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Illumina HiSeq 2000Illumina Hiseq 2000测序系统是一种高通量测序技术，其测序原理和Illumina Genome Analyzer II 测序系统相似，仍然是采用可逆终止法的边合成边测序技术。
这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板，然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。
这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列。
这种技术避免了像传统测序技术那样耗费大量人力、物力进行片段克隆、转化、质粒抽提等繁琐的操作。
而且多种样品制备方法使此技术有一系列的广泛应用，包括基因表达、小RNA的发现，蛋白质核酸相互作用等。
HiSeq 2000测序系统是前所未有的高通量测序系统，不仅提高测序通量，降低了成本，而且具有创新的用户体验。
预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，简单的触摸屏用户界面，这种人机交互设计特征以及轻松的测序流程，使操作更简单，更方便。
HIseq 2000 cBotFlowcell Cluster Image测序实验流程：•基因组DNA打断；• DNA 末端修复；•连接接头；• DNA片段杂交到 Flowcell上；• DNA模板延伸，桥式扩增；• Flowcell制备；• SBS（synthesis-based-sequenceing）边合成边测序；• Hiseq上自动化测序；•图片处理，实时分析，碱基识别；•图片实时分析；•变异分析；•总结报告；技术特点：•每个run平均达到200G的数据通量，读长为2 x 100bp；•每个run可同时运行2张Flow cell, 且每张Flow cell 可进行上下两面扫描；•采用TDI 线性扫描技术，4个相机同时扫描；•预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，触摸屏式的用户界面；•低成本：单次运行即可以～30倍的覆盖度同时对两个人类基因组样品进行测序，或同时绘制200个基因表达谱。
Illumina HiSeq 2000Illumina Hiseq 2000测序系统是一种高通量测序技术，其测序原理和Illumina Genome Analyzer II 测序系统相似，仍然是采用可逆终止法的边合成边测序技术。
这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell，每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板，然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。
这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列。
这种技术避免了像传统测序技术那样耗费大量人力、物力进行片段克隆、转化、质粒抽提等繁琐的操作。
而且多种样品制备方法使此技术有一系列的广泛应用，包括基因表达、小RNA的发现，蛋白质核酸相互作用等。
HiSeq 2000测序系统是前所未有的高通量测序系统，不仅提高测序通量，降低了成本，而且具有创新的用户体验。
预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，简单的触摸屏用户界面，这种人机交互设计特征以及轻松的测序流程，使操作更简单，更方便。
HIseq 2000 cBotFlowcell Cluster Image测序实验流程：•基因组DNA打断；• DNA 末端修复；•连接接头；• DNA片段杂交到 Flowcell上；• DNA模板延伸，桥式扩增；• Flowcell制备；• SBS（synthesis-based-sequenceing）边合成边测序；• Hiseq上自动化测序；•图片处理，实时分析，碱基识别；•图片实时分析；•变异分析；•总结报告；技术特点：•每个run平均达到200G的数据通量，读长为2 x 100bp；•每个run可同时运行2张Flow cell, 且每张Flow cell 可进行上下两面扫描；•采用TDI 线性扫描技术，4个相机同时扫描；•预先配置、即插即用的试剂，简单的流动槽上样，触摸屏式的用户界面；•低成本：单次运行即可以～30倍的覆盖度同时对两个人类基因组样品进行测序，或同时绘制200个基因表达谱。
进行表观基因组学实验的三个步骤2008年早期，美国国家卫生研究院NIH宣布了一项涉及1.9亿元，时间长达5年的表观遗传学项目，这一项目作为NIH“路线图计划”（RoadMap Initiative）的组成部分，总体目标包括几个方面，比如绘制正常人类细胞和组织表观遗传系列参考图谱，研发新型研究工具等。
今天这些努力开始初见成效，NIH共同基金与一些私人研究机构已经资助了68项表观遗传学项目，获得了52份表观遗传图谱（不同细胞类型DNA甲基化和组蛋白修饰图谱），在去年9月，相关研究人员发表了30篇论文，介绍了这些研究成果，也解析了相关的转录因子结合位点，染色质高级结构，转录区域，以及将近150个细胞系中的更多人类基因组以外的信息。
而且更重要的是，通过这些研究，我们获得了大量新型表观遗传学和表观基因组学的分析技术，令我们更清楚的了解了基因组水平上细胞内发生的事件。
正如NIH共同基金办公室主任James Anderson 所说的那样，这些才是花费上百万美元的真正收获。
由此Science杂志特以“Epigenomics: The New Technologies of Chromatin Analysis”为题，总结概况了这些技术，文章分为甲基化分析，组蛋白分析，以及分离分选技术。
紧抓“甲基化”获得表观遗传学项目Epigenomics Program资助的一位研究人员，是来自加州大学圣地亚哥分校路德维希癌症研究所的华人科学家任兵（Bing Ren，音译），作为这一项目四大关键表观遗传学图谱研究中心之一的研究院首席研究员PI，任兵的研究方向为胚胎干细胞表观遗传学。
自2008年以来，圣地亚哥表观遗传学中心已经资助了1570万美元，用于绘制人类胚胎干细胞和四种干细胞分化细胞类型的DNA甲基化图谱，以及20个组蛋白修饰的图谱。
任兵表示，表观遗传学项目的重要性“与人类基因组测序技术的重要性相当”，“有了人类基因组图谱，就有了了解人类发育的蓝图，但是如果没有一个详细的表观遗传学解析图谱，我们就无法解读这个蓝图。
#流程大放送#WGBS和RRBS测序分析流程介绍WGBS全称Whole Genome Bisulfite Seuqneicng，即全基因组重亚硫酸盐测序。
该方法通过Bisulfite处理，将原基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U的同时，保留所有甲基化C 的碱基不发生转变，从而帮助科研人员识别发生甲基化的CpG位点。
该种测序技术适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。
RRBS全称Reduced Representation Bisulfite Sequencing，即简化代表性重亚硫酸盐测序。
该方法在Bisulfite处理前，使用MspI（该酶的酶切位点为CCGG）酶切对样本进行处理，去除低CG含量DNA片段，从而使用较小的数据量富集到尽可能多的包含CpG位点的DNA片段。
相比于WGBS技术，RRBS是一种准确、高效且经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切，并进行Bisulfite测序，该方法在保证DNA甲基化状态检测的高分辨率的同时提升测序数据的高利用率。
该项技术可用于以下研究1、处于特定时期或特定处理条件下的样本中，研究样本中染色体高精度DNA甲基化模式；2、比较不同细胞、组织、样本间的高精度DNA甲基化修饰模式的差异；3、疾病样本中，与疾病发生发展相关的高精度DNA甲基化表观遗传机理研究和相关高精度DNA甲基化位点分子标志的探索性研究。
数据处理和分析流程图分析结果示例图片展示示例图1 样本中各区域DNA甲基化水平信息统计和样本间差异DNA甲基化分析结果展示[1]示例图2 差异DNA甲基化区域内转录因子基序识别[1]示例图3 DNA甲基化水平变化与基因表达水平变化的关联性分析[1]示例图来源文献[1]. Ng, C.W., et al., Extensive changes in DNA methylation are associated with expression of mutant huntingtin. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(6): p. 2354-9.。
DNA甲基化检测实验一、重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）（Bisulfite Genomic Sequence）原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。
重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。
PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。
PCR产物克隆后进行测序。
通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA 分子中的甲基化状态。
该方法特点是：•特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；•灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。
用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。
重亚硫酸盐测序法技术实验流程A．DNA制备用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B．重亚硫酸盐处理C．DNA纯化用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D．PCR扩增E．PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化F．PCR产物连接到pMD19-T (Takara) 载体中克隆及测序。
G．用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析二、甲基化特异性的PCR实验流程（methylation-specific PCR, MSP）原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。
重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。
随后进行引物特异性的PCR。
该方法引物设计是关键。
MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的甲基化DNA链（引物对M），另一对结合处理后的非甲基化DNA链（引物对U）。
检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化（图3）。
重测序技术方案引言重测序技术是一项用于测序DNA或RNA的技术，可以帮助我们了解生物体内的基因组结构和功能。
随着测序技术的不断发展和进步，重测序技术也在不断创新和完善。
本文将介绍几种常见的重测序技术方案，并比较它们的特点和应用。
Sanger测序技术Sanger测序技术是第一代测序技术，也被称为链终止法。
它基于DNA合成过程中的链终止原理，使用一组标记有荧光的缺失氧核苷酸，并与待测DNA模板进行扩增反应。
在扩增反应中，不同长度的引物扩展产生的片段会被分离并测量其荧光信号，从而确定DNA序列。
Sanger测序技术具有高准确性和可靠性，能够读取数百个核苷酸，但其缺点是低通量和高成本。
由于需要单个片段的扩增和测序，Sanger测序技术适合对小规模的基因片段进行测序。
Illumina测序技术Illumina测序技术是一种广泛应用的高通量测序技术，也被称为第二代测序技术。
它基于桥式扩增（bridge amplification）和荧光染料标记的可逆终止原理，通过在DNA复制过程中加入终止核苷酸和复合酶的方法进行测序。
Illumina测序技术具有高通量、低成本和高可靠性的特点。
其通过并行测序技术，能够同时读取上百万个DNA片段，从而大大提高了测序速度和效率。
然而，Illumina测序技术对于长序列的读取存在一定的挑战，需要通过后续的重组技术来获得完整的DNA序列信息。
PacBio测序技术PacBio测序技术是一种第三代测序技术，也被称为单分子实时测序技术。
它基于聚合酶链反应（PCR）和DNA聚合酶的原理，通过监测DNA合成过程中的荧光信号来实现测序。
PacBio测序技术的主要优点是能够实现长读取长度和高准确性。
由于其对DNA片段长度没有限制，因此适用于测序整个基因组或长片段DNA。
另外，PacBio测序技术还能够实时监测DNA合成过程，提高了测序准确性。
然而，PacBio测序技术的缺点是测序速度较慢，并且存在一定的错误率。
重亚硫酸盐测序操作方案一、样品收集1、配制2%低熔点琼脂糖称取0.02 g低熔点琼脂糖，倒入1.5 mL离心管中，随后加入1 mL mPBS溶液，置于100℃金属浴中反复加热并颠倒混匀至完全溶解，取出4℃保存待用。
2、收集细胞样品80℃以上热水浴使低熔点琼脂糖溶化。
向1.5 mL离心管底部加入8 μL低熔点琼脂糖，避免产生气泡。
迅速吸取细胞样品吹入琼脂糖中，冷却后加入500 μL矿物质油覆盖。
最后将离心管在热水浴中短暂浸泡使琼脂糖小球成型，取出-20℃保存待用。
二、亚硫酸氢盐修饰3、配制DNA细胞裂解液：向20 mL TE缓冲液中加入100 μL 的20 mg/ml蛋白酶K。
4、向含样品的离心管内加入500 μL DNA细胞裂解液，50℃金属浴8 h以上，以消化样品。
6、消化完成后，将离心管取出，换液清洗使小球变性：0.3M NaOH，500 μL，15 min，2次；0.1M NaOH，1 mL，5 min，1次。
7、换液加入500 μL转化液，50℃金属浴8 h以上，以转化样品，注意避光。
8、用TE缓冲液中止转化，1 mL ，15 min，6次。
9、用0.2M NaOH脱磺化，500 μL，15 min，2次。
10、用TE缓冲液中止脱磺化，1 mL，15 min，3次。
11、用双蒸水清洗，1 mL，10 min，2次。
12、清洗完成，用枪头吸取琼脂糖小球转移至200 μL离心管中，-20℃保存待用。
三、甲基化基因的PCR第一轮反应体系25 μL，转化后琼脂糖小球计为2 μL DNA。
第二轮反应体系扩大为50 μL。
快速精确切取，将胶块放入1.5 mL离心管内。
四、胶回收15、对胶块称重，向离心管内加入3倍胶体积（0.1 g=100 μL）QG Buffer，50℃金属浴至胶融化，同批样品可统一为450 μL，以便于离心。
16、加入1倍胶体积（150 μL）异丙醇，颠倒混匀后将液体移入离心柱离心，13000 g，1 min。
