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GST标签的蛋白纯化1.200mL菌液离心所得的菌体用80mL 1×PBS 重悬，置于冰上超声10min（超声5s，停10s）。
2.超声所得产物留样1mL，剩余样品4℃，12000rpm离心30min。
3.收集上清，用0.45um的过滤器过滤，留样1mL 。
沉淀用20mL 1×PBS 重悬，留样1mL。
沉淀于-30℃保存。
4.准备Binding Buffer 1×PBS，pH=7.3Elution Buffer 50mM Tris-HCl，10mM 还原型谷胱甘肽，pH=8.0分别加入1mM DTT用于洗脱和结合8.使用蠕动泵将Binding Buffer注入柱中，以2mL/min的流速平衡柱。
避免空气进入柱内。
9.使用蠕动泵将样品注入柱中，以1mL/min的流速结合样品，循环上样3次。
10.使用蠕动泵将50mL Binding Buffer注入柱中，以2mL/min的流速清洗柱。
11.使用蠕动泵将20mL Elution Buffer注入柱中，以1mL/min的流速结合蛋白。
从第2mL开始，每1mL 产物收集在1.3mL EP管中。
共收集10柱体积的产物。
剩余Elution Buffer用于去除杂蛋白。
12.使用蠕动泵将50mL 超纯水注入柱中，以2mL/min的流速1清洗柱。
13.使用蠕动泵将20mL 20%酒精注入柱中，以2mL/min的流速，当柱中充满酒精时将柱取下保存在4℃。
14.将沉淀留样使用电磁炉煮沸5min，12000rpm离心10min，吸取上清。
同蛋白产物一同进行SDS-PAGE电泳。
根据电泳结果，推测GST标签蛋白可能以包涵体形式存在于沉淀中接菌pw61，进行小量诱导，并制备蛋白样品根据电泳结果显示，推测GST标签蛋白存在于沉淀中。
Western Blot 未显示有条带，丽春红染色有明显条带，推测使用的GST抗体不能与目的条带特异性结合。
纯化可溶性蛋白3875裂解：将离心好的菌沉淀取出，500 ml菌液用60 ml Buffer A平衡缓冲液将沉淀重悬。
Protein Expression Protocol:1.Transform control construct and tag-fusion-constructs into E.coli BL21(DE3) competent cell, growovernight;2.Inoculate single colony to 2~3 ml LB medium, and grow at 37 degree for 7~10 hours or overnight;3.1:100 inoculate to 3 ml LB, bacteria grow for 2-3 hours at 37 degree, then follow 1:2000 add 1 MIPTG to induce protein expression overnight at 22 degree;4.Spin down bacteria at 12000 rpm for 1 min, wash with 1 ml ddH2O, add 100 ul 1x PBS toresuspend the deposition, then sonicate 3~5 min on ice;5. Spin down at 12000 rpm for 10min, separate the supernatants and deposition;6. Boiling with loading buffer at 100 degree for 5min, Spin down at 12000 rpm for 5min, 12%SDS-PAGE;7. After confirmed protein expressed in supernatants, increase the volume of bacteria medium. 1:100inoculate to 100 ml LB, grow bacteria for 2-3 hours at 37 degree;then follow 1:2000 add 1 M IPTG to induce protein expression overnight at 22 degree;8. Spin down bacteria at 8000 rpm 4 degree for 5 min, wash with 10 ml ddH2O, add 5 ml 1x PBS toresuspend the deposition, then sonicate 60 min on ice;9. Spin down at 12000 rpm 4 degree for 10min, separate the supernatants and deposition;10.Prepare the supernatants for purification.蛋白表达注意事项：1. E.coli BL21比DH5α生长要快，固体培养基上10～12小时即可长斑，液体培养基中8小时后即可生长成较大密度；切勿培养时间过长，防止菌体老化；2.为了后续实验的便利，应尽量减少包涵体的形成。
GST蛋白纯化简介谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）是一种常用的亲和标签，用于在分子生物学研究中用于蛋白质纯化和蛋白质亲和结合实验。
GST蛋白被广泛应用于蛋白质结构和功能研究、酶学研究、蛋白质互作研究等领域。
本文将介绍一种常见的方法来纯化GST蛋白，该方法主要包括以下步骤：细胞裂解、亲和层析、洗脱和纯化。
方法细胞裂解首先需要将GST蛋白表达在适当的宿主中，例如大肠杆菌。
在细胞达到适当的生长阶段后，使用合适的方法将细胞裂解，使得目标蛋白释放到溶液中。
一种常用的裂解方法是超声波裂解，通过超声波震荡将细胞破碎。
亲和层析经过细胞裂解后，将得到的细胞裂解液通过亲和层析柱。
亲和层析柱通常使用含有还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）结合物质的树脂，例如glutathione agarose beads。
这种树脂与GST标签结合，使得GST标签的融合蛋白能够特异性地结合于柱子上。
通过洗脱液去除非特异结合蛋白，将目标蛋白纯化。
洗脱洗脱过程是将结合于柱子上的目标蛋白从固定相洗净。
一般采用含有高浓度还原型谷胱甘肽的洗脱液，例如50 mM GSH。
洗脱液中的还原型谷胱甘肽与柱子上的结合物质竞争与GST标签结合，以此达到将GST蛋白洗脱下来。
纯化经过洗脱后，蛋白溶液中的GST蛋白含量较高。
为了进一步提高纯度，可以通过对溶液进行浓缩、去除低分子量杂质、调整溶液pH值等方法进行纯化。
常用的纯化方法包括丙酮沉淀法、离子交换柱层析法等。
注意事项•在实验过程中应严格操作，避免任何可能导致目标蛋白污染的情况发生。
•选择合适的表达宿主，不同的宿主可能会对GST蛋白的表达量和可溶性产生影响。
•在细胞裂解过程中，避免样品受到温度、剧烈振荡等因素的影响。
•注意亲和层析柱的操作方法，避免破损或污染。
•洗脱过程中注意还原型谷胱甘肽浓度和洗脱液的pH 值。
结论GST蛋白纯化是一种常见的蛋白质纯化方法，通过亲和层析技术可以实现对GST蛋白的高效纯化。
GST融合蛋白的纯化诱导和收集菌体在一定的诱导条件下IPTG诱导蛋白的合成。
18～25℃的低温条件下培养可以使大部分蛋白融合蛋白可溶性表达，并保持较高的活性。
IPTG浓度一般为0.1～1.0mM。
5000rpm 5min离心收集菌体。
亲和层析柱的制备取存放谷胱甘肽琼脂糖的瓶子颠倒数次，使其混匀，取1.5ml混合液加入层析柱中，加10ml 20％乙醇，使琼脂糖在柱中自然沉降。
将20％乙醇流尽后，加10ml PBS清洗柱子，待管中PBS液面刚好没过凝胶时，套上滴口的套子，待用。
每100ml菌液的菌体用4ml PBS（加1％Triton-100、蛋白酶抑制剂）悬浮。
在冰水中超声波破碎细胞（1分钟/次×5次，每次间隔1分钟）。
将裂解液分装至小管，4℃10000rpm离心5分钟。
收集上清液，加DTT至终浓度为1mM。
0.45um过滤后加入亲和层析柱。
室温下使混合液自然通过层析柱，保留0.5ml过滤液做PAGE电泳检测用。
用10ml PBS洗柱子3遍，每次临近结束时收集洗涤液0.5ml测OD值。
配制10mM的还原型谷胱甘肽溶液，即洗脱液3ml（0.009g溶于3ml 50mM Tris-Cl溶液中）。
用洗脱液洗脱GST融合蛋白，每管0.5ml接收洗脱液。
测各管洗脱液蛋白浓度。
PAGE电泳检测纯度。
亲和层析柱的再生：用0.04M NaOH洗10ml×3次，用10ml PBS平衡后，加20％乙醇储存于4度。
或者按照beads使用说明书上的方法再生。
如果洗脱液中的还原型谷胱甘肽对实验有影响时，需用分子筛去除。
如果需要不带标签的蛋白，则蛋白被柱子吸附后，用蛋白酶进行切割；或者用分子筛过滤后，在筛子上进行酶切。
gst纯化蛋白步骤GST纯化蛋白是一种常用的蛋白质纯化方法，它利用谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-Transferase，GST)的亲和性，将GST标签蛋白与GST结合亲和树脂进行结合，然后通过洗脱，最终得到纯化的目标蛋白。
下面将为大家介绍GST纯化蛋白的详细步骤。
1.构建重组蛋白表达载体：首先需要在目标蛋白编码基因的N端或C端加上GST标签，通常选择GST-N和GST-C两种方式。
将GST标签与目标蛋白基因连接后，将其插入合适的表达载体中。
2.转化宿主细胞：将构建好的重组表达载体转化到适合的宿主细胞中，常用的宿主细胞有大肠杆菌和酿酒酵母等。
3.表达目标蛋白：宿主细胞在适宜的培养条件下进行培养，使其产生大量重组蛋白。
常见的培养条件包括温度、培养基的选择和添加诱导物等。
4.细胞破碎：培养得到丰富的重组蛋白的细胞后，通过机械或化学方法将细胞破碎。
常用的方法有超声波破碎、高压均质破碎、冻融法和溶菌酶法等。
5.蛋白纯化：将细胞破碎液进行离心分离，去除残余细胞碎片。
接下来，将蛋白样品加入含有GST结合亲和树脂的柱子中，通过亲和吸附，在树脂上富集GST标签蛋白。
6.洗脱纯化蛋白：使用合适的洗脱缓冲液，可以脱离与亲和树脂结合的非特异性结合蛋白，并洗脱纯化的目标蛋白。
一般使用还原性缓冲液，可将目标蛋白从GST结合亲和树脂上彻底洗脱。
7.蛋白质浓缩：通过合适的方法，如超滤、溶液浓缩装置等，使纯化的目标蛋白浓缩到较高浓度。
8.纯化蛋白的分析：对纯化的目标蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，检测其纯度和分子量等指标。
通过上述步骤，可以得到较高纯度的GST标签蛋白。
需要注意的是，在步骤的选择和操作过程中，要根据目标蛋白的特性和所需纯度等要求进行调整，以获得更好的纯化效果。
希望本文对您进行GST纯化蛋白的实验有所帮助。
GST融合蛋白的纯化诱导和收集菌体在一定的诱导条件下IPTG诱导蛋白的合成。
18～25℃的低温条件下培养可以使大部分蛋白融合蛋白可溶性表达，并保持较高的活性。
IPTG浓度一般为0.1～1.0mM。
5000rpm 5min离心收集菌体。
亲和层析柱的制备取存放谷胱甘肽琼脂糖的瓶子颠倒数次，使其混匀，取1.5ml混合液加入层析柱中，加10ml 20％乙醇，使琼脂糖在柱中自然沉降。
将20％乙醇流尽后，加10ml PBS清洗柱子，待管中PBS液面刚好没过凝胶时，套上滴口的套子，待用。
每100ml菌液的菌体用4ml PBS（加1％Triton-100、蛋白酶抑制剂）悬浮。
在冰水中超声波破碎细胞（1分钟/次×5次，每次间隔1分钟）。
将裂解液分装至小管，4℃10000rpm离心5分钟。
收集上清液，加DTT至终浓度为1mM。
0.45um过滤后加入亲和层析柱。
室温下使混合液自然通过层析柱，保留0.5ml过滤液做PAGE电泳检测用。
用10ml PBS洗柱子3遍，每次临近结束时收集洗涤液0.5ml测OD值。
配制10mM的还原型谷胱甘肽溶液，即洗脱液3ml（0.009g溶于3ml 50mM Tris-Cl溶液中）。
用洗脱液洗脱GST融合蛋白，每管0.5ml接收洗脱液。
测各管洗脱液蛋白浓度。
PAGE电泳检测纯度。
亲和层析柱的再生：用0.04M NaOH洗10ml×3次，用10ml PBS平衡后，加20％乙醇储存于4度。
或者按照beads使用说明书上的方法再生。
如果洗脱液中的还原型谷胱甘肽对实验有影响时，需用分子筛去除。
如果需要不带标签的蛋白，则蛋白被柱子吸附后，用蛋白酶进行切割；或者用分子筛过滤后，在筛子上进行酶切。
gst亲和层析步骤GST（谷胱甘肽S-转移酶）亲和层析是一种常用的蛋白质纯化技术，它基于谷胱甘肽S-转移酶与谷胱甘肽结合的高亲和力，可用于纯化含有GST标签的蛋白质。
第一部分：材料准备在进行GST亲和层析之前，需要准备一些实验材料。
以下是常见的实验材料列表：1. 细菌表达系统：常用的细菌表达系统包括大肠杆菌（E. coli）和酵母菌等。
选择适当的表达系统，并确保表达系统中含有GST融合蛋白的基因。
2. 培养基和抗生素：根据表达系统的需求，准备适当的培养基，并添加相应的抗生素以选择含有GST融合蛋白的菌落。
3. 细胞破碎缓冲液：根据实验需求选择适当的细胞破碎缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）或Tris缓冲液，并添加辅助试剂如EDTA（乙二胺四乙酸）和PMSF （苯甲磺酰氟）等。
4. 融合蛋白纯化缓冲液：准备一系列用于融合蛋白纯化的缓冲液，包括洗脱缓冲液、结合缓冲液、平衡缓冲液等。
常用的缓冲液成分包括PBS、NaCl（氯化钠）、DTT（二硫苏糖醇）和Tween-20等。
5. GST树脂：选择合适的GST亲和树脂，如GST-Sepharose或Glutathione Agarose等。
6. 色谱柱：选择合适的色谱柱，如预装的柱子或自制的柱子，并进行消毒和平衡。
7. 蛋白质测定试剂盒：用于测定蛋白质的浓度，如BCA（双硫苏糖酸）蛋白定量试剂盒。
第二部分：GST融合蛋白的表达和纯化1. 转化细菌：将含有GST融合蛋白基因的质粒DNA转化到表达宿主细胞中，如E. coli。
通过热激冷冻法、电穿孔法或化学法等方法将质粒DNA导入细菌细胞内。
2. 培养细菌：将转化后的细菌菌落接种到含有适当抗生素的培养基中，并在适当的条件下培养细菌，如温度、pH值和搅拌速度等。
3. 蛋白表达诱导：当细菌培养达到适当的生长阶段时，添加适当浓度的诱导剂，如IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷），以诱导GST融合蛋白的表达。
4. 细胞收获：在蛋白表达诱导后一定时间，收集细菌细胞。
SOP6 谷胱甘肽亲和柱纯化带谷胱甘肽还原酶（GST)标签蛋白1.样品制备与“SOP Ni-NTA层析柱亲和纯化6His标签融合蛋白”中样品制备方法相同，裂解缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，2mM EDTA，0.5% NP-40，0.5% Triton X-100，0.5mM DTT ，1mM PMSF，1mM NaF ，protease inhibitors cocktail，pH7.5) 。
（PMSF，DTT，protease inhibitors cocktail在破菌前加入。
）适合于GST Pull- Down的细菌裂解液配方还有很多。
2.样品纯化Glutathione Beads亲和树脂灌装层析柱或直接使用Glutathione Beads预装柱，层析柱下端接核酸蛋白检测仪。
2.1 平衡层析柱至工作温度，纯化过程可在室温或4℃进行。
2.2 将层析柱固定在支架上，让其流尽树脂保护液，快流干的时候用至少5倍体积的平衡/洗涤缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，pH8.0)冲洗柱子。
2.3 制备的蛋白样品与平衡/洗涤缓冲液1:1混合，加到平衡好的Glutathione Beads中（保证目的蛋白与Glutathione Beads充分接触，提高目的蛋白的回收率），收集流穿液。
2.4 用10～15倍柱床体积的平衡/洗涤缓冲液清洗柱床，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗涤液。
2.5 使用5～10倍柱床体积的洗脱缓冲液（50mM Tris，150mM NaCl，10mM还原型谷胱甘肽，pH8.0），收集洗脱液，即目的蛋白组分。
还原型Glutathione易氧化，也容易影响pH,需现用现配,同时注意调pH 8.0。
3.SDS-PAGE检测分析纯化过程各组分纯化过程中得到的样品（包括上样前样品液、流穿液、洗杂液和顺次收集的洗脱蛋白）以及原始样品使用SDS-PAGE检测分析纯化效果。
亲和柱层析操作规程（可溶性蛋白）1.装柱：1.1 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子；1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水；1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积；2.柱的平衡与上样：2.1用0.02M PB bufferA 缓冲液(PH8.0)平衡Ni柱，直至流出液的pH为8.0；2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；3洗杂蛋白：3.1用0.02M PB bufferA 缓冲液(PH8.0)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含5mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含5mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.3用含10mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.4用含20mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.5用含40mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.6用含50mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含50mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含100mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）4解离目的蛋白：4.1用含100mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.2 用含200mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含200mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.3 用含500mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含500mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.4用含1000mM咪唑的PB bufferA 缓冲液（pH8.0）过柱，共洗约30ml，至流出液与含1000mM咪唑的PB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul 做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）5.柱的清洗与保存：5.1用含500mM咪唑的缓冲液A（pH8.0）以冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.3用过滤去离子水冲洗50ml；5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。
GST融合蛋白操作规程
1、重悬菌：用15倍菌重体积的上样缓冲液重悬菌。
（即1kg大肠杆菌用15L上
样缓冲液）。
2、破碎菌：破碎前需加0.5mMPMSF。
破碎压力为800bar左右。
整个过程需低
温操作。
3、离心：9000rpm离两次，25min一次。
4、装柱及平衡柱子：装柱子时不可产生气泡；用5—10倍体积及的上样缓冲液
平衡柱子。
5、上样：20倍菌重体积上样，（即1kg大肠杆菌用20L上样缓冲液），上样速度
度不可太快。
最大值范围应接近重力流速，不可超过重力流速太多。
（例如我们目前柱子的重力流速为25ml/min左右，我们的最大流速也应该在25ml/min 左右）。
上样完后进行反冲。
6、冲洗柱子：先用冲洗缓冲液1冲洗5—10倍体积。
再用冲洗缓冲液2冲洗至
流出液在Bradford不变色为止。
7、酶切：酶切前先把柱子掏出，用冲洗缓冲液2淘洗至流出液在Bradford不变
色为止。
再把柱子倒回烧杯中，再加入冲洗缓冲液2至快1L左右，再加入3%PEG400，3mM巯基乙醇。
再加入酶终浓度为1:200左右的TEV酶。
酶切4h以上。
（整个过程需低温操作）。
8、收集目的蛋白（整个过程需低温操作）
9、目的蛋白后期处理。
GST融合蛋白纯化方法1目的片段接入pGEX载体；2涂板，挑单克隆，摇菌至OD600≈1.0，加入IPTG（终浓度1 mM）诱导6－8 h；3收菌，每升菌液约以50 mL PBS重悬，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巯基乙醇（v/v），PMSF （终浓度1 mM）；以下步骤均在冰上操作：4 超声破碎菌体，15000 g，10min离心取上清，在上清中加入适量GST-beads，轻轻晃动令其吸附蛋白1 h；5 2000 g，3min离心弃上清；6加入至少10倍体积PBS，轻摇至beads悬浮于溶液中，2000 g，3 min离心弃上清；7 重复步骤6 两次；8 加入1 mL GST Elution Buffer，轻摇10 min；9 2000 g，3 min离心，收集上清；10 重复步骤8-9至少两次；11 SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，Bradford法检测蛋白浓度；12将蛋白置于-20℃保存。
P.S. 大量提取前应取少量菌液，改变IPTG浓度，诱导温度，诱导时间等，以确定蛋白表达的最适条件。
制备细胞裂解物：1.每100ml培养物的细胞沉淀悬于4ml PBS;2.加入溶菌酶至终浓度1mg/ml，冰上放置30min;3.用针筒将10ml 0.2%Triton X-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震动数次混匀；4.加入DNase和RNase至终浓度5ug/ml,4℃震动温育10min;5. 4℃ 3000g(5000r/min)离心30min;6.上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L;纯化融合蛋白：7.细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100ml 细胞培养物加2ml 树脂，于室温下轻摇30min;8混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE;9.沉淀中加入10倍标准体积的PBS,颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白；10. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE;11.重复步骤9和10两次；12.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱，也可用凝血酶，肠激酶或Xa因子切割，释放靶蛋白；用谷胱甘肽洗脱洗脱融合蛋白：a.沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min,洗脱树脂上结合的蛋白；b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min,上清移至新管中;c.重复步骤a和b两次，合并3次的上清；蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶细胞：a.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶，肠激酶或Xa因子。
GST标签的蛋白纯化GST标签的蛋白纯化1.200mL菌液离心所得的菌体用80mL 1×PBS 重悬，置于冰上超声10min（超声5s，停10s）。
2.超声所得产物留样1mL，剩余样品4℃，12000rpm离心30min。
3.收集上清，用0.45um的过滤器过滤，留样1mL 。
沉淀用20mL 1×PBS 重悬，留样1mL。
沉淀于-30℃保存。
4.准备Binding Buffer 1×PBS，pH=7.3Elution Buffer 50mM Tris-HCl，10mM 还原型谷胱甘肽，pH=8.0分别加入1mM DTT用于洗脱和结合8.使用蠕动泵将Binding Buffer注入柱中，以2mL/min的流速平衡柱。
避免空气进入柱内。
9.使用蠕动泵将样品注入柱中，以1mL/min的流速结合样品，循环上样3次。
10.使用蠕动泵将50mL Binding Buffer注入柱中，以2mL/min 的流速清洗柱。
11.使用蠕动泵将20mL Elution Buffer注入柱中，以1mL/min的流速结合蛋白。
从第2mL开始，每1mL 产物收集在1.3mL EP管中。
共收集10柱体积的产物。
剩余Elution Buffer用于去除杂蛋白。
12.使用蠕动泵将50mL 超纯水注入柱中，以2mL/min的流速1清洗柱。
13.使用蠕动泵将20mL 20%酒精注入柱中，以2mL/min的流速，当柱中充满酒精时将柱取下保存在4℃。
14.将沉淀留样使用电磁炉煮沸5min，12000rpm离心10min，吸取上清。
同蛋白产物一同进行SDS-PAGE电泳。
根据电泳结果，推测GST标签蛋白可能以包涵体形式存在于沉淀中接菌pw61，进行小量诱导，并制备蛋白样品根据电泳结果显示，推测GST标签蛋白存在于沉淀中。
Western Blot 未显示有条带，丽春红染色有明显条带，推测使用的GST抗体不能与目的条带特异性结合。
制备样品：1、12000rpm离心5min手机细胞，倒上清。
尽量控干cell沉淀。
每100ml培养液的细胞用4ml冰冷的1xGST Bind/Wash Buffer 重悬。
2、在冰浴或盐冰浴中超声波处理样品。
如果样品已不再粘稠即可停止超声。
如果DNA没有剪切好会因为样品粘稠而堵住柱子。
纯化：1、将树脂浆灌注（其中树脂为50%）。
小型聚丙烯色谱管可以加载2.5ml树脂（柱床体积），用于纯化12-20mg目的蛋白。
2、当储存缓冲液（20%乙醇）液面降到柱床上沿以下时，用5x体积1xGST Bind/Wash Buffer洗树脂。
3、待GST Bind/Wash Buffer流到柱床上沿以下时，加入制备好的蛋白抽提液。
收集流穿组分并置于冰上。
4、以10x体积1xGST Bind/Wash Buffer洗柱，收集流穿组分并置于冰上。
5、以3x体积1xGST Bind/Wash Buffer洗脱目的蛋白。
收集洗脱组分置于冰上待后续分析。
6、分析洗脱和穿过组分中出现的目的蛋白。
若目的蛋白带的是无功能的GST则无法与树脂结合，纯化。
7、洗脱结束后，用3-5x体积柱床体积的1xGST Bind/Wash Buffer洗涤柱子。
8、再用3-5x柱床体积的ddH2O洗涤柱子。
9、GST凝胶最后保存于2-3x柱床体积的20%乙醇中。
GST纯化所需试剂：1、10xGST Bind/Wash Buffer（pH7.3）用NaOH或HCl调PH配制500ml 10xGST Bind/Wash Buffer试剂配方：43mM 的Na2HPO4.12H2O 需称量7.7g14.7mM的KH2PO4需称量1g1.37M NaCl 需称量40.03g27mM KCl 需称量1g使用时稀释10x变成1xGST Bind/Wash Buffer即可。
2、1xElution Buffer 配制（现配现用，以免被氧化）取1g还原型谷胱甘肽溶于3.25ml 10xGlutathione Reconstitution Buffer中，再加ddH2O稀释到32.5ml。
实验八单柱亲和纯化GST融合蛋白Single Column Purification of GST Fusion ProteinsN末端或C末端GST融合蛋白纯化方法运用谷胱甘肽琼脂糖凝胶(0.5-2 ml) 谷胱甘肽树脂预装柱(0.5-1 ml) 进行GST融合蛋白纯化的方法，适用于25-100 ml的诱导培养菌(纯化2.5-10 mg GST融合蛋白)1. 细菌培养：直接挑取表达质粒新转化的单菌落, 加入25-100 ml LB+Amp液体培养基中（含氨苄100 μg/ml），37℃振荡培养至OD600nm达0.5。
2. 诱导蛋白表达：加入终浓度为0.3 mM 的IPTG，30-37℃振荡培养3 h，诱导蛋白表达。
设立阴性对照。
取样10-20 μl进行SDS-PAGE电泳, 取样1-2 μl进行Western blot鉴定。
表达的时间和温度根据表达量, 可溶性和稳定性进行调整, 对于37℃不稳定或不溶的蛋白, 0.1 mM 的IPTG 20-25℃诱导培养6-20 h; 10-16℃振荡培养12-24 h.3．细胞收集：5000×g离心10分钟(4℃), 弃上清。
-20/-80℃贮存。
细胞冻融利于破碎。
4．破碎细胞:用5-10 ml的裂解缓冲液(10 mM Tris-HCl, pH8.0, 0.1 NaCl) 将菌体重悬，超声破碎细胞(冰浴)，使融合蛋白释放。
15000-19000×g离心30分钟，上清即为可溶性蛋白的细胞粗提物。
上样5 μl进行SDS-PAGE电泳鉴定（Western:: 1∶10稀释, 上样5 μl）。
5．谷胱甘肽树脂预装柱的平衡: 20 ml的缓冲液4℃进行柱平衡。
每毫升谷胱甘肽树脂大约能够结合5-10 mg GST融合蛋白。
6．结合融合蛋白：用柱帽堵上，将澄清的细胞粗提物加入谷胱甘肽树脂预装柱(0.5 ml, # ;1 ml, # )，4℃放置15-30 min。
GST纯化步骤GST（Glutathione S-transferase）是一种广泛存在于生物体内的酶，可参与细胞代谢、解毒等重要生理过程。
GST纯化是一种重要的实验步骤，可以通过这种方法获得高纯度的GST蛋白。
下面将详细介绍GST纯化的步骤。
1.原料制备2.打断细胞将得到的蛋白溶液加入一定比例的裂解缓冲液中，如Tris-HCl缓冲液（pH 7.5），同时可以加入一定比例的蛋白酶抑制剂、凝血酶和DNA酶等物质，以防止蛋白在裂解过程中被降解。
然后，将细胞打破，可选择使用超声波破碎、高压细胞破碎机等方法。
3.澄清制备4.亲和层析将亲和树脂（如：谷胱甘肽琼脂糖）装填到柱中，然后与蛋白溶液进行接触，使GST蛋白与亲和树脂发生特异性结合。
在接触过程中，可以适当调节pH值、离子浓度等条件，以促进GST蛋白与亲和树脂的结合。
接着，通过流动层析的方法，将非特异性结合的蛋白、杂质等洗脱，并收集GST蛋白。
5.洗脱通过改变柱上的洗脱缓冲液的条件，如改变pH值、离子浓度等，使GST与亲和树脂之间的结合断裂，从而将纯化的蛋白洗脱出来。
常用的洗脱缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、EDTA缓冲液等。
6.脱盐将洗脱的GST蛋白通过浓缩手段去除缓冲盐、小分子物质等。
目前常用的浓缩方法有离心浓缩、透析浓缩等。
在此步骤中还可以使用一些化合物，如PEG，帮助蛋白更好地进行浓缩。
7.验证纯化效果通过SDS-、Western blot等方法对纯化后的GST蛋白进行鉴定，确定纯化效果。
此外，还可以使用酶活测定、质谱等方法对GST蛋白进行功能验证。
通过以上步骤，可以获得高纯度的GST蛋白。
纯化后的GST蛋白可以用于生物化学、分子生物学等领域的进一步研究，如蛋白结构和功能的研究、酶动力学的研究等。
亲和层析纯化可溶性GST标签重组蛋白的标准操作规程（编号：069）1、目的及适用范围
利用GST亲和层析纯化体外表达的带有His标签的可溶性重组蛋白。
2、主要仪器
GST柱、真空抽滤泵、超声破碎仪、冷冻离心机
3、主要试剂
3.1 Binding Buffer：1×PBS
3.2 Elution Buffer：20-50mM还原型谷胱甘肽
3.3 高pH值缓冲溶液：0.1M Tris，0.5M NaCl，pH 8.5
3.4 低pH值缓冲溶液：0.1M 醋酸钠，0.5M NaCl，pH
4.5
4、GST柱的预处理
用5个柱体积的1×PBS缓冲溶液平衡柱子
5、操作步骤
5.1蛋白的纯化
5.1.1大肠杆菌诱导表达目的蛋白；
5.1.2 4500rpm，离心10-15min，弃上清，收集菌体；
5.1.3 将收集的菌体用1×PBS重悬，8000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；
5.1.4 将菌体用1×PBS重悬，超声破碎菌体；
5.1.5 4℃，12000rpm，离心15min，收集超声后上清；
6.1.6 将收集的上清加入GST柱子中，4℃结合2h；
5.1.7 流出穿透液；
5.1.8 用20-30个柱体积的1×PBS冲洗柱子，除去非特异性结合的杂蛋白；
5.1.9 用1-3个柱体积的Elution Buffer洗脱目的蛋白；
5.1.10将诱导前全菌，诱导后全菌，穿透，洗脱样品进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。
5.2 柱子的再生
5.2.1 用3个柱体积的高pH缓冲溶液冲洗柱子；
5.2.2 用3个柱体积的低pH缓冲溶液冲洗柱子；
141。
