结核分支杆菌两种耐药基因的快速检测

探针熔解曲线法快速检测结核分枝杆菌注射类二线药耐药突变张婷;付军;王国治;陈保文;杨蕾;卢锦标;许晔;李庆阁【摘要】目的评价结核分枝杆菌注射类二线药耐药突变检测试剂盒MehProTB/SL的分析性能以及临床性能.方法首先使用企业参考品对试剂盒的突变检出能力进行考察,之后将野生型基因组DNA以10倍梯度稀释后考察试剂盒的最低检测限,使用野生型质粒以及含常见耐药突变的质粒以不同突变比例混合考察试剂盒检测不均一耐药样本的能力,并使用23株非结核分枝杆菌标准株考察试剂盒的分析特异性,最后使用241份临床分离株对试剂盒进行临床评价.结果该试剂盒可以将9种耐药相关突变与1种野生型多态性与野生型进行区分.可以检测到低至5个拷贝的野生型基因组DNA.当突变比例为30％或更高时,试剂盒可以将其与野生型进行区分.23种非结核分枝杆菌的结果显示该试剂盒有良好的特异性.和比例法药敏试验进行对比,该试剂盒的临床灵敏度为卡那霉素90.0％(9/10),阿米卡星80.0％(8/10),卷曲霉素85.7％(6/7);特异性为卡那霉素98.8％(85/86),阿米卡星98.8％(85/86),卷曲霉素96.6％(86/89).试剂盒检测结果与测序结果一致.结论该试剂盒灵敏度高、特异性好,可以快速、准确地检测结核分枝杆菌注射类二线药常见的耐药突变,有望应用于临床.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2015(031)005【总页数】6页(P412-417)【关键词】结核分枝杆菌;注射类二线药;耐药突变;探针熔解曲线法【作者】张婷;付军;王国治;陈保文;杨蕾;卢锦标;许晔;李庆阁【作者单位】厦门大学生命科学学院“细胞应激生物学”国家重点实验室,分子诊断教育部工程研究中心,厦门 361105;厦门大学生命科学学院“细胞应激生物学”国家重点实验室,分子诊断教育部工程研究中心,厦门 361105;中国食品药品检定研究院结核病疫苗室,北京 100050;中国食品药品检定研究院结核病疫苗室,北京100050;中国食品药品检定研究院结核病疫苗室,北京 100050;中国食品药品检定研究院结核病疫苗室,北京 100050;厦门大学生命科学学院“细胞应激生物学”国家重点实验室,分子诊断教育部工程研究中心,厦门 361105;厦门大学生命科学学院“细胞应激生物学”国家重点实验室,分子诊断教育部工程研究中心,厦门 361105【正文语种】中文【中图分类】R378我国结核分枝杆菌的耐药情况严重，耐药率高，给结核病的预防和治疗带来严峻挑战。

两小时内快速检测结核分枝杆菌及是否利福平耐药发表时间：2014-04-14T16:35:53.530Z 来源：《中外健康文摘》2013年37期供稿作者：赵立春[导读] .主要试剂与仪器：Gene Xpert IV 设备由多达4个模块组成，每个模块处理一个样品。

Gene xpert检测盒。

赵立春 (哈尔滨市香坊区结核病防治所 150000)【摘要】目的：研究同时检测患者是否结核，以及是否对利福平耐药，对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性，两小时内即可得到检测结果，所用仪器设备简单。

【关键词】结核利福平耐药 Gene xpert检测试剂盒【中图分类号】R96 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2013）37-0273-01 【结果】两个小时内快速检测结核分枝杆菌及是否利福平耐药，经过为时18个月的严格评估，2010年12月8日世卫组织认可Xpert MTB/RIF 作为一种全新的结核病快速检测新方法，世卫组织遏制结核病司司长Maoio Rarig lione博士评价Xpert MTB/RIF检测方法是全球结核病诊断和治疗方法的一个重要里程碑，为患结核病和耐药结核病危险的数百万人带来了新希望。

【Gene xpert】是世界上唯一的全自动一体化实时定量PCR检测系统；通过采用实时聚合酶链式反应，全自动医用PCR分析系统能自动完成并整合以下过程；核酸提取，扩增以及目标序列，在单或者复杂样品中的检测，采用一次性特定分析用Gene xpert检测盒制备和处理样本，将样本和所需试剂加入到检测盒中，然后将试剂盒放到一个可用的设备模块之中。

材料与方法：1.样本来源：哈尔滨香坊区结核病防治所2013年1月—2013年12月门诊患者。

2.主要试剂与仪器：Gene Xpert IV 设备由多达4个模块组成，每个模块处理一个样品。

Gene xpert检测盒。

方法：样品的准备及核酸的提取被提取核酸的扩增目标序列的检测Cartridge应盒，Cepheid获准专利的完备独立的反应盒，Gene xpert模块是一个独立可控温的荧光计，可对进行中的PCR反应进行实时监测，该模块可快速精准地控制反应样品温度保障反应的快速精准进行；每一个模块都具有四个光谱，这使模块可检测一个反应管中的多种荧光染料；每一个反应单元都相互独立。

等位基因特异性PCR法快速检测结核分枝杆菌常见耐药突变基因彭婉婵;刘文恩;谭耀驹;胡可;蔡杏珊;胡族琼;李艳冰【摘要】目的建立一套同步检测结核分枝杆菌(MTB)常见耐药突变基因的等位基因特异性PCR (AS-PCR)检测体系,以间接判断对利福平(RFP)与异烟肼(INH)的耐药性.方法用AS-PCR技术同步检测58株MTB临床分离株rpoB基因516位、526位和531位,katG基因315位及inhA基因-15位密码子突变,并与DNA测序结果进行比对.结果 AS-PCR法对RFP耐药株检出率为95.1％ (39/41),其中rpoB 基因531位、526位、516位点突变分别检出28株、10株、2株,包括531位与526位联合点突变1株；未检出突变的2株RFP耐药株经测序验证1株未发生突变、1株发生533位点突变；RFP敏感株均未检测到突变.AS-PCR法对INH耐药株检出率为86.5％(45/52),其中katG基因315位点突变43株、inhA基因-15位点突变2株,未检出突变的7株INH耐药株经测序验证未见突变；INH敏感株均未检测到突变.结论等位基因特异性PCR能够快速检测MTB常见突变基因,具有较高的敏感性与特异性,快速经济、操作简便.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2013(031)004【总页数】4页(P249-252)【关键词】结核分枝杆菌;rpoB基因;katG基因;inhA基因;等位基因特异性扩增【作者】彭婉婵;刘文恩;谭耀驹;胡可;蔡杏珊;胡族琼;李艳冰【作者单位】中南大学湘雅医院检验科,长沙410008;中南大学湘雅医院检验科,长沙410008;广州市胸科医院检验科,广州510095;中南大学湘雅医院检验科,长沙410008;广州市胸科医院检验科,广州510095;广州市胸科医院检验科,广州510095;中南大学湘雅医院检验科,长沙410008【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1;Q503传统药敏试验(绝对浓度法和比例法)是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)耐药性检测的金标准，方法成熟可靠，但繁琐、耗时，难以满足临床对耐药结核病诊治的需求。

结核分枝杆菌的耐药性检测方式【摘要】在应用抗结核药物医治结核病时，最为临床医师所关注的是细菌产生的耐药性。

因为结核分枝杆菌对医治药物不可幸免的产生耐药性，而阻碍肺结核病的医治成效。

以致成难治型肺结核。

【关键词】抗结核药物耐药性检测为使抗结核药物对肺结核病的医治取得预期成效，在应用药物医治之先，需要了解几个问题：一、试管内的抑菌浓度把抗结核药物加入培育基内，接种细菌以观看药物在多少浓度下能够抑制细菌生长，求出最小的抑菌药物浓度(MIC)，MIC是临床确信医治药物剂量的依据。

有关抗结核药物的MIC，请见短程化疗的细菌学基础。

应用不同培育基所测得的抑菌浓度有不同。

如在改良罗氏培育基测得的抑菌浓度比液体培育基或半流体培育基测得的抑菌浓度偏高。

细菌在发育生长旺盛期对药物灵敏，当细菌处于发育生长静止状态以致处于休眠期那么药物不呈现抑菌成效。

依据细菌发育生长的兴衰时期，组成肺结核病医治的基础。

二、血液内的药物浓度血液内抗结核药物浓度测定是研究药物在机体内的吸收与排泄，疗效与毒性的关系，体液内药物含量、散布、对细菌的有效抑菌浓度等。

可确信药物有效医治剂量与用药次数等。

由于结核病类型和发病部位不同，病变性质不同，有的药物吸收比较快、有的药物吸收比较慢。

有的体液内含药物浓度比较高，有的体液内含药物浓度比较低。

即便在相同的药物医治条件下，各器官、组织内的含药物浓度不尽相同，其间的不同是比较大的。

因此，血液内药物浓度的测定，在抗结核药物医治前和医治中均应进行药物浓度测定，以了解个体的药物代谢规律。

对某些病例而言，能够起到抗结核药物医治成效的监控作用。

一样规律。

肌内注射法给药吸收比较快、口服法给药吸收比较慢。

肌内注射法后30～60min，口服法后1～2h，血液内药物浓度即显现顶峰曲线。

内科研究室用生物学方式，观看链霉素肌注后，药物在体内的吸收，排泄的规律性，提供的技术资料为肺结核病的医治确信誉药剂量和给药次数等以供参考。

结核杆菌及其耐药性快速检测一、结核杆菌及其检测方法介绍结核分枝杆菌，又被称作结核杆菌，它是引发结核病的病原细菌。

主要通过呼吸系统结核患者传播，能够侵犯全身各个器官，最常见的为肺结核。

根据世界卫生组织的估算，全球每年增加的结核病人大约在800万左右，死于结核病的人大约在300万左右，全世界人口的三分之一，也就是大约17亿人曾经感染过结核杆菌。

在发展中国家，目前结核病的发病概率依然在持续地上升，在发达国家的病人也是有所上升的，比较常见于高危人群中（比如慢性酒精中毒的人、感染过HIV的病人、滥用药物的人以及无家可归的人）。

在控制结核的过程中，建立敏感、快速、特异的检测结核杆菌的手段具有非常重大的现实意义。

直到目前为止，结核的诊断依然主要依靠透视检查、临床症状、痰标本镜下检查、结核菌素试验或者痰标本结核杆菌培养等。

通过临床症状以及透视检查不能够发现早期的结核病人，并且特异性不是很强；结核菌素试验的特异性不是很强，阳性也只能说明在以前有否暴露在分枝杆菌下；痰标本镜检的敏感性和特异性也不能达到要求；培养的方法来分离结核杆菌是判断结核的重要标准，但是常规的培养方法需要的时间比较长，一般需要几个周的时间。

近年来，结核杆菌（包括牛型、人型、非洲型）在快速检测方面取得了快速的发展，主要包括基因扩增技术和改良液体培养方法。

建立准确、快速的耐药性检测方法，能够有效指导并制定科学合理的治疗方式，及时判断治疗是否成功，并且是否产生了耐药性，也有利于展开大规模的结核杆菌的耐药性调查。

之前基于培养方法来检测结核杆菌的耐药性，耗时比较长，并且结果不一定准确，这些年来，耐药性的快速检测方法已经取得了较大的进展，大体包括：噬菌体检测方法、改良液体培养方法以及基因检测方法等。

二、结核杆菌的快速检测方法（一）改良液体培养方法这些年来，已经建立了多种多样的改良液体培养方法，大大缩短了培养所需要的时间，这类的试剂盒包括了Bactec 9000MB、Bactec 460TB以及MGIT等。

肺结核属于肺部慢性传染疾病，临床发病率高，该病的主要致病菌为结核分枝杆菌，病程相对较长，会向全身多个脏器累及。

菌阴肺结核指的是通过一次结核杆菌培养以及三次痰涂片检查，结果均显示为阴性的肺结核患者，具有较低的传染性。

大多数患者不了解菌阴肺结核的相关性知识，如果没有采取及时有效的诊断、治疗，患者的病情就会延误，继而转变为阳性，对患者的预后造成不利影响。

目前，临床中对于菌阴肺结核的特异性诊断措施相对缺乏，最常用的方法就是痰或呼吸道采集标本中结核分枝杆菌的检验。

近年来，结核病的发病率及死亡率呈现逐年上升的趋势。

筛选出一种能有效确诊早期结核病的检验方法十分重要。

目前临床上应用于辅助结核病诊断的检验方法以结核分枝杆菌培养和抗酸染色涂片为主，其中培养法作为结核疾病诊断的金标准具有准确性高、特异性高的优势。

结核分枝杆菌痰的分离培养，消耗时间较长，如果利用固体改良罗氏培养基进行培养，一般会需要至少20d，最长可需要60d，如果使用先进的全自动分枝杆菌进行检测，至少需要7d，至多需要20d。

实验室一般会通过痰涂片法进行检测，该方法的操作相对简单，价格较低，但是，操作费时，在基层痰检实验室涂片量过大的时候，一天内无法得到实验结果，这种现象无法满足目前的结核病防治工作。

近些年来，随着染色技术的逐渐先进，荧光染色技术作为新型的实验手段，已经在医学科学领域中广泛应用。

目前，涂片染色法已经成为无菌体液的主要检查方法，但是，通过传统制片以及染色法的检出率相对较低，误诊率以及漏诊率较高。

主要是因为染色时制片以及标本固定环节容易出现误差，而细胞沉淀仪法、改良的抗酸染色法、萋-尼氏抗酸染色法、金胺O荧光染色法、PCR等技术的应用越来越多。

传统方法：获取痰标本后，排除口水痰，然后纳入研究范围，确认纳入的当天，需要在每份痰标本相同位置，取两份，制成痰涂片。

离心处理标本，再在洁净的玻片上涂抹沉渣，涂完一层之后，使其自然干燥，再次涂抹，形成厚涂片，先使用萋尼抗酸染色法进行染色，随后使用石炭酸复红溶液初染，再使用盐酸酒精脱色，然后用美兰复染，寻找红色区域，待涂片干燥后置于显微镜镜检，于蓝色背景中寻找红色的杆状、分枝状细菌。