链霉亲和素-生物素化学发光免疫分析血清胰岛素方法建立及临床应用

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链霉亲和素商品化应用简介一、链霉亲和素性质链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。

链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其氨基酸组成中，甘氨酸和丙氨酸的含量较大，而且结合生物素的活性基团也是肽链中的色氨酸残基；链霉亲和素是一种稍偏酸性（pH6.0）的蛋白质，并且不带任何糖基。

链霉亲和素分子中每条肽链都能结合一个生物素，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数（K）亦为1015L／mol。

在蛋白水解酶作用下，链霉亲和素可在N端10～12和Ｃ端19-21间断裂，形成的核心链霉亲和素仍然保持完整的结合生物素的能力。

链霉亲和素的活性单位也是以结合1μg生物素所需的量来表示，１mg链霉亲和素的最高活性可达18U。

二、亲和素和链霉亲和素的比较相同点1、生物素结合能力：AV：13~15U，SA：14~18U2、活性中心依赖于色氨酸-懒氨酸：亲和素在氨基酸序列的70-70和110-111两个位点有色氨酸-懒氨酸，链霉亲和素在氨基酸序列的79-80和120-121两个位点含有色氨酸-懒氨酸。

不同点：1、分子量：AV=66KD, SA=54KD2、等电点：AV=10.5, SA=6.0, AV带正电较多，非特异性结合较强。

3、位阻效应：SA的生物素结合位点较AV深，位阻效应较强，长臂生物素更适合。

4、生物素的结合：AV随机结合，SA协同结合。

5、氨基酸序列：AV含二硫键和10%糖，SA含甘氨酸丙氨酸较多，无糖和二硫键。

三、链霉亲和素在ELISA中的应用酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。

根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

第十三章免疫组织化学技术免疫组织化学技术又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。

第一节概述免疫组织化学的基本过程包括：①抗原的提取与纯化；②免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化；③将标志物与抗体结合形成标记抗体；④标本的处理与制备；⑤抗原抗体免疫学反应以及标志物呈色反应；⑥观察结果。

一、标本的处理（一）标本的主要来源1.活体组织：应取材于病变组织及病变与正常组织交界处，大小适中。

减少对组织标本的损伤与挤压。

2.体液、穿刺液：可直接涂片或经离心后取沉淀物涂片。

3.培养细胞：悬浮培养的细胞经离心沉淀后做细胞涂片，盖玻片上的单层培养细胞直接固定。

（二）标本的固定与保存1.标本固定的目的：使细胞内蛋白质凝固，细胞内分解酶反应终止，以防止细胞自溶，保持细胞形态和结构；保存组织细胞抗原性；防止标本脱落；除去妨碍抗体结合的类脂，便于保存；抑制组织中细菌的繁殖，防止组织腐败和在后续组织制备中的细胞结构和成分的改变。

标本的固定应以不损伤细胞形态，不干扰固定后抗原的识别和结合为原则。

2.固定剂的选择：蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；如需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用10%福尔马林固定或以微火加热固定；如有黏液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。

组织标本常规固定液为中性缓冲甲醛。

3.制片方法的评价：冷冻和石蜡切片是免疫组化最常用的制片方法。

首选冷冻切片。

其操作简便，可避免石蜡切片因固定（甲醛）、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，适用于不稳定的抗原。

石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，它不但是观察组织细胞结构的理想方法，而且可用在陈旧石蜡包埋材料免疫组化的回顾性研究。

华中科技大学硕士学位论文链霉亲和素-荧光藻胆蛋白的构建及在荧光免疫检测中的应用姓名：蔡芬芬申请学位级别：硕士专业：环境科学指导教师：赵开弘2010-12摘要荧光免疫检测技术在现实生活中应用日益广泛，遍及环境污染物监测、医学检验、食品检验等诸多领域，发展迅速。

本研究所涉及的生物素-链霉亲和素系统（BSA）是具有灵敏度高、特异性强和稳定性好的信号多级放大系统；同时藻胆蛋白的光学和物理性质非常符合新一代荧光免疫标记物的要求。

本研究以pUC57-sa质粒为模板，通过PCR反应扩增出目的基因片段sa，构建表达载体pETDuet-sa。

通过大肠杆菌异源表达，成功制备核心链霉亲和素，对其表达、活性和保存条件等方面进行研究，其分子量为59.2KD，理论活性为16.5u，实测活性16.3u，冻干后可以稳定保存。

将SA-CpcB、藻红胆素合成酶及藻胆蛋白裂合酶进行大肠杆菌体内共表达，得到融合色素蛋白SA-CpcB-PEB。

检测SA-CpcB-PEB的荧光活性，同时将其用于BSA 系统中进行荧光免疫检测，表明SA-CpcB-PEB同时具有藻胆蛋白的荧光特性和SA 与生物素结合的能力。

将SA-CpcB-PEB作为荧光探针应用于BSA荧光免疫检测体系检测微量物质，证实SA-CpcB-PEB作为荧光探针应用于荧光免疫检测体系具有实用意义。

通过研究温度、pH、抑制剂对SA-CpcB-PEB活性以及稳定性的影响，得到其适宜保存条件是4℃、终浓度为1mM EDTA、0.05﹪NaN3、pH为中性、20mM KPB、150mM NaCl的环境，有利于其具体应用。

关键词：荧光免疫荧光探针融合蛋白链霉亲和素藻胆蛋白AbstractFluorescence immunoassay is widely used by environmental pollutants monitoring, medicinal testing, food inspecting and other fields. In this research, Biotin-Streptavidin system(BSA) is a high sensitivity, good specificity and stability of multi-level signal amplification system. Phycobiliprotein could be applied to fluorescence immunoassay, as a new fluorescence probe.The Streptavidin gene was amplified by PCR from the plasmid of pUC57-sa and cloned by the transform of enzyme sites. Core Streptavidin was successfully constructed, and molecular weight is 59.2KD, theoretical activity is 16.5u, measured activity is 16.3u, can be preserved by lyophilized powder for long time.The fusion protein SA-CpcB-PEB was prepared by reconstitution SA-CpcB with PEB in vivo in E.coli. Tested the fluorescence and the property of binding with biotin of SA-CpcB-PEB, the results show that the fusion protein retained the two proteins’s bifunctional effects. By using SA-CpcB-PEB as a fluorescence probe to detect trace substances in BSA fluorescence immunoassay, we believed it can be used for fluorescence immunoassay.By studying the temperature, pH, different inhibitors on the activity and stability of℃the fusion protein SA-CpcB-PEB, got the better storage conditions is 4, 1mM EDTA, 0.05% NaN3, neutral pH, 20mM KPB, 150mM NaCl ,which is beneficial to the specific application.Key words：Fluorescence immunoassay Fluorescence probe Fusion protein Streptavidin Phycobiliprotein缩略词（Abbreviation）pair 碱基对bp baseDTT dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylenediamine tetracetic acid 乙二胺四乙酸coli 大肠杆菌E.coli EscherichiaIPTG isoprophyl thio-β-D-galactoside 异丙基硫代半乳糖苷Kan kanamycin 卡那霉素Amp ampicillin 氨苄青霉素Str streptomycin 链霉素Chl Chloramphenicol(chloromycetin) 氯霉素kD kilodalton 千道尔顿KPB potassium phosphate buffer 磷酸钾缓冲液ME β-mercaptoethanol β-巯基乙醇BSA Biotin Streptavidin System 生物素-链霉亲和素系统PEB phycoerythrobilin 藻红胆素PE Phycoerythrin 藻红蛋白SDS sodium dodecyl sulfate 十二烷基磺酸钠SDS-PAGE SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳三（羟甲基）氨基甲烷Tris tris(hydroxymethyl)aminomethanerpm revolution per minute 每分钟转数独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

人胰岛素定量测定试剂盒化学发光免疫分析法的建立及方法学评价陈超;彭波;李基【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2015(007)005【摘要】目的建立了一种定量测定人血清中胰岛素的化学发光免疫方法,并对其试剂盒性能进行方法学评价. 方法试剂盒采用双抗体夹心法,以磁微粒交联的单抗作为捕获抗体,碱性磷酸酶标记的单抗作为检测抗体,分别对本试剂盒的溯源性、参考范围、最低检测限、线性、准确度、精密性、分析特异性、抗干扰性、药物影响及样本比对方面进行评价. 结果用胰岛素NIBSC国际标准品(66/304)进行溯源,相关性方程为y=1.0335x +0.3349,相关系数r=0.999;建立了健康人群空腹血清胰岛素参考范围,覆盖2.5％～97.5％百分位数人群的参考值范围为1.59 μIU/mL～14.64 μIU/mL;对此方法建立的试剂进行了方法学评价,最低检测限可达0.08μIU/mL;线性在0μIU/mL～300 μIU/mL内,相关系数r=0.9999;精密性CV＜8％;准确度在±10％之内;当样本中的胰岛素浓度为200 000 μIU/mL时,未发现钩状效应;与Roche电化学发光系统测定结果显著相关,相关方程为y=0.9541x+0.177,相关系数r=0.9917,两种方法学的测定结果具有较高的一致性. 结论本研究建立的人胰岛素化学发光免疫分析定量检测试剂盒的各项性能指标均达到了临床检测要求,可用于临床血清胰岛素的检测.【总页数】5页(P313-317)【作者】陈超;彭波;李基【作者单位】上海科华生物工程股份有限公司,上海200233;上海科华生物工程股份有限公司,上海200233;上海科华生物工程股份有限公司,上海200233【正文语种】中文【相关文献】1.游离β人绒毛膜促性腺激素定量测定化学发光免疫分析法的建立与性能评价 [J], 伍华颖;王小艳;李志雄;董志宁;吴英松;徐伟文2.促黄体生成素定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)的临床性能评价 [J], 周颖;方婉仙;吴英松3.硫酸去氢表雄酮定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)的研制及性能评价 [J], 苏立;贾晨路4.总前列腺特异性抗原定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)的性能验证 [J], 方婉仙;李志雄;董志宁;李明;吴英松5.癌胚抗原定量测定试剂盒(化学发光免疫分析法)的临床性能评价 [J], 梁丽萍;李志雄;董志宁;李明;吴英松因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

(完整)胰岛素(Insulin)作业指导书胰岛素(Insulin)1.分析原理采用双抗体夹心法原理，整个过程18分钟完成。

·第1步:20µl标本、生物素化的抗胰岛素单克隆抗体和钌（Ru)标记的抗胰岛素单克隆抗体混匀，形成夹心复合物。

·第2步：加入链霉亲和素包被的微粒，让上述形成的复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。

·第3步:反应混和液吸到测量池中，微粒通过磁铁吸附到电极上，未结合的物质被清洗液洗去，电极加电压后产生化学发光，通过光电倍增管进行测定。

检测结果由机器自动从标准曲线上查出。

此曲线由仪器通过2点定标校正，由从试剂条形码扫入仪器的原版标准曲线而得。

2.标本要求血清：按标准常规方法采集。

血浆:肝素锂、EDTA-K3或柠檬酸钠抗凝.溶血有干扰，因为红细胞释放可降解胰岛素的肽酶。

标本在15－25度可稳定4小时,2－8度可稳定24小时，-20℃可稳定6个月。

只可冻融1次.含沉淀的标本使用前需离心.不要使用加热灭活的标本。

标本和质控品禁用叠氮钠防腐.标本、定标液和质控品在测定前应预温到室温；放入仪器后应在2小时内测定以避免蒸发的影响。

3.试剂、校准品、质控品和其他所需材料采用罗氏原装配套试剂。

试剂：M：链霉亲和素包被的微粒（透明瓶盖），1瓶，6。

5ml。

粒子浓度0。

72mg/ml，生物素结合能力： 470ng生物素/mg粒子。

含防腐剂。

R1：生物素化的抗胰岛素单克隆抗体（灰盖），1瓶，10ml，浓度高于1。

0mg/l，MES缓冲液0。

05mol/l，pH6。

0，含防腐剂。

R2：Ru(bpy)32+标记的抗胰岛素单克隆抗体(黑盖)，1瓶，10ml。

浓度1。

75mg/l，MES缓冲液0.05mol/l，pH 6.0含防腐剂.校准品(货号12017504)：Cal 1 低值定标液(白盖）,2瓶，1.0ml/瓶，胰岛素浓度约为5μU/ml，人血清,含防腐剂Cal 2 高值定标液(黑盖），2瓶，1.0ml/瓶，胰岛素浓度约为300μU/ml，人血清，含防腐剂质控品：Elecsys 通用质控品（PreciContorl Universal）1和2 ,货号11731416其他所需材料:Elecsys 2010、E170、E601或 E411分析仪Elecsys 2010和 E411分析仪需要：Elecsys 系统缓冲液（ProCell)货号11662988Elecsys测量池清洗液（CleanCell）货号11662970Elecsys 添加剂液（SysWash）货号11930346Elecsys 系统清洗液（SysClean）货号11298500Elecsys E170和 E601分析仪需要：Elecsys 系统缓冲液（ProCell）货号12135019Elecsys测量池清洗液(CleanCell）货号12135027Elecsys 系统清洗液（SysClean）货号112985004.仪器和校准使用仪器：瑞士罗氏诊断公司生产Elecsys 2010/E 170/E 601/E 411全自动电化学发光免疫自动分析仪仪器校准：每批Insulin试剂盒必须用新鲜试剂和Insulin Cal 1,Cal 2定标一次.另外，以下情况需要再次定标：Elecsys2010/E 170/E601/E 411：·一个月(同一批号试剂）· 7天（放置仪器上的同一试剂盒)各种分析仪均适用的情况：根据要求进行定标；如质控结果超出范围时；根据规定进行定标.5.操作步骤(以E 170为例）5。

链霉亲和素和生物素结合位点
链霉亲和素是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，具有四个与生物素（Biotin）亲和力极高的结合位点。

它是一种60-kDa的链霉菌avidinii细胞外蛋白，也是一种生物素结合蛋白，包含四个亚基，每个亚基都有一个生物素结合位点。

这种四聚体蛋白能与生物素形成非常稳定的复合物，因此，链霉亲和素在生物技术和医学研究中具有广泛的应用。

链霉亲和素与生物素的结合能力极强，这种结合具有高度的特异性和稳定性。

这种特性使得链霉亲和素在生物素标记技术中发挥了重要的作用。

例如，在免疫组织化学和免疫细胞化学中，链霉亲和素常被用作生物素化抗体的放大系统，通过链霉亲和素与生物素的结合，可以将生物素化的抗体与链霉亲和素连接在一起，从而增强信号的强度，提高检测的灵敏度。

此外，链霉亲和素还被广泛应用于蛋白质相互作用的研究。

通过将目标蛋白质与生物素标记，然后利用链霉亲和素与生物素的结合特性，可以方便地将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，从而实现对目标蛋白质的纯化和鉴定。

总的来说，链霉亲和素和生物素的结合位点为生物医学研究提供了强有力的工具。

这种结合具有高度的特异性和稳定性，使得链霉亲和素在生物素标记技术和蛋白质相互作用的研究中发挥了重要的作用。

随着科学技术的不断发展，链霉亲和素的应用领域还将不断扩大，为生物医学研究带来更多的可能性。

生物素-亲和素标记技术孔令青;李勇;高洪;严玉霖【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2008(29)4【摘要】生物素-亲和素系统(BAS)是一种具有高亲和力、灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点的信号放大标记技术,研究证明生物素与亲和素依靠接触表面均一的多层膜来维系其稳定的结合.随着不断的探索和研究,该技术现已发展出多种标记方法,例如桥-亲和素-生物素标记法、亲和素-生物素-过氧化物酶法、标记生物素-抗生物素法,由于该标记技术具有优秀的性质,因此很快渗透到多个学科,在细胞和抗原的定位和检测中体现出极其重要的作用.目前,BAS已广泛应用于免疫学、分子生物学和组织化学等领域,并取得较好的效果.文章对该技术的特点、方法和应用做了简述.【总页数】3页(P100-102)【作者】孔令青;李勇;高洪;严玉霖【作者单位】云南农业大学动物科学学院,云南昆明,650201;云南农业大学动物科学学院,云南昆明,650201;云南农业大学动物科学学院,云南昆明,650201;云南农业大学动物科学学院,云南昆明,650201【正文语种】中文【中图分类】R446.61【相关文献】1.链霉亲和素-生物素化学发光免疫分析血清胰岛素方法建立及临床应用 [J], 吴在荣;王宏锐2.外源性生物素对基于生物素-链霉亲和素化学发光技术干扰的研究进展 [J], 刘栋;仝慧;陈斌;张宁;胡健;王晓琴3.抗亲和素鼠单克隆抗体增强亲和素-生物素免疫技术和免疫组织学染色的敏感性[J], W.F.Cassano;张红毅4.用亲生物素蛋白-生物素酶标法对植物凝集素亲和乳腺癌的初步观察 [J], 卢百川;黄泰安;贺晓英5.不同生物素检测系统在核酸分子杂交检测中的应用——Ⅲ 链霉亲和素-碱性磷酸酶标记生物素检测系统 [J], 刘钟瑸;杨秋霞;王丽群;赵玉莹;康洋;杨贵贞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。