸基团，供植物吸收利用。

大多数的植物酸性磷酸酶没有明显的底物特异性，可以水解的底物包括 RNA、DNA、3-磷酸甘油酸、磷酸己糖等。

体外实验中，从拟南芥、番茄中纯化的酸性磷酸酶的酶活力都受到了缓冲液中高 Pi 浓度的抑制，进一步研究发现酸性磷酸酶水解产生的 Pi 可以负反馈抑制大多数酸性磷酸酶的活性。

磷饥饿条件下, 植物被诱导分泌酸性磷酸酶;另一方面, 植物根系分泌酸性磷酸酶活性的增加又能够水解释放土壤中的有机磷化合物供植物生长。

在植物体内, 酸性磷酸酶主要累积在液泡中, 大量研究表明, 酸性磷酸酶在调控植物磷营养方面有着非常重要的作用, 它在有机磷的代谢及再利用过程中也起着十分重要的作用, 其活性直接影响着有机磷有效性的高低。

在植物体内, 酸性磷酸酶对有机磷的再利用主要通过 2 个功能来实现:1)将植物体内的有机磷转化为无机磷;2)将植株中的磷从衰老组织转运到幼嫩组织。

梁宏玲的研究表明, 低磷胁迫下, 磷高效品种97081 体内酸性磷酸酶活性高于磷低效品种97009 , 低磷条件下97081 各部位酸性磷酸酶活性比97009 相应部位增加的幅度大, 植物体内磷素的分组结果也是97081 的相应部位的可溶性磷占总磷的比例高于97009 , 说明97081 在低磷条件下, 酸性磷酸酶受到强烈的诱导, 其活性大幅度增加。