酶的分离纯化过程中的沉淀分离技术

酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。

首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。

关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。

这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。

这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。

酶的来源多为生物细胞。

生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。

因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。

由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。

目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。

从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。

由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。

酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。

第一章沉淀分离技术1.1沉淀的目的1)通过沉淀达到浓缩的目的。

2)通过沉淀、固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分3)沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理1.2沉淀法的概念沉淀法是指采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的欲提取的成分呢和其他成分分开的技术。

1.3沉淀法操作步骤1)加入沉淀剂2)沉淀剂的陈化促进粒子的生长3)离心或过滤、收集沉淀物PS：陈化是指将有沉淀的溶液静置,使沉淀中的分子等有归律的排列,并排列紧密,还有使沉淀聚沉,颗粒变大1.4沉淀过程应当考虑的问题1)沉淀能否发生2)沉淀剂或沉淀条件下对活性结构是否有破坏作用3)沉淀剂是否容易除去4)沉淀剂是否对人体有害1.5蛋白质的分离提取1.5.1优缺点优点：设备简单，成本低，原材料易得，便于小批量生产缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质，或含有大量的盐类，或包裹着溶剂，产品纯度常比结晶法低，过滤也较困难。

1.5.2沉淀法分离蛋白质的特点1)生产前期可使原料液体体积很快减小10~50倍，从而简化生产工艺、降低生产费用；2)使中间产物保持在一个中性温和的环境；3)可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；4)用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色谱分离使用的限制因素降低到最少。

1.5.3蛋白质的溶解特性1)蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、构象以及分子周围的环境所决定。

2)蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。

3)一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大分子蛋白质更易溶解。

1.5.4蛋白质胶体溶液的稳定性1.5.4.1防止蛋白质凝聚沉淀的屏障1)水化层：蛋白质周围的水化层可以使蛋白质形成稳定的胶体溶液2)电荷：蛋白质分子间的静电排斥作用1.5.4.2颗粒间的相互作用1)蛋白质分子间的静电斥力2)范德华力1.6蛋白质的沉淀方法1)中性盐盐析法2)等电点沉淀法3)有机溶剂沉淀法4)非离子型聚合物沉淀法5)聚电解质沉淀法6)金属沉淀法等1.6.1中性盐沉淀法1.6.1.1概念在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。

木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法木瓜蛋白酶（papain）是一种天然的蛋白酶，广泛应用于食品、制药等行业中。

其提取与分离纯化的方法可以分为以下几个步骤：1.选择合适的木瓜品种：不同品种的木瓜蛋白酶活性不同，因此选择具有较高酶活性的木瓜品种对提取纯化效果至关重要。

2.酶源准备：将选好的木瓜切成小块，去掉果肉，保留果实中的细胞浆和硬实质。

然后将木瓜块浸泡于缓冲液中，以提取木瓜蛋白酶。

3.离心分离：将浸泡木瓜块的混合液进行离心分离，以去除果肉等杂质，得到较为纯净的木瓜蛋白酶液。

4.澄清液处理：将离心分离得到的液体通过滤纸或滤膜进行澄清，去除悬浮的固体颗粒。

5.蛋白酶的分离：通过离心、超滤、透析等手段，将木瓜蛋白酶与其他蛋白质分离，得到较为纯净的蛋白酶液。

6.结晶纯化：可以采用醇沉淀、浓缩、结晶等方法对蛋白酶进行纯化。

其中，醇沉淀方法是常用的分离纯化方法之一，通过醇的添加，使蛋白酶蛋白质聚集并沉淀下来，然后进行洗涤、溶解等操作，最终得到纯净的木瓜蛋白酶。

7.洗脱：将获得的木瓜蛋白酶溶解于缓冲液中，使其达到所需的适宜酶活性和稳定性。

8.酶活性测定：用适当的方法测定提取分离纯化后的木瓜蛋白酶的活性，以确定其纯化程度和活性。

需要注意的是，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化过程中，应注意保持温度、pH值等参数的控制，以防止酶的失活或蛋白质的降解。

同时，在纯化过程中需要使用无菌操作，以防止细菌、病毒等污染物的引入。

总结起来，木瓜蛋白酶的提取与分离纯化的方法包括酶源准备、离心分离、澄清液处理、蛋白酶的分离、结晶纯化、洗脱和酶活性测定等步骤。

通过合理的步骤设置和操作，可以得到较为纯净、高活性的木瓜蛋白酶，以满足工业和科研的需求。

Chapter 3 酶的分离与纯化我们要研究或使用一种酶，首先要采用相关方法先得到它，因此酶的分离与纯化是酶的生产、应用及酶学性质研究的基础。

Section 1 酶制剂的制备过程一个完整的酶制剂制备方案应该包括：酶活力测定体系的建立、材料的选择、材料的预处理、酶的酶学性质初步研究、酶的分离与纯化、酶制剂的保存。

一、材料的选择注意把握植物的季节性、微生物的生长期（对数生长期）和动物的生理状态等。

二、材料的预处理（一）细胞破碎上节课我们提到根据酶的分布，可将酶分为胞内酶和胞外酶。

若是胞外酶，就不存在细胞破碎的问题，但是胞外酶的种类很少，绝大多数酶都属于胞内酶。

要想获得胞内酶，就得先进行细胞破碎，使酶从细胞内释放出来，这样才能进一步进行酶的提取和分离纯化。

细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶溶法。

在实际使用时，我们要根据细胞的特性和酶的特性选择适宜的方法，有时也可以联合采用2种或2种以上的方法，以达到细胞破碎的效果，而又不影响酶的活性。

1、机械破碎法按照所用破碎机械的不同，又可以分为捣碎法、研磨法和匀浆法。

（1）捣碎法：常用于动物内脏、植物叶芽等比较脆嫩的组织细胞的破碎，也可以用于微生物，特别是细菌的细胞破碎。

（2）研磨法：常用于微生物和植物组织细胞的破碎。

（3）匀浆法：常用于破碎易于分散、比较柔软、颗粒细小的组织细胞。

大块的组织或者细胞团需要先用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散后才能进行匀浆。

2、物理破碎法根据物理力的不同，可分为冻融法、渗透压法和超声波破碎法。

（1）冻融法：适用于易于破碎的细胞，如革兰氏阴性菌。

如将-20℃冷冻的细胞突然放进沸水浴中，或沸水浴中的热细胞突然放进-70℃冷冻，这样都可以使细胞破坏。

但是，在酶的提取时，要注意不能在过高的温度下操作，以免引起酶的变性失活。

（2）渗透压法：适用于易于破碎的细胞，如动物细胞或革兰氏阴性菌。

使用时，先将细胞分离出来，悬浮在高渗透压的溶液中，平衡一段时间后，将细胞迅速转入低渗透压的蒸馏水或缓冲溶液中，由于渗透压的作用而使细胞破碎。

海洋生物中重要酶类的纯化与鉴定随着人们对海洋资源的深入开发和研究，发现海洋中存在着许多珍贵的生物资源，其中包括很多重要酶类。

酶是一种生物催化剂，对于化学反应速度的加速、生物物质的合成和降解、代谢调控等方面都起着至关重要的作用。

因此，海洋中的酶类资源具有广阔的研究和应用前景，是现代生物技术和药物研究领域中不可缺少的重要资源。

然而，海洋中的生物资源非常复杂，要从中提取和纯化出目标酶类，需要经过一系列复杂的操作和检测步骤。

下面将介绍海洋生物中重要酶类的纯化与鉴定。

一、酶类的来源与分类酶类来源于自然界中的各种生物，包括动物、植物和微生物等。

根据其作用特性和结构特征，可以将酶类分为多种类型，如水解酶、氧化酶、还原酶、转移酶、异构酶等。

在海洋生物中，也存在着各种类型的酶类，如蛋白酶、脂肪酶、葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶等。

二、酶类的纯化方法酶类的纯化是指将海洋生物中的目标酶类从其他杂质分离出来，得到较为纯净的酶制剂的过程。

酶类的纯化方法一般分为物理方法和化学方法两种。

1.物理方法物理纯化方法主要包括离心、摇床、超滤等。

其中，离心法是通过不同的离心速度将混合物中的细胞碎片、代谢产物等不同大小和密度的物质分离开来，从而得到目标酶类。

摇床法是利用水平振荡将混合物分成不同重量的层次，从而将目标酶类分离出来。

超滤法则是利用不同的孔径大小过滤膜将不同分子量的物质分离出来。

2.化学方法化学纯化方法主要包括沉淀分离、离子交换、凝胶过滤、亲和层析等。

其中，沉淀分离法是利用加入一些沉淀剂，将想要分离的酶类沉淀下来。

离子交换法则是利用具有活性的离子交换树脂将混合物中的酶分离。

凝胶过滤法是利用具有孔隙的聚合物凝胶将不同分子大小的物质分离开来。

亲和层析则是利用与目标酶类有特异性结合的亲和剂纯化出目标酶制剂。

三、酶类的鉴定方法酶类的鉴定是指对酶制剂的纯度、活性、稳定性等指标进行测试分析，以确定是否满足制药或其他生物技术应用的要求。

常用的酶类鉴定方法主要包括以下几种：1.测定酶的活性：通过测定酶对某种底物的反应速度来确定酶的活性水平。

酶的主要提取方法及其优缺点酶的主要提取方法及其优缺点生物工程09-1班杨桠楠0901*******1、有机溶剂沉淀是利用酶与其他杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的。

优点：1）分辨率比盐析法高2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。

2）对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。

沉淀析出后要尽快分离，尽量减少有机溶剂对酶活力的影响。

2、等电点沉淀是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的优点：1）大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化缺点：1）酸化时，容易引起蛋白质失活3、有机聚合物沉淀法(复合沉淀法)是在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离的。

优点：1）操作条件温和，不易引起生物大分子变性。

2）沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。

3）沉淀后有机聚合物容易去除。

4、盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离常用的盐析剂: 硫酸铵优点：1）盐析能力强。

2）在水中溶解度最大（25℃时为4.1mol/L）。

而温度系数最小（对温度不敏感）。

3）价格便宜。

浓度高时也不会引起蛋白质和酶生物活性的丧失，抽提效果好。

缺点：1）缓冲能力差2）NH4＋的存在干扰蛋白质的测定3）得到的样品欲继续纯化时，需花一定时间脱盐。

5、双水相萃取技术是用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液，如聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（Dextran）进行萃取。

由于形成的两相均有很高的含水量（达70%?90%），故称“双水相”系统。

1、酶的比活力答：每毫克(毫升）酶蛋白中含有的酶活力单位数（U/mg）/（U/ml）。

2、提取分离法（产酶技术）答：提取分离法是采用各种提取、分离、纯化技术从天然的动植物的组织、器官、细胞或微生物细胞中将酶提取出来，再进行分离纯化的过程。

3、酶的抽提答：指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程，也称为酶的提取。

4、原生质体答：即脱去细胞壁的细胞，指在人工条件下用溶菌酶除尽原有细胞壁或用青霉素抑制细胞壁的合成后，所留下的仅由细胞膜裹着的圆球状渗透敏感细胞。

5、菌种活化答：保藏的菌种处于休眠状态，使用之前必须接种于新鲜的斜面培养基上，在一定的条件下进行培养以恢复细胞的生命活动。

6、酶的膜分离技术答：指借助一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特性的多组分的溶质或溶剂进行分离或浓缩的技术。

7、酶的固定化答：指借助物理或者化学的方法将酶固定于特殊的相，使得酶与整体流体分开，但是仍然能够进行底物和效应物分子交换并发挥其催化效能的一种技术。

8、电泳答：带电粒子在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的过程。

9、酶的修饰答：通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。

10、酶的保鲜技术答：利用酶的催化作用，防止或消除各种外界因素对食品产生的不良影响，从而保持食品原有的优良品质和风味特色的技术。

11、酶的浓缩答：经发酵或细胞破碎、抽提等步骤后，所得发酵液或提取液中酶蛋白浓度很低，须进一步从低浓度的酶溶液中除去部分的水或其他有机溶剂而成为高浓度溶液的过程。

12、酶的层析分离技术答：也叫色谱分离，是利用混合物中各组分的物理化学性质（分子的大小、形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数等）的不同使各组分在两相（固定相与流动相）中的分布程度不同而使各组分得以分离的方法。

1、具有酶催化活性的蛋白质按其组成可分为和两类。

单纯蛋白质、结合蛋白质2、根据酶催化的化学反应性质，分为六大类：氧化还原酶、、、、、。

葡萄糖氧化酶的分离纯化方法葡萄糖氧化酶是一类具有重要生物学功能的酶，其在葡萄糖代谢中起着关键作用。

葡萄糖氧化酶的纯化和分离是研究其结构、功能及其与有机物之间相互作用的基础。

本文就葡萄糖氧化酶的分离纯化方法做一简单介绍。

葡萄糖氧化酶在细胞内的浓度很低，因此分离纯化葡萄糖氧化酶的第一步是将其从细胞内分离出来。

常用的技术有活性液体萃取技术、离子交换技术、硫酸法和细胞膜分离技术等。

活性液体萃取是利用酶的活性与溶剂的活性之间的互相作用，将酶从细胞内分离出来，然后通过沉淀法或离心法将酶收集回来。

离子交换技术是通过离子交换柱将葡萄糖氧化酶从细胞内分离出来，再结合沉淀法或离心法，将葡萄糖氧化酶从溶液中收集回来。

硫酸法是利用硫酸氢钠的溶解作用将葡萄糖氧化酶从细胞内分离出来，然后通过沉淀法或离心法将葡萄糖氧化酶从溶液中收集回来。

细胞膜分离技术是将细胞内的葡萄糖氧化酶分离出来，再通过沉淀法或离心法将葡萄糖氧化酶从溶液中收集回来。

经过上述分离纯化步骤，可以得到葡萄糖氧化酶的粗酶液，然后再进行精制。

常用的精制方法有电泳分离技术、溶剂萃取技术和结合技术等。

电泳分离技术是利用电泳柱将葡萄糖氧化酶从溶液中分离出来，溶剂萃取技术是利用溶剂的活性与葡萄糖氧化酶的活性之间的相互作用，将葡萄糖氧化酶从溶液中分离出来，结合技术是利用葡萄糖氧化酶与结合剂之间的相互作用，将葡萄糖氧化酶从溶液中分离出来。

经过上述步骤，可以得到纯化的葡萄糖氧化酶，能够用于研究其结构、功能及其与有机物之间的相互作用。

葡萄糖氧化酶的纯化和分离是必不可少的，只有正确有效地进行纯化和分离，才能够更好地研究葡萄糖氧化酶的结构、功能及其与有机物的相互作用。

总之，葡萄糖氧化酶的分离纯化方法包括分离和精制两个步骤，分离步骤中常用的技术有活性液体萃取技术、离子交换技术、硫酸法和细胞膜分离技术等，精制步骤中常用的技术有电泳分离技术、溶剂萃取技术和结合技术等。

只有正确有效地进行葡萄糖氧化酶的分离纯化，才能够更好地研究其结构、功能及其与有机物的相互作用。