H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体的制备及鉴定

专利名称：抗H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体及其用途专利类型：发明专利
发明人：郭巍,相文华,才琳,赵立平,闫妍,黄文强
申请号：CN201010139024.7
申请日：20100318
公开号：CN101892200A
公开日：
20101124
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了抗H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体及其用途。

本发明分泌抗H3N8亚型马流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株的微生物保藏号是CGMCC No.3543。

通过EL1SA和Western-blot方法鉴定证明：本发明单克隆抗体与马传染性贫血病毒、马动脉炎病毒、正常鸡胚尿囊液均无交叉反应，本发明H3N8/10的腹水ELISA效价为1∶1.6×10。

本发明抗H3N8亚型的单克隆抗体可应用于马A型流感病毒的抗原性分析、血清学诊断、疫苗质量监测及流行病学调查等方面。

申请人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
地址：150001 黑龙江省哈尔滨市南岗区马端街427号
国籍：CN
代理机构：北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司
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广西1株H3N8型马流感病毒的分离与鉴定付薇1，易春华2，徐贤坤1，孙翔翔2，何奇松2，蒋家霞2，马琳1，黄胜斌1，熊毅1*（1．广西动物疫病预防控制中心，广西南宁530001；2．广西大学动物科学技术学院，广西南宁530005）摘要：对具有流感临床症状的病马组织经处理后接种SPF鸡胚，分离到1株流感病毒。

该病毒经鸡胚接种7代后，出现稳定的对鸡红细胞凝集效价，效价为25，能被H3亚型血清中和，与H1、H5、H7、H9亚型阳性血清无交叉反应；对HA基因及NA基因进行序列分析，结果显示：HA基因与马流感病毒H3亚型同源性最高，NA基因与马流感病毒N8亚型同源性最高，判断该病毒属于H3N8亚型马流感病毒，命名A/EQ/Guangxi/ 01/09。

关键词：马流感；H3N8；血凝抑制试验；HA基因；NA基因中图分类号：S855.3文献标识码：A文章编号：0529-5130（2011）10-0071-05马流行性感冒（Equine influenza，EI）简称马流感，是由正黏病毒科（Orthomyxoviridae）流感病毒属（Influenzavirus）甲型流感病毒引起的马属动物的急性暴发式流行的传染病［1］，主要表现发热、咳嗽和流浆液性鼻汁等症状，严重者可引起死亡。

马流感病毒一旦感染马群，极易大范围迅速传播，是对养马和赛马业影响最为严重的传染病之一，曾给养马者造成收稿日期：2010-09-14；修回日期：2011-05-10基金项目：广西科技攻关项目（2010GXNSFD013033）。

作者简介：付薇（1982-），女，瑶族，兽医师，硕士。

*通讯作者：熊毅，研究员，主要从事动物传染病与分子病毒学研究，E-mail：gxxiongyi@。

不同程度的经济损失［2］。

目前已知马流感病毒主要有2种，一是H7N7亚型流感病毒，另一种是H3N8亚型病毒。

其中H3N8亚型病毒是由一种禽流感病毒突变而来，危害比较大［3］。

H3N8亚型马流感病毒的致病性研究及灭活疫苗的研制的开题报告一、选题背景马流感是由马流感病毒引起的一种病毒性疾病，包括H7N7、H3N8、H3N2等亚型。

其中，H3N8亚型马流感病毒是近年来引起马匹呼吸道疾病的主要病原体之一。

它会导致马匹出现咳嗽、喉咙痛、眼炎、鼻流等症状，甚至引发严重的肺炎和死亡。

马流感对马匹的健康和竞赛业产生了极大的影响，同时也对人类健康构成了威胁。

因此，深入研究马流感病毒的致病机理，探究有效的防控手段成为当前急需解决的问题。

二、研究目的本研究旨在：1）探究H3N8亚型马流感病毒的致病机理和传播途径；2）开发利用化学物质灭活的马流感疫苗，评价其免疫效果和安全性。

三、研究内容1. 实验方法通过H3N8亚型马流感病毒的分离培养、传染性病原学试验、免疫组化检测等实验方法，研究其致病机理及传播途径。

2. 灭活疫苗的研制方法通过对H3N8亚型马流感病毒的灭活实验，筛选出最大限度保留病毒免疫原性的化学灭活方法，并开发出符合药典规范的马流感疫苗。

3. 免疫效果和安全性的评价通过动物免疫试验，评价研制的马流感疫苗的免疫效果和安全性，并对其进行临床试验。

四、预期成果1. 实验结果将为探究马流感病毒的致病机理提供依据，为制定有效的防控策略提供理论支持。

2. 研制的马流感灭活疫苗，将为马匹防疫提供可行的手段，降低马流感病毒传播和疾病风险，促进马匹竞赛业的发展。

五、研究意义本研究将为探究H3N8亚型马流感病毒的致病机理、开发马流感疫苗提供理论依据和实践经验。

同时，研究成果将为进一步探讨马匹呼吸道疾病的防控和人畜共患病的预防提供参考。

应用TaqMan荧光定量PCR检测H3N8亚型马流感病毒戴伶俐;郭巍;李雪峰;黄文强;赵立平;阿依吐拉·肉孜;相文华【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2009(031)008【摘要】为建立马流感病毒(ETV)的检测方法,本试验针对H3N8亚型ETV血凝素(HA)基因高度保守序列设计并合成了2对引物和1条TaqMan荧光探针,建立了TaqMan荧光定量PCR方法.经用TaqMan荧光定量PCR、RT-PCR和病毒分离方法分别检测新疆等省135份疑似EIV马鼻拭子样品,其结果表明:3种方法的马流感检出率分别为54.07%、37.78%、0.89%;TaqMan荧光定量PCR可检出马流感病毒基因组RNA的灵敏度可达10拷贝/反应.而且与其他马呼吸道病毒均无交叉反应,具有良好的特异性、敏感性和重复性.该方法为H3N8亚型马流感的早期诊断及分子流行病学调查等提供了一种新的快速、准确的定量检测技术.【总页数】5页(P614-617,626)【作者】戴伶俐;郭巍;李雪峰;黄文强;赵立平;阿依吐拉·肉孜;相文华【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/马病研究中心,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/马病研究中心,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/马病研究中心,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/马病研究中心,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/马病研究中心,黑龙江,哈尔滨,150001;新疆动物卫生监督所,新疆,乌鲁木齐,830001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室/马病研究中心,黑龙江,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5【相关文献】1.广西H3N8亚型马流感病毒耐药性分析 [J], 颜健华;何奇松;熊毅;冯淑萍;胡丽萍;韦建华2.广西H3N8亚型马流感病毒耐药性分析 [J], 颜健华;何奇松;熊毅;冯淑萍;胡丽萍;韦建华;3.一株H3N8亚型马流感病毒的鉴定及HA基因序列分析 [J], 王小蕾;段会娟;杨志远;刘立新;赵际成;潘洁;刘月焕;林健4.H3N8亚型马流感病毒间接ELISA抗体检测方法建立及应用 [J], 郭巍;王英原;王宇;张馨心;赵立平;王立群;相文华5.马流感病毒(H3N8亚型,Huabei株)对马的致病性研究 [J], 吴涛;王嘉;林健;毛娅卿;韩春华;王哲;潘洁;孔冬妮;蒋桃珍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

我国H3N8马流感病毒血凝素基因分子进化树的分析杨建德;相文华;薛飞;王晓钧;朱远茂;赵立平;吕晓玲;沈荣显;李景鹏【期刊名称】《中国生物工程杂志》【年(卷),期】2003(23)6【摘要】根据已发表的马流感病毒血凝素基因序列 ,设计并合成一对特异性引物 ,经反转录聚合酶链反应 (RT PCR)成功扩增出了我国马流感病毒青海株 (A Equine Qinghai 1 94)、吉林株 (A Equine Jilin 1 89)及黑龙江株 (A Equine Heilongjiang 1 89)血凝素基因 ,将片段分别连接到PGEM T easy载体并转化DH5α,提取阳性菌落的质粒经EcRo1酶切和PCR鉴定其大小均为 1 7kb左右 ,对其测序并构建HA基因进化树。

经过比较分析 ,青海株与A Equine Kentucky 2 86、A Equine Miami 1 63等关系较近 ,核苷酸同源率为 97 3%～ 84 7% ,而与我国马流感吉林株和黑龙江株关系较远 ,同源率仅为 5 5 2 %。

经过比较 ,青海株与我国香港 1【总页数】3页(P76-78)【关键词】马流感病毒;血凝素基因;分子进化树;基因序列【作者】杨建德;相文华;薛飞;王晓钧;朱远茂;赵立平;吕晓玲;沈荣显;李景鹏【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所;东北农业大学生物工程系【正文语种】中文【中图分类】S852.652;Q939.4【相关文献】1.野鸭源H3N8亚型禽流感病毒NS基因的分子克隆及序列分析 [J], 郭亮;柴洪亮;张兰兰;张进;侯志军;孙颖;魏韬;华育平2.基于进化树理论的甲型流感病毒血凝素同源性及进化分析 [J], 王伟;仇建烨;吴艳;朱平3.我国H7N9禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因的分子进化分析 [J], 刘大维4.一株H3N8亚型马流感病毒的鉴定及HA基因序列分析 [J], 王小蕾;段会娟;杨志远;刘立新;赵际成;潘洁;刘月焕;林健5.H3N8亚型马流感病毒内蒙古株NS基因的克隆及序列分析 [J], 李雪峰;戴伶俐;郭巍;相文华;曹贵方;苏布达因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

H3N8型马流感血凝素核酸疫苗的初步研究许莹;郭巍;王世霞;黄文强;张璐;卢山;周建华;相文华;黄祖瑚【期刊名称】《中国医药生物技术》【年(卷),期】2010(005)003【摘要】目的研发一种具有良好免疫原性的H3N8型马流感血凝素(hemagglutinin,HA)核酸疫苗.方法根据马 A 型流感病毒A/Equine/Xinjiang/3/08(H3N8)的HA蛋白序列,经密码子优化后化学合成能够表达相应蛋白的基因片段,并将该片段克隆到核酸疫苗载体pJW4303中,构建带有天然信号肽的H3HA核酸疫苗,命名为H3HA/XJ3-08-wt;进一步对HA基因进行修饰,以人组织纤维蛋白酶原激活剂(human tissue plasminogen activator,tPA)取代H3HA天然信号肽,命名为H3HA/XJ3-08-tPA,或切除部分HA的基因片段使之只表达HA蛋白的胞外域,命名为H3HA/XJ3-08-dTM.用这3种重组质粒分别转染293T细胞,蛋白表达经蛋白质印迹检测得到确认.采用电转录法免疫新西兰白兔.ELISA方法检测免疫后兔血清中抗H3HA抗体滴度,血凝抑制实验(hemagglutination inhibition,HI)检测保护性抗体水平.结果 3种H3HA核酸疫苗均可在293T细胞中高效表达,并能够在新西兰白兔体内诱导产生特异性抗H3HA抗体,HI检测到不同水平的保护性抗体.其中以H3HA/XJ3-08-tPA的免疫原性最强.结论新构建的H3N8型马流感血凝素核酸疫苗具有良好的免疫原性,为此类疫苗的进一步研发奠定了基础.【总页数】6页(P196-201)【作者】许莹;郭巍;王世霞;黄文强;张璐;卢山;周建华;相文华;黄祖瑚【作者单位】210029,南京医科大学第一附属医院感染病科/江苏省人民医院中美疫苗中心;150001,哈尔滨,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室大动物病研究室;210029,南京医科大学第一附属医院感染病科/江苏省人民医院中美疫苗中心;01605,渥斯特,美国麻省大学医学院内科学系;150001,哈尔滨,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室大动物病研究室;210029,南京医科大学第一附属医院感染病科/江苏省人民医院中美疫苗中心;210029,南京医科大学第一附属医院感染病科/江苏省人民医院中美疫苗中心;01605,渥斯特,美国麻省大学医学院内科学系;150001,哈尔滨,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室大动物病研究室;150001,哈尔滨,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室大动物病研究室;210029,南京医科大学第一附属医院感染病科/江苏省人民医院中美疫苗中心【正文语种】中文【相关文献】1.编码流感病毒血凝素基因和CD40L的核酸疫苗抗小鼠流感研究 [J], 邹丽容;方芳;陈则2.H1N1型流感病毒血凝素抑制肽的筛选研究 [J], 汪崇文;丁晓然;杨静;邓新秀;高婵;冯指泉;鲁丹丹;王升启3.广州市A型流感病毒血凝素基因的遗传变异研究 [J], 方丹云;田疆;周经姣;周红;何丽娟;陈艺韵;狄彪;江丽芳4.马流感病毒(H3N8亚型,Huabei株)对马的致病性研究 [J], 吴涛;王嘉;林健;毛娅卿;韩春华;王哲;潘洁;孔冬妮;蒋桃珍5.我国H3N8马流感病毒血凝素基因分子进化树的分析 [J], 杨建德;相文华;薛飞;王晓钧;朱远茂;赵立平;吕晓玲;沈荣显;李景鹏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。