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反相高效液相色谱法测定环孢素A血药浓度

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反相高效液相色谱法测定环孢素A血药浓度张剑1,李海洋2,关琪1,王睿1(1.沈阳医学院奉天医院检验科,辽宁沈阳110024;2.东北制药总厂制剂一公司)[摘要]目的:建立反相高效液相色谱法测定环孢素A(Cs A)的方法。

方法:采用Spher i so rb C8型色谱柱,以环孢素D(C s D)为内标,甲醇一水(75:25,V/V)为流动相,柱温60 ,检测波长为214n m。

结果:本法C s A和CsD分离度R=1.608大于1.5,分离效果理想。

Cs A的浓度在27~864ng/m l内线性关系良好,其中r=0.9992。

日内及日间精密度<5%(n=4)。

结论:本法经济、准确,易于普通实验室展开,能够较好的满足临床血药浓度监测的需要。

[关键词]高效液相色谱法;环孢素A;监测[中图分类号]R94 [文献标识码]B [文章编号]1008-2344(2006)02-0118-02RP HPLC D eter m i n ati o n of C yclosporine A in BloodZ HANG Jian1,LiH a i yang2,GUAN Q i1,WANG Ru i1(1.Depart m en t ofC li n i ca lLaborat ory,Fengti an H osp i talA ffiliat ed to ShenyangM ed i cal College,Shenyang110024,C h i na;2.The First Co m pany of Phar m aceuti cal Preparati on A ffili ated to Nort heast Gen eral Phar m aceu tical Fact ory)[Ab stract]O b ject i ve:T o estab lish A HPLC m ethod for screen i ng Cs A.M e thods:C8co l u mn was used i n our m ethod,Cyc l ospor i ne D w as used as the interna l standard.T he mob ile phase cons i sted of m ethano l wa ter(75:25,V/V).T he co l u m n te m pera t ure w as m ai n ta i ned at60 ,The de tector was UV 214n m.Re s u lts:The C s A and Cs D w ere separated co m plete l y.A good li near re l ationsh i p w as obta i ned bet ween the concentration o f Cs A fro m27ng/m l to864ng/m1,r=0.9992.W ithin day and bet ween day var i ation w ere less than5%.Conc l u sion:The m ethod i s cheap,si m ple,accurate and s u itable for t herapeuti c durg m onito ri ng.[K ey words]H PLC;Cs A;mon it o ri ng环孢素A是一种强有力的免疫抑制剂,已广泛应用于器官移植后的抗排异反应。

由于其血药浓度与疗效和毒副作用密切相关,而且个体差异大,因此血药浓度监测对维护患者的最佳免疫抑制水平至关重要。

目前测定Cs A血药浓度的方法有:放射免疫测定(R I A)、荧光偏振免疫分析(FPI A)、高效液相色谱法(H PLC)等,前两者易受代谢物影响而发生交叉反应[1]。

因此,我们用RP H PLC法对器官移植患者术后CsA的全血浓度进行监测,并对色谱条件、提取方法等进行了研究和改进,使其能较好地满足临床的需要。

1 材料与方法1.1 仪器与试剂 美国W aters公司提供的1525高效液相色谱仪,包括W aters2487紫外可见检测器,B reeze色谱数据处理软件。

环孢素A(含量99.8%)、环孢素D(含量80%)标准品均由华北制药厂提供。

甲醇为色谱纯,乙醚、正己烷等均为分析纯。

1.2 标准液的配制 精密称取Cs A标准品21.6m g,用甲醇定容至100m l容量瓶中,配制成216 g/ m l的Cs A对照品贮备液,使用前用甲醇稀释成Cs A 标准液21.6 g/m,l2.7 g/m;l精密称取C s D标准品1.77m g用甲醇定容至100m l容量瓶中,配制成14.16 g/m l的CsD对照品贮备液。

置冰箱冷藏中备用。

1.3 色谱条件 色谱柱:Spherisorb C8(大连依利特仪器有限公司);流动相:甲醇 水(75:25,V/V);流速:1m l/m in;检测波长:214n m;柱温:60 。

1.4 血样处理和测定方法 将抗凝全血检样超声处理30s后,精密量取0.5m l置10m l具塞玻璃离心管中,用微量注射器加入C s D内标物(14.16 g/ m1)10 ,l涡流30s,加入2m l0.1m o l/L盐酸,分析纯乙醚5m,l涡流1m i n,振荡5m in,离心5m i n (3000r/m in),吸取乙醚层于10m l具塞离心管中,乙醚管中加入2m l0.1m o l/L氢氧化钠,涡流1 m i n,振荡5m i n,离心5m i n(3000r/m in),吸取乙醚层,置40 水浴中,在氮气流下挥发掉乙醚,残留物加正己烷100 ,l流动相60 ,l涡流30s。

离心2 m i n,下层液为样品溶液。

取下层液l O l进样。

以!118!沈阳医学院学报 Journa l o f Shenyang M edical Co ll ege 第8卷 第2期 2006年6月环孢素A和内标环孢素D峰面积比为定量计算依据,计算全血中Cs A的含量。

2 结果2.1 色谱行为与色谱峰定性 在上述色谱条件下,色谱分离,环孢素A保留时间为8.380m i n,内标环孢素D保留时间为9.988m i n。

相同条件下,空白血样色谱分离,血中杂质对Cs A的分离无干扰。

经计算Cs A与内标C s D的分离度R=1.608,大于1.5,所以Cs A与内标C s D可完全分离。

2.2 线性关系及检测限 取空白全血0.5m,l分别加入一定量的Cs A贮备液,使浓度分别为27,54, 108,216,432,864ng/m1,再分别加入内标10 ,l按血样处理和测定方法进行测定,以峰面积比对血药浓度作回归分析,回归方程为:Y=286.2954X-16.4402(r=0.9992,n=6)。

可见环孢素A全血浓度在27~864ng/m l范围内线性关系良好,最低检测限为15ng/m l。

2.3 方法回收率及精密度 取空白全血0.5m,l分别加入一定量CSA贮备液,使浓度为54,108,864 ng/m,l按上述血样处理方法进行处理,进行日内、日间精密度及回收率测定,结果见表1。

表1 方法回收率及精密度浓度(ng/m1)回收率(%)RSD(%)日内(n=4)5493.95∀3.053.210899.98∀2.581.986499.98∀0.620.4日间(n=4)5491.80∀4.944.810898.92∀3.342.7864100.19∀1.831.23 讨论目前国内外对CsA全血样品的处理方法有液 液萃取结合固相富集或经多次萃取,操作繁琐、试剂复杂,且固相萃取中SPE小柱价格昂贵保养活化过程繁琐。

也有应用NaF来除杂质,但有文献报道N a F量不易把握且提取时易乳化[2]。

本法利用强酸强碱去除大部分内源性杂质,再经正己烷进一步除去脂溶性杂质后进样,简化了操作,结果准确,回收率高,精密度良好。

文献报道流动相以三元、四元流动相体系为多,但其都含有毒性较大且价格昂贵的乙腈溶液。

本法采用了甲醇 水(75:25,V/V)为流动相不仅经济、毒性小而且溶液配比简单不易改变,色谱峰峰对称, C s A与C s D分离效果良好。

国外报道测定C s A的H PLC法一般柱温达75 [3],国内己报道的最低测定温度65 。

有人报道柱温在70 ~75 时,色谱柱仅能维持2~4周[4]。

此外,柱温过高流动相易气化,基线不稳,影响检测结果,但柱温过低(<60 )Cs A与内标难以完全分离,峰型不佳,保留时间过长[5]。

所以本法选取柱温为60 ,已完全能将Cs A与内标CsD分离,而且峰形较理想,更利于延长色谱柱的使用寿命,减少测定费用。

C s A在C18色谱柱上的保留时问较长,一般在l O m in左右,C N色谱柱对Cs A、CsD的分离效果差[5]。

本法选取极为常用的C8色谱柱,保留时间适宜,一般在6~9m i n[6],缩短了测定周期,节省了试剂。

经过实验证明:我们建立的以CsD为内标应用H C l、Na OH/E t20液 液多步萃取法提纯血样;Spheri sorb C8色谱柱;60 柱温;甲醇 水(75:25,V/V)为流动相;检测波长214nm;流速l m l/m i n的色谱条件下进行测定C s A的全血浓度的方法,更为经济、准确,方法相对简单,为临床用药提供了更有利的理论依据。

参考文献:[1]刘定勇,邹远高,梁茂植,等.改良高效液相色谱法监测肾移植患者环孢素A的全血浓度[J].华西医科大学学报,1995,26(4):455.[2]李克,王平,袁倚盛,等.单步萃取 反相高效液相色谱法测定人全血中环孢素A及其药动学参数[J].中国药学杂志,1997,32(3):175.[3]PO I RIER J M,LEBOT M,CHEY M OL G.C yclospori ne i n w holeb l ood:D rugm on iteri ng d ifficu lties and presentation of a reli ab le norm al ph ase li qu i d ch ro m at ographic assay[J].Thera D rug M on i t,1994,16(4):338-94.[4]郭平,李屯,廖工铁,等.环孢素临床药代动力学研究进展[J].中国药学杂志,1995,30(10):311.[5]孙言才,屈建,宋宇红,等.反相高效液相色谱法测定全血中环孢素A[J].安徽医药,2002,6(3):31.[6]刘滔滔,钟小斌,唐平,等.高效液相色谱法监测肾移植患者环孢素A的全血浓度[J].广西医科大学学报,1999,16(3):311.[收稿日期]2006-01-13!119!第2期张剑等 反相高效液相色谱法测定环孢素A血药浓度。

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反相高效液相色谱法测定全血中环孢霉素A

反相高效液相色谱法测定全血中环孢霉素A

反相高效液相色谱法测定全血中环孢霉素A孙言才;屈建;宋宇红【期刊名称】《安徽医药》【年(卷),期】2002(006)003【摘要】目的建立一种全新的反相高效液相色谱法(RP-HPLC法),用于测定全血中环孢霉素A(CsA).方法在甲醇-乙腈-水体系中,研究影响CsA测定的诸条件:流动相的组成、柱温的降低及内标物的选择等;提出RP-HPLC法测定CsA的新方法:于C18柱上,用含0.002 5 mol@L-1LiSO4的甲醇-乙腈-水(16:66:18,V/V)为流动相,以环孢霉素C(CsC)为内标物,在50℃柱温下,于218 nm处检测.结果CsA线性范围25～1 600μg@L,最低检测浓度10 μ-g-L,回收率100.21%,日间和日内变异系数均小于6.0%;全血中CsA线性范围25～1 600μg@L-1,最低检测浓度10μg@L-1,回收率90.14%,日内和日间变异均小于9.0%.结论本法具有简便、灵敏、快速、线性范围宽、稳定性好、柱温低的特点,可广泛用于临床血药浓度监测.【总页数】3页(P31-33)【作者】孙言才;屈建;宋宇红【作者单位】安徽省立医院药剂科临床药学研究室,合肥,230001;安徽省立医院药剂科临床药学研究室,合肥,230001;安徽省立医院药剂科临床药学研究室,合肥,230001【正文语种】中文【中图分类】R97【相关文献】1.反相高效液相色谱法测定全血环孢霉素A的含量 [J], 孙祥德;高革;齐伟;司予北;张金莲2.反相高效液相色谱法测定环孢霉素A全血浓度 [J], 秦伟;颜梅3.反相高效液相色谱法测定人全血中环孢素A浓度 [J], 王荣荣;徐咏;陈花花4.用LC/LC-UV系统建立全血中环孢霉素A自动化测定方法 [J], 谷利民;肖轶雯;彭真;李焕德;王峰5.高效液相色谱-质谱联用测定全血中环孢霉素A含量 [J], 王彬;李翔;柴逸峰;张国庆因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

反相高效液相色谱法测定全血环孢素A浓度

反相高效液相色谱法测定全血环孢素A浓度

表" 加入量 . /0 1 23 4 ’#( )! #*+( ++ "*)( )! ,#+( ++ -")( )! # ’’*( ** !# $%& 提取回收率 !"
!""# 年第 $% 卷第 # 期
提取回收率 . 7 4 )’( *6 ),( "! ))( ’),( )6 )’( )) ))( +#
对器官移植患者常用的药物强的松、 硫唑嘌呤在同样条件下 进样， 保留时间分别为 "( *# 2@/ 和 #( !" 2@/， 不干扰 $%& 检测。 全血浓度监测 !" ’ ()* 其中肾移植 #6 例， 对 "’ 例器官移植患者行 #!* 次血浓度监测， （-+*( -, 5 +’6( 6’） 肝移植 ) 例， 年龄 . +6( * 5 #"( ! 4 岁， 峰浓度 /0 1 23， （"")( "’ 5 #,,( -! ） 谷浓度 。 峰 浓 度 以 肝 移 植 为 主 ， 范围为 /0 1 23 谷浓度以肾移植为主， 范 围 为 )"( ) D "’,( ) D # -+)( 6 /0 1 23， -"!( ’ /0 1 23。 ! 讨论 广泛分布于所有血液组分中， 红细胞最多， 占 $%& 亲脂性较强， 血浆次之， 占 ++7 D ,!7 。 温度直接影响 $%& 对红细 ,#7 D ’-7 ， 使得 $%& 在血浆或血清 胞的亲和力及 $%& 与血浆蛋白的结合率， 中的浓度会因温度、 贮藏或处理条件的不同而改变， 因此测定全血 样本是必要的 G " H + I ， 以提高检测的稳定性和灵敏度。 张毕奎等 G , I 采 用单步萃取进行样品前处理， 干扰杂质较多， 灵敏度和回收率较 低。 笔者采用多次萃取处理， 可提高 $%& 抽提效率， 增加方法的灵 敏度和准确性， 净化样品， 去除杂峰干扰。 使用重蒸乙醚非常关键。 笔者开始并未采用重蒸乙醚， 致使干 扰峰特别多， 以致测定无法进行， 后来发现杂峰大多来自乙醚， 经 重蒸后杂峰消失。 在酸性条件下用正己烷洗涤 $%& 不溶于正己烷， 乙醚提取物， 能够去除乙醚提取物中脂溶性干扰物， 纯化样品。 文献 G + H , I 报道 $#- 柱需要 !* D 柱温对 $%& 测定影响较大。 笔者观察了温度对 $%& 和 $%8 色 !’J 柱温方能获得较好的柱效。 谱行为的影响： 升高柱温， 保留时间稍有减少， 但峰形和分辨率改 善有显著意义； 柱温太高又会大大缩短色谱柱寿命。 笔者发现 ’’J 柱温就能获得满意的峰形和分辨率， 从保护色谱柱出发， 确定柱温 为 ’’J 。 该色谱条件可获得较为理想的分离效果， 不受内源性杂质 干扰， 对称因子为 #( *+" ， 系统适应性良好。 $%& 理论板数为 # *"- ， 样品上柱运行时间不能少于 #* 2@/， 因为在 -( ,9 6( )9 #"( + 2@/ 时 各有一个内源性杂质峰， 测定时应避开。 经临 床 "’ 例器官移植 患者 #!* 次全 血 $%& 浓 度监测证 实， 灵敏度高、 柱温低、 回收率高、 结果准 KL H =L3$ 法具有稳定性好、 确的特点， 可广泛用于器官移植患者 $%& 血浓度监测。 参考文献：
HPLC法测定MDS患者口服环孢素A胶囊的血药浓度

HPLC法测定MDS患者口服环孢素A胶囊的血药浓度

HPLC法测定MDS患者口服环孢素A胶囊的血药浓度于宏伟;戴永健;李萍;武卫【期刊名称】《南京军医学院学报》【年(卷),期】2003(025)001【摘要】目的:建立反相高效液相色谱法测定环孢素A(CsA)血药浓度.方法:色谱柱:Kromasil-C18(5μm,4.6 mm×250mm),流动相:乙腈-水(80:20),流速:1.4ml/min,柱温:70℃,波长:215 nm.结果:全血最低检测浓度为10 ng/ml,CsA血药浓度在46～1 472 ng/ml范围内与峰面积有良好的线性关系,平均回收率(95.16±3.87)%,日内CV≤6.8%,日间CV≤9.6%(n=5).结论:方法简便、快速、准确,可用于CsA的药代动力学研究.【总页数】3页(P7-9)【作者】于宏伟;戴永健;李萍;武卫【作者单位】南京军医学院训练部,江苏,南京,210099;南京军医学院药剂学教研室,江苏,南京,210099;南京军医学院第三综合实验室,江苏,南京,210099;南京军医学院第三综合实验室,江苏,南京,210099【正文语种】中文【中图分类】R979.5:R912【相关文献】1.RP-HPLC法测定全血中环孢素A的血药浓度 [J], 叶雪梅;周晓洁;王志强2.HPLC对30例肺结核患者口服利福平胶囊的血药浓度监测 [J], 闫锋;刘荣;王仲元;陈红兵;仲斌3.HPLC法测定环孢素胶囊中环孢素及降解产物的含量 [J], 刘浩;仇士林4.HPLC法测定环孢素A(CsA)的血药浓度 [J], 陈琼;陈琴华;石巧娟5.HPLC法测定血瘀证患者口服川芎丹参煎剂后阿魏酸血药浓度 [J], 孙世仁;黄熙;任平;张莉因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

免疫抑制药的药物浓度检测原理及方法

免疫抑制药的药物浓度检测原理及方法

免疫抑制药的药物浓度检测原理及方法目前常用的免疫抑制药包括环孢素A和他克莫司等，具有免疫抑制作用，广泛用于器官移植后排斥反应和某些自身免疫性疾病的治疗。

由于该类药物有效浓度和中毒浓度接近，且生物利用度和药动学的个体差异大，药物的吸收和代谢速率在不同的疾病状态、器官移植类型及年龄上存在很大个体差异。

因此，应监测免疫抑制药物血药浓度，以便及时调整给药剂量，保证用药安全和有效。

一、环孢素A高效液相色谱法测定环孢素A血药浓度如下：1.原理全血破碎红细胞后用乙醚将环孢素A（cyclosporin A）提出，蒸干提取液，用流动相及正己烷重溶解后，进行高效液相色谱（HPLC）分析测定。

2.试剂与仪器（1）仪器：Hp1090M高效液相色谱仪。

（2）试剂：标准品环孢素A，内标环孢素D，乙醚，乙腈，甲醇，异丙醇，氟化钠及正己烷等。

环孢素A标准贮存液（1mg/ml）的配制：称取环孢素A 0.1g溶于100ml甲醇中。

内标贮存液（1mg/ml）配制：取环孢素D 0.1g溶于100ml甲醇。

内标应用液用甲醇稀释内标贮存液为10μg/ml。

（3）色谱条件：分析柱Spherisorb C18 4.6mm×200mm （7μm）不锈钢层析柱，流动相：乙腈∶水∶甲醇∶异丙醇按57∶18∶25∶1.5的比例配成。

进样量20μl，柱温65℃，流速1.4ml/min，检测波长为208nm。

3.操作取全血2ml加入16μl环孢素D内标液（10μg/ ml）及约1g氟化钠，漩涡混合30秒后加入乙醚5ml，振荡2.5分钟，离心（4000r/min），移取有机层4ml于另一试管，50℃空气流中吹干。

残渣中加入流动相150μl及正己烷400μl重溶解，取20μl进样。

环孢素A与环孢素D保留时间分别约为4.6分钟及5.5分钟。

4.计算以标准管环孢素A和环孢素D（内标）面积比及相应环孢素A浓度，建立回归方程。

根据待测标本的面积比，用上述方程求出标本中环孢素A浓度。