苯硫脲尝味的群体遗传学调查ppt课件

基于PCR-RFLP技术的苯硫脲尝味的群体遗传学分析王晓博;杨丽【摘要】为测定苯硫脲尝味基因的表现型以及基因型,采用阈值法测定120名大学生对苯硫脲的尝味敏感性,采用PCR-RFLP技术在分子水平上测定PTC尝味的基因型予以验证.结果显示,120名调查对象的基因型与表现型基本一致.经验证,该群体处于遗传平衡,味盲基因频率为0.3415,味盲率为11.67％,男女生味盲率分别为15％和10％,二者比较差别无统计学意义.由于实验对象来自不同的地区,又属于不同的民族,通过计算得出PTC味盲与民族和地理位置有关.【期刊名称】《哈尔滨师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2015(031)004【总页数】5页(P97-101)【关键词】苯硫脲尝味敏感性;味盲率;基因频率;PCR-RFLP【作者】王晓博;杨丽【作者单位】内蒙古大学;内蒙古大学【正文语种】中文【中图分类】O342+.30 引言苯硫脲(phenylthiocarbamide，PTC)是一种白色结晶状化合物，由于含有N－C=S基团，呈苦涩味［1］.人类对苯硫脲的尝味能力具有显著的遗传学特征［1］，人 PTC苦味的尝味能力由7号染色体上(7q35－7q36)的一种苦味味觉感受器基因TAS2R38决定，该等位基因符合孟德尔遗传性状，属于常染色体不完全显性遗传，可以采用阈值法测定苯硫脲的尝味敏感性［2－4］.绝大多数尝味者与味盲者的区别在于三处单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs).味盲者的PTC编码区有五个限制性内切酶Fnu4H1的识别位点(识别序列5＇－GC↓NGC–3＇)，如果是尝味者，则其第785位SNP恰好形成了一个额外的Fnu4H1识别位点(GCTGC).因此可以利用这个SNP造成的限制性位点多态性，设计引物，克隆该基因，酶切电泳确定并验证基因型［5］.1 调查对象与实验材料1.1 调查对象受试者为在校大学生，年龄为20～23岁，共120人，其中男生40人，女生80人.1.2 实验材料1.2.1 基因型检测材料受试者用灭菌牙签刮取口腔上皮细胞，用于提取目的基因;PCR引物委托上海生工生物技术有限公司合成，预期扩增产物303bp;上游引物:hPTC Forward5’－aactggcagaataaagatctcaatttat－3’下游引物:hPTC Reverse5’－aacacaaaccatcacccctatttt－3’1.2.2 试剂和工具酶苯硫脲 (PTC)结晶，dNTPs，Tris碱，Na2EDTA·2H2O，蛋白酶K，溴化乙锭，琼脂糖，100 bp DNA ladder Marker，灭菌超纯水等，Taq DNA聚合酶，限制性内切酶Fnu4H1等.1.3 方法1.3.1 试剂的配制称取苯硫脲结晶与超纯水制成浓度梯度依次为 1/1500、1/3000、1/6000、1/12000、1/24000、1/48000、 1/96000、 1/192000、 1/384000、1/768000、1/1536000、1/3072000、1/6144000 的14种PTC溶液，标号1～14，过滤灭菌;另取蒸馏水作为第15号液.1.3.2 PTC 尝味能力的测定用滴管滴3～4滴14号液于受试者舌根部，让其尝味，之后用蒸馏水做同样试验;受试者若不能准确鉴别两种溶液的味道，则用13号溶液重复试验，(按浓度递增以此类推)直至能明确鉴别出PTC的苦味为止;当受试者鉴别出某一号溶液时，用此号溶液重复尝味3次，若结果相同时，则记录此时的浓度等级号，若受试者直到1号液仍尝不出苦味，则其尝味浓度等级定为＜1号.1.3.3 人口腔上皮细胞总DNA的提取在1.5 mL灭菌离心管中加入200 μL缓冲液Chelex;受试者用无菌牙签轻刮口腔腮内侧，刮下来的细胞在缓冲液中漂洗;加2 μL蛋白酶K，盖盖颠倒混匀，56℃水浴30 min;冷却室温，涡旋振荡器涡旋振荡混匀10 s;离心机13200 rmp瞬时离心10 s;沸水浴中煮沸8 min;涡旋振荡器涡旋振荡混匀20 s，离心机13200 rpm离心3 min;基因组DNA于4℃保存备用.1.3.4 PCR扩增PTC基因片段及检测PCR产物4℃保存备用.将PTC基因PCR扩增产物电泳检测，在凝胶成像系统中拍照.1.3.5 PTC基因PCR产物酶切及电泳检测将PTC基因PCR产物37℃恒温Fnu4H1酶切3h或过夜，酶切产物4℃保存备用.分别依次加入 100 bp DNA ladder Marker对照，10 μL PCR产物对照，电泳50 min;凝胶EB染色后，放入凝胶成像系统中拍照.表1 120名学生PTC尝味能力测试结果浓度等级性别男女合计地域内蒙古区内内蒙古区外合计≤1156516 2 1 0 1 1 0 1 3 0 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 0 0 5 1 2 3 3 0 36 3 1 4 4 0 47 15 16 31 9 22 318 39 12 6 6 12 9 13 36 49 33 16 49 10 3 69 7 2 9 11 0 4 4 3 1 4 12 0 0 0 0 0 0 13 0 1 1 1 0 1 14 0 0 0 0 0 0 15 0 0 0 00 0合计40 80 120 72 48 1202 结果与分析2.1 PTC尝味能力分布120名学生PTC尝味阈值统计结果见表1，图1、图2为PTC尝味能力分布图.从图中可以看出，PTC尝味能力呈双峰分布，且双峰性十分明显，双峰间的谷底是6号溶液处，故确定第6号液为味盲界限.不能尝出6号溶液及以上(＜6)者为味盲，共检出 14人，味盲率为11.67%，其中不能尝出1号溶液的6人，占全部味盲总数的42.86%，峰值在＜1位置;能尝出6～14号浓度的为尝味者，共106人，占88.33%，阈值集中在7～9号浓度范围内，峰值在9号处.尝味者中以7号至10号为尝味者杂合体，检出101人;11～14号为纯合体，检出5人.尝味者平均尝味阈值(±SD)为7.900±1.6886.图1 PTC尝味能力测试结果(按性别划分)图2 PTC尝味能力测试结果(按地域划分)2.2 性别与PTC尝味能力的关系苯硫脲味盲基因存在于7号常染色体上，因此从理论上讲，男、女味盲率应该没有显著差异，但文献报道，女性味盲率高于男性［6－7］.在收集的资料中，从表1可以看出，40名男生中，尝味者34人，平均阈值为7.5500±1.0720;味盲者6人，占15%;80位女生中，尝味者72人，平均阈值为8.075±2.2460;味盲者 8 人，占 10%.女生味盲率(10%)较男生味盲率(15%)偏低，此现象的原因可能与男女两性舌部的解剖学差异相关，平均而言，女性比男性具有更多的蕈状味蕾、有更多的味孔，所以女性与男性相比对PTC苦味更加敏感［8－9］.此外，男女尝味者平均阈值的差异，经 t检验，t=1.28 ＜2.5，无显著性差异.男女味盲率的差异经χ2检验，P＞0.05，也无显著意义.这说明，PTC味盲与性别的关系不大.2.3 不同民族PTC尝味能力的测定研究发现人类苯硫腺尝味多态性有种族及民族差异，国内曾报告过一些少数民族的群体资料［10］，不同民族人群甚至同一民族在不同地区对PTC的尝味能力不同［11］.笔者检测的120人中有蒙古族15人，女生14人，男生仅1人，PTC尝味能力分布域为7～10号液，分别为1，2，10，2人，平均阈值为8.8667±0.7180;味盲率为 0.汉族有105人，男生39人，女生66人.PTC尝味能力分布在1，2，5，6，7，8，9，10，11，13，分别为6，1，3，4，30，10，39，7，4，1 人，平均阈值为7.7619 ±2.2362.味盲率为13.33%，经 t检验，t=3.52 ＞2.5，平均阈值有显著性差异.味盲率差异极显著.由此初步可知，蒙古族和汉族PTC 尝味能力有差别.笔者认为蒙古族起源的非均一性和历史上蒙、汉族长期的基因交流，可能是导致这种情况的重要原因［12］.但由于蒙古族样本容量太小，因此统计结果的可靠性有待进一步确认.2.4 地理位置与PTC味盲的关系据肖春杰［13］等报道，味盲基因在我国分布有明显规律，即华南地区味盲基因频率最低，而西北地区，尤其新疆北部地区的味盲基因频率最高，其差异幅度相当大.PTC尝味能力在不同地理位置分布见表1.120名大学生中，内蒙古籍学生(区内)有72人，味盲者13人，味盲率18.06%;省外的学生有48人，检出味盲者1人，味盲率2.08%;区内和区外的味盲率有显著的差异性，由于区外的同学均为东部，而内蒙古地处西部，因此，基本说明PTC味盲与地理位置有一定的关系，由于所取的样本容量太小，不能够有力的说明东部地区味盲率要远比西部地区低.2.5 群体的甚因频率和基因型频率由表型判断，群体共120人，基因型为TT的5人，Tt的为101人，tt的为14人.则群体的基因型频率为:TT的频率为:P2=5/120×100%=4.17%Tt的频率为:2pq=101/120×100%=84.17%tt的频率为:q2=14/120 ×100%=11.66%由此，T基因的基因频率为:P=f(T)=f(TT)+1/2f(Tt)=4.17%+84.17%/2=46.255%，t基因的基因频率为:q=1－P=1－46.255%=53.745%.根据Hardy－Weinberg公式计算出隐性基因t的频率为T基因的基因频率为p=1－q=1－34.15%=65.85%.χ2值为 =0.17，自由度 df=1，当 p=0.05，查表得χ2=3.84 ＞0.17，统计学认为在 5%显著水平上差异不显著，观察数与理论数无明显差异，即证明本群体处于遗传平衡，且味盲基因频率为34.15%，与郑连斌［14］等测定的内蒙古蒙、汉两族的PTC味盲基因频率接近，但略微偏高，但低于庄振西［15］等测定的蒙古族、汉族和朝鲜族青少年的味盲基因频率，更低于白人的基因频率.2.6 PTC酶切电泳检测图谱分析对照DNA ladder Marker的指示条带位置，查看PCR产物和酶切产物的泳道中各有几条带.PCR产物预期只有一条约300 bp的带.酶切产物中如果只有一条与PCR产物同样位置的带，说明是tt纯合体(303 bp);如果只有两条带，一条暗淡，在前方较远处(64 bp)，另一条明亮比PCR产物带稍靠前(238 bp)，说明是TT纯合体;如果有三条带，一条明亮、与PCR产物位置相同，另一条比PCR产物带稍靠前，还有一条暗淡、在前方较远处，则说明是Tt杂合体.下面仅展示部分PCR产物和酶切产物的电泳结果(如图3所示)，来验证前文PTC尝味的结果.所有对象的基因型都得到PCR－RFLP的验证，与由表型得到的结果基本一致.图3 PCR产物(左)和酶切产物(右)的电泳结果3 小结该调查群体中，味盲基因(t)频率为0.3415，味盲率为11.67%，比我国平均味盲率8.28%高［16－17］，男女生味盲率分别为 15% 和 10%，二者比较差别无统计学意义，这说明，PTC味盲与性别的关系不大.但由于实验对象来自不同的地区，又属于不同的民族，通过计算得出PTC味盲与民族和地理位置有关.所有对象的基因型都得到PCR－RFLP的验证，与由表型得到的结果基本一致，这就排除了由尝味错误所产生的偶然误差，使结果更可靠.参考文献［1］沈海娥，陈晶，赵杰，等.河北省汉族大学生苯硫脲尝味能力测定与分析［J］.河北联合大学学报:医学版，2013，03:303－304.［2］Bernd Bufe，Paul A.S.Breslinet al.The Molecular Basis of Individual Differences in Phenylthiocarbamide and Propylthiouracil Bitterness Perception［J］.Current Biology，2005:154.［3］Guo SW，Shen FM et al.Threshold distributions of phenylthiocarbamide(PTC)in the Chinese population.［J］.Annals of the New York Academy of Sciences，1999:855.［4］Akcasu A，Ozalp E.Distribution of taste thresholds for phenylthiocarbamide among different age groups in Turkey ［J］.Pahlavi medical journal，1977:83.［5］Borum Sagong，Jae Woong Baeet al.Multiplex minisequencing screening for PTC genotype associated with bitter taste perception［J］.Molecular Biology Reports，2014:413.［6］Filiptsova I A，Timoshyna，et al.The population structure of Ukrainein relation to the phenylthiocarbamide sensitivity［J］.Egyptian 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人类对苯硫脲尝味能力的遗传分析高熹168615140001一、实验目的通过人群中对苯硫脲尝味能力的测试，学习其特殊的试验方法，认识人体对苯硫脲敏感性的遗传特征。

二、实验原理苯硫脲英文缩写为PTC，是一种白色晶体有刺激性气味的有毒物质，是一种白色结晶状药物，硫脲的苯基衍生物。

由于含有N-C=S基，所以有苦涩味。

主要用作各种族人群的遗传学分析用途，一个人能否尝出苦涩味是由其基因决定的，与所属民族有关。

由于基因表达的不同，不同人对该物质的味觉敏感度不同。

有的人能尝出1/750,000～1/50,000PTC浓度溶液的味道(苦味、苦涩、少数人感到甜味)，这些人称为尝味者(AD);有的人只能尝出PTC浓度大于1/24,000溶液的味道，这些人均称为PTC味盲者(AR)。

PTC味盲是隐性遗传，因此如果父母都是苯硫脲味盲，那么子女也必定是味盲。

因此，在DNA的亲子鉴定诞生之前，曾经用苯硫脲尝味试验来作为双胞胎、亲子鉴定的参考资料。

苯硫脲这种物质要么味道非常苦，要么几乎没有任何味道，这主要取决于一个人的遗传情况，但也与生活习惯有一定的关系。

研究显示，吸烟者和长期饮用咖啡或茶的人往往对PTC更不敏感，需要更高浓度的PTC溶液才能尝出苦味。

这意味着，人类能感受出苦味的性质可能最初是出于自身防御的目的，因为自然界中很多苦味物质也往往是有毒的，因此通过辨别出这些物质，可使人类避免受到这些有毒物质的伤害。

PTC含有N-C=S苦味官能团，人类的其受体都为TAS2R38，位于人类7号染色体上。

苯硫脲尝味符合孟德尔遗传规律，尝味由显性基因T决定，味盲由隐性基因纯合子tt所决定。

卷心菜、绿花椰菜及其他十字花科植物也含有类似的硫脲类物质，因此食用的时候，有些人觉得这些菜特别的苦，不喜欢吃此类食物，而有些人则尝不出其中的苦味。

正常尝味者基因型为TT，能尝出1/750,000～1/6,000,000 g/mL PTC液的苦味。

杂合子尝味者基因型为Tt，能尝出1/48,000～1/380,000 g/mL PTC液的苦味。

第1章《遗传因子的发现》1．正常人对苯硫脲感觉味苦，称味者 (T) 为显性，有人对苯硫脲没有味觉，称味盲(t) 。

人的正常 (A) 对白化病 (a) 为显性。

有一对味者夫妇生了一个味盲白化的孩子，则这对夫妇的基因型为 ( )A． TTAa x TTAa B． TtAa x TTAa C． TtAa x TtAa D． TtAA x TtAa2．孟德尔遗传规律不适合于原核生物是因为原核生物 ( )A．没有遗传物质B．没有核物质C．没有完善的细胞器D．主要进行无性生殖3． Dd 产生 D、d 两种配子，且比例为 l ：l 的主要原因是 ( )A．等位基因的相互作用B．等位基因相对独立C．等位基因随配子传递给后代D．等位基因的分离4．一杂合高茎豌豆白花传粉得到 6 粒种子，前 5 粒种下后均长成高茎。

第 6 粒种下后也长成高茎的可能性为 ( )A． 0 B． 3/4 C． 1/4 D． 1 5．如图所示，表示纯合体细胞的是 ( )6．基因型为 Aa 的个体与基因型为 aa 的个体交配属于 ( )A．杂交B．自交C．测交D．无法判断7．基因型为 Bb 的水稻连续自交三代，其后代中基因型为 bb 的个体占群体总数的( )A． 1/16 B． 2/ 16 C． 4/16 D． 7/16 8．将基因型为 dd 的小麦花粉，授在基因型为 DD 小麦的柱头上，结出的小麦种子的种皮细胞、胚细胞、胚乳细胞的基因依次为 ( )A．DD、Dd、DDd B．dd、Dd、DDd C．DD、Dd、Ddd D．dd、Dd、Ddd9．番茄红果 (A) 对黄果 (a) 显性，圆形果 (R) 对长形果 (r) 显性。

红长果与黄圆果番茄杂交：(1) 如果后代全是红圆果，则亲本的基因型为 _________ 。

(2) 如果后代是红圆果和红长果，且比例为 l ：1 ，则亲本的基因型为_________ 。

(3) 如果后代是红圆果和黄圆果，且比例为 1 ：l ，则亲本的基因型为_________ 。

•题目：人群中ＰＴＣ味盲基因频率的分析陈倩倩（交流生）1186271403131，摘要；通过实验掌握人群中ＰＴＣ味盲基因频率的分析方法，加深对群体遗传学中遗传平衡定律的认识。

2.引言苯硫脲(phenythiocarbamide , PTC) 是一种白色结晶状化合物,其结构由于有N - C = S 基团（硫化酰胺基）而呈苦味对人无毒，在不同人群中对该物质的尝味能力不同。

这种尝味能力是由一对等位基因(T.t)所决定其中T对t为不完全显性。

基因型为TT，能尝出1/6000000—1/750000的PTC的苦味；Tt基因型，能尝出1/480000—1/380000溶液的苦味，基因型为tt，能尝出1/24000以上浓度PTC的苦味。

极个别体甚至对PTC的结晶也尝不出，这类个体在遗传学上称为PTC味盲。

在 7q染色体上，三个单核苷酸等位多态性AVI (无偿味能力） AAV PAV (有偿味能力）PTC 尝味能力的调查在研究人类群体遗传学、种族学方面有其科学价值;亦可作为双生子、亲子鉴定的简便易行的方法之一。

PTC 测定在医学领域尤让人感兴趣的是可用于研究某些疾病与尝味能力的关联,为疾病预防提供资料。

例如结节性甲状腺肿、先天愚型等患者中味盲者较多,而食管癌、胃癌等患者中味盲者较少。

若能应用该技术进行深入研究,可能会有新的发现。

将ＰＴＣ配制成各种浓度的溶液，由低浓度到高浓度逐步测试学生的尝味能力，由此可区分出味盲（隐性纯合体）、高度敏感（显性纯合体）和介于二者之间的人（杂合体）。

据此可对人群中味盲基因的频率进行分析。

3.实验材料3.1实验材料配制苯硫脲溶液，对半稀释成14种浓度。

3.2实验方法1，PTC液的制取：取PTC粉末0.65g，加蒸馏水500ml，在室温下使其溶解，原叶浓度为1/750，原液为1号液，去原液100ml，用蒸馏水稀释一倍为2号液，取2号液100ml用蒸馏水稀释一倍成三号液，依次类推，直至14号液，14号液为1/6000000。

PTC尝味与Hardy-Weinberg平衡刘翠翠（37）生命基地09-3摘要本实验通过对PTC尝味基因频率的分析，了解基因在群体水平上的传递规律。

测试结果分析表明：尝味基因(T)频率为0.477，味盲基因(t)频率为0.523。

卡方检测结果χ2=3.000<χ20.05，说明本班43人是3种基因型频率平衡了的群体。

相关研究发现，某些疾病与尝味能力有关。

关键字：PTC尝味；基因频率；Hardy-Weinberg平衡引言苯硫脲(phenythlocarbamide．PTC)是一种人工合成的白色结晶状化合物，由于含N-C＝S基团，而有苦味。

PTC尝味能力是一种不完全显性遗传性状，由一对等位基因T/t决定，位于第4号染色体上，不同的人对其溶液的苦味有不同的尝味能力。

正常纯合尝味者基因型为TT，能尝出1/750,000—1/6,000,000 g/mL PTC液的苦味；杂合子尝味者基因型为Tt，能尝出1/48000—1/380000 g/mL PTC液的苦味；味盲者基因型为tt，能尝出1/24000 g/ mL 及以上PTC液的苦味。

基因型频率(genotype frequency)：群体中某一基因型个体所占的比例。

等位基因频率（allelic frequency）或称为基因频率（gene frequency) =（群体中某个基因座位上特定基因的拷贝数) / (群体中该座位所有等位基因数)。

X-连锁座位上的基因频率：p = f (X A）=｛（2XAXA♀）+(XAXa)+(XAY♂)｝/（2×雌体数+雄体数）。

哈迪-温伯格（Hardy-Weinberg）法则(1908年)：在理想群体中，基因频率和基因型频率逐代保持不变。

此定律可分为3个部分（1）前提：理想群体，即无穷大，随机交配，没有突变、没有迁移和自然选择；（2）结论：基因频率和基因型频率逐代不变,达到平衡；（3）关键：对常染色体上的基因，起初不平衡的群体，随机交配一代以后基因型频率就达到平衡。

遗传学实验报告PTC 味盲基因频率的分析刘乐乐生计11.3 2013年12月 2 日一、实验目的：1、通过对PTC味盲基因频率的分析，了解群体基因频率测算的一般方法；2、理解遗传平衡定律，了解改变群体平衡的因素。

二、实验原理PTC即苯硫脲，是一种无毒无副作用的化合物，人体对苯硫脲（PTC尝味的能力是由一对等位基因（T）所决定的遗传性状，其中T对t为不完全显性。

在不同人群中对该物质的尝味能力不同。

利用这一原理，将PTC配制成各种浓度的溶液，由低浓度到高浓度逐步测试尝味能力，由此可区分出味盲（隐性纯合体）、高度敏感（显性纯合体）和介于二者之间的人（杂合体）。

据此可对人群中味盲基因的频率进行分析。

正常尝味者的基因型为TT,能尝出1/750,000〜〜1/6,000,000的PTC溶液的苦味；具有基因Tt的人尝味能力较低，只能尝出1/48,000〜〜1/380,000的PTC溶液的苦味；基因型为tt的人只能尝出＞1/24,000的PTC溶液的苦味，甚至对PTC的结晶物也尝不出苦味来，在遗传学上被称为味盲。

哈迪一温伯格定律也称遗传平衡定律，是由英国数学家哈迪（G.H.Hardy）和德国医生温伯格分别于1908年和1909年各自提出的。

两个等位基因的哈迪一温伯格定律的公式为：（p+q）2=p2+2pq+q2=1。

其中p代表一个等位基因（如A）的频率，q代表另一个等位基因（如a）的频率，p2代表一个等位基因纯合子（如AA）的频率，q2代表另一个等位基因纯合子（如aa）的频率，2pq代表杂合子（如Aa）的频率。

三、实验材料PTC溶液的配制1、原液：取PTC结晶l.3g，加蒸馏水1000ml，在室温（20C左右）下1-2日即完全溶解。

2、原液的PTC浓度约为1/750，原液稀释1倍为2号液，2号液稀释1倍为3号液，以此类推，直至配成14 号液，浓度为1/6,144,000。

3、将配好的14种PTC溶液分别置于消毒好的滴瓶中（见表一）塢号配制方法臬囲型倍 1 水WOOrl1/750tt2号 1 号港10Gml+^tM 水、00ml1/1uoo tt3尋 2 号液1 OOnl+^tjj 水1伽1tZ3000tt4号1/6000tt$号 4 号aiOOmmMtS 水FOO FF I1/(2000tt6X B号液100制+蒸爛水100耐4000tt7号 6 号液lOGml+^tS 水100耐J/48000Tt8号7 号液水100ml»/&6000Tt9号8 号液100ml00ml1/192000Tt9号港100ml卡蒸tg水TOOwil1/384000Tt 11#10 号港1OQn1+3Ktg4ciOOnl1/768000n12号11号液lOOral才蒸!8水IDOnl1/1536D00TT13号T?号液T0&1W蒸帼水IDOnl1/3072000TT14号13号渔105"蒸歸水IDOnl1/6144000TT表1各组PTC的浓度及对应的基因型四、实验步骤1、用滴管滴4〜5滴溶液于受试者舌根部，让受试者品味，然后用蒸馏水作同样的试验初始浓度不能太高。