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三代测序原理
三代测序原理是指第三代测序技术，又称为单分子测序技术。
与第一代（Sanger测序）和第二代（高通量测序）相比，第三代测序技术具有更高的速度、更低的成本和更长的测序读长等优点。
第三代测序技术的原理主要是基于测序模板的直接测序，而不需要PCR扩增。
这种直接测序的方法可以避免PCR扩增引入
的错误，并且能够在一个测序周期内得到完整的序列信息。
在第三代测序技术中，常用的方法是通过将DNA分子固定在
一个载体上，形成DNA聚集体。
然后，通过负电荷的方式将
这些DNA聚集体附着在固定的表面上，形成一个DNA分子
阵列。
接着，通过使用荧光染料将这些固定的DNA分子标记出来，
并且使用激光束在一个固定的区域内进行扫描。
这样，就可以得到每个DNA分子的位置和荧光信号强度信息。
在测序过程中，通常会使用一种特殊的酶来控制DNA链的合
成过程。
这种酶能够识别每个碱基的序列信息，并且在特定的条件下将其添加到适当的位置。
通过不断重复这个步骤，直到测序反应完成，就可以得到整个DNA分子的序列信息。
总结起来，第三代测序技术的原理是通过直接测序DNA模板，
不需要PCR扩增，通过固定DNA分子并使用荧光标记，通过酶的作用在特定条件下完成碱基的添加，最终得到完整的
DNA序列信息。
这种技术具有快速、低成本和长读长等优势，在各种生物学研究中得到了广泛的应用。
三代测序技术的原理三代测序技术是指通过直接测序DNA或RNA分子，而不需要进行PCR扩增，从而能够更快地获取基因组或转录组的信息。
三代测序技术的原理主要有以下几种：1. 单分子测序原理：这种技术通过将DNA或RNA分子固定在测序平台上，利用荧光信号的变化来识别核酸碱基的顺序。
具体而言，这种技术一般使用一种特殊的引物，将DNA或RNA单分子连接到测序平台上。
接着，通过向样本中供应一种特定的核酸碱基，当该碱基与目标分子的下一个碱基匹配时，就会释放一种荧光信号，可以通过检测这种信号来确定核酸序列。
2. 实时测序原理：这种技术通过监测DNA合成的过程中释放的荧光信号来测序。
具体而言，这种技术使用一种特殊的合成DNA酶，它能够在DNA合成过程中释放荧光信号。
在测序的过程中，使用一个特定的引物和荧光信号强度监测系统，当该引物与待测DNA的下一个碱基匹配时，会释放出荧光信号。
通过监测这种信号的变化，可以获得核酸序列信息。
3. 液相法测序原理：这种技术通过在一种特殊的反应体系中进行DNA合成和检测。
具体来说，这种技术一般使用一种特殊的酶（如聚合酶），它能够在特定的反应条件下使用脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）作为合成DNA的底物。
在反应的过程中，每添加一个核苷酸，就会释放出一种特定的荧光信号。
通过监测这种信号的强度变化，可以获得核酸的序列信息。
总的来说，三代测序技术的原理主要是通过不同的方法来区分和检测DNA或RNA分子的碱基序列，从而实现基因组或转录组的测序。
这些技术相较于传统的第二代测序技术拥有更高的测序速度和更低的成本，已被广泛应用于生物学和医学领域。
pacbio三代测序原理随着生物学的发展，对于基因组的研究和分析也越来越重要。
在基因组研究中，测序是必不可少的一步。
测序技术的发展使得人们能够更加深入地了解基因组和生物学的本质。
PacBio三代测序技术是近年来新兴的一种测序技术，其原理和流程与传统的二代测序有很大的不同。
本文将详细介绍PacBio三代测序的原理和流程。
PacBio三代测序是基于单分子实时测序技术的。
其使用的测序仪是PacBio RS II或Sequel，这些测序仪能够实现单分子实时测序。
与传统的二代测序技术不同，PacBio三代测序能够在单个分子水平上进行测序，因此无需进行PCR扩增和文库构建等步骤，从而避免了PCR扩增引入的偏差和文库构建过程中的损失。
此外，PacBio三代测序还具有长读长优势，能够产生数千到数万的bp长的reads，从而大大提高了测序的准确性和覆盖度。
PacBio三代测序的原理是基于SMRT（Single Molecule Real Time）技术，该技术基于荧光信号实现单分子实时测序。
具体来说，PacBio 测序仪利用荧光标记的四种不同核苷酸（A、T、C、G）在DNA合成过程中的释放来进行测序。
当DNA合成时，DNA聚合酶会在荧光标记的核苷酸加入到新合成的链中时释放荧光信号。
这些荧光信号被PacBio 测序仪捕获并转化为序列信息。
由于荧光标记的核苷酸释放荧光信号的速度是非常快的，因此PacBio测序仪可以实时监测DNA合成的过程，从而实现单分子实时测序。
PacBio三代测序的流程主要分为三个步骤：样品准备、测序反应和数据分析。
首先，需要从样品中提取DNA，并将其质量和浓度进行检测。
接下来，将DNA片段直接加入到PacBio测序仪中，不需要进行PCR扩增和文库构建等步骤。
在测序反应中，PacBio测序仪会将荧光标记的核苷酸加入到新合成的DNA链中，并实时监测荧光信号。
最后，将测序得到的数据进行分析，包括序列拼接、错误校正和注释等步骤，从而得到高质量的基因组序列。
dna第三代测序技术的原理
DNA第三代测序技术的原理
DNA第三代测序技术是指通过一系列创新的技术手段，高效地测定DNA的序列，从而满足广泛的科学和医学应用。
该技术的原理主要基于高通量测序，即将DNA断片，并用不同的方法测定每一段片段的核酸序列。
下面将详细介绍DNA第三代测序技术的原理。
首先，在DNA第三代测序中，DNA样品被断成小片段。
这些小片段的长度通常在1000到10000个碱基对之间。
然后，这些小片段被分散在一个极小的容量中，以便在反应期间保持分离状态。
其次，DNA测序的过程是通过不断地扩增目标DNA片段实现的。
在DNA第三代测序技术中，使用单分子弱放大技术将每个DNA分子分离，并将其放入微型流池中进行扩增。
这个单分子测序技术确保了每个DNA片段的扩增过程独立于其他DNA片段，从而减少了重叠和重复的碱基对。
然后，随着碱基对的逐个添加，目标DNA的序列被测定并记录。
在DNA第三代测序技术中，通过有效的DNA连续追踪技术，将目标DNA的序列基于核酸碱基的特性进行连续追踪。
最后，在完成DNA测序后，可以使用不同的方法对序列进行读取。
在DNA第三代测序中，可以使用非核酸测序技术来实现高效、低成本的数据读取。
特别是芯片技术，可以显著提高数据质量和效率，并降低测序成本。
总的来说，DNA第三代测序技术是通过通过精密的分子测序技术实现高通量DNA测序。
该技术提供了高速、高质量和高效率的DNA实验设计，可以用于广泛的科学和医学研究领域。
三代测序技术的原理三代测序技术是一种高通量测序技术，能够快速、准确地获取DNA 或RNA序列信息。
它是在第一代和第二代测序技术的基础上发展起来的，具有更高的测序速度和较低的测序成本。
本文将从原理的角度来介绍三代测序技术的工作原理。
三代测序技术的原理主要包括DNA或RNA提取、文库构建、测序和数据分析四个主要步骤。
首先是DNA或RNA的提取。
在进行三代测序之前，需要从样本中提取出DNA或RNA。
这一步骤的目的是获得待测序的生物分子，并去除其中的杂质和其他干扰物。
接下来是文库构建。
文库是指将待测序的DNA或RNA片段连接到测序芯片上，并进行扩增和纯化的过程。
这一步骤的关键是将DNA 或RNA片段与连接适配体（adapter）结合，适配体的序列包含引物序列和标签序列。
引物序列用于扩增待测序的DNA或RNA片段，标签序列则用于识别每个片段的起始位置。
然后是测序。
三代测序技术主要有单分子测序和纳米孔测序两种方法。
单分子测序是将待测序的DNA或RNA片段直接定位到测序芯片上，通过检测每个碱基的荧光信号来获得序列信息。
纳米孔测序则是将待测序的DNA或RNA片段通过纳米孔，利用电信号的变化来判断每个碱基的序列。
这两种方法都具有高通量的特点，能够同时测序多个片段，大大提高了测序的速度和效率。
最后是数据分析。
测序完成后，得到的数据需要进行分析和解读。
首先是数据过滤和质量控制，去除低质量的数据和噪音。
然后是序列比对和拼接，将测得的片段与已知序列进行比对，得到最终的序列信息。
最后是序列注释和功能分析，对得到的序列进行注释，了解其可能的功能和作用。
三代测序技术相比于第一代和第二代测序技术有着明显的优势。
首先是测序速度更快。
三代测序技术可以同时测序多个片段，大大提高了测序的速度。
其次是测序成本更低。
由于三代测序技术的高通量特点，可以同时测序多个样本，降低了测序的成本。
此外，三代测序技术还具有更高的准确性和更广泛的应用范围。
三代测序技术原理随着科技的不断进步，人们对基因组的研究也越来越深入。
测序技术作为基因组研究的核心工具，也在不断发展和创新。
三代测序技术是一种新兴的测序技术，在基因组研究中具有重要的意义。
本文将从三代测序技术的原理出发，详细介绍其工作原理和应用。
三代测序技术是指第三代测序技术，与第一代和第二代测序技术相比，具有更高的测序速度、更低的成本和更高的准确性。
三代测序技术的原理主要包括单分子测序和实时测序两个方面。
在单分子测序中，DNA分子被直接测序，无需进行PCR扩增和文库构建等步骤。
这种直接测序的方法可以避免PCR引入的差错和文库构建过程中的偏差，提高了测序的准确性。
而实时测序则是指在测序过程中可以实时监测测序结果，实时获得测序信息。
这种实时监测的方法可以提高测序的效率和准确性，同时减少了后续的数据分析和处理时间。
三代测序技术的工作原理主要包括DNA片段的制备、测序仪器的工作和数据分析三个步骤。
在DNA片段的制备过程中，需要将DNA样本进行处理，得到适用于测序的DNA片段。
这个过程包括DNA的纯化、断裂和连接等步骤。
其中，DNA的纯化是将样本中的DNA分离出来，去除杂质。
断裂是将DNA分子打断成适当的长度，以便于测序。
连接是将适配体连接到断裂的DNA片段上，为后续的测序做准备。
接下来，测序仪器开始工作。
测序仪器会对DNA片段进行测序，获取其碱基序列信息。
具体来说，测序仪器会通过不同的测序方法，如单分子实时测序或单分子循环测序，对DNA片段进行测序。
在测序过程中，测序仪器会记录下每个碱基的信号，并将其转化为测序数据。
得到的测序数据需要进行分析和处理。
这一步骤主要包括数据质控、序列比对和变异检测等。
数据质控是对测序数据进行筛选，去除低质量的测序结果。
序列比对是将测序结果与参考基因组进行比对，以确定测序结果在基因组中的位置。
变异检测是根据测序结果，寻找样本中的变异位点，如单核苷酸多态性（SNP）或结构变异。
pacbio三代测序原理随着基因组学的发展，测序技术也在不断地进步和完善。
其中，第三代测序技术因其高通量、高准确性、长读长等优势，被越来越多的科研人员所关注和使用。
PacBio三代测序技术是目前最先进的单分子实时测序技术之一。
本文将介绍PacBio三代测序的原理、优势和应用。
一、PacBio三代测序原理PacBio三代测序技术主要基于SMRT（Single Molecule Real Time）技术，其基本原理是将DNA分子固定在聚合酶上，通过单分子实时监测DNA聚合酶的扩增过程，从而实现对DNA序列的测定。
具体过程如下：1. DNA样本制备：将DNA样本进行适当处理，使其适合于PacBio 测序。
2. DNA聚合酶固定：将DNA聚合酶固定在透明的聚合酶盘上，并在盘底部加入荧光素和底物。
3. DNA扩增：加入DNA样本，DNA聚合酶开始扩增，同时荧光素也被释放出来。
4. 荧光检测：荧光素被激发后会发出荧光信号，通过摄像头实时捕捉荧光信号，记录DNA聚合酶扩增的过程。
5. 数据分析：通过计算机处理荧光信号，得到DNA序列信息。
由于PacBio三代测序技术采用单分子实时监测技术，因此其读长可以达到10kb以上，比第二代测序技术要长得多。
此外，PacBio三代测序技术还可以实现单分子级别的准确性，能够准确地检测到DNA序列中的各种变异。
二、PacBio三代测序优势1. 长读长：PacBio三代测序技术的读长可以达到10kb以上，比第二代测序技术要长得多。
这使得PacBio三代测序技术可以检测到更多的基因组结构变异和复杂序列。
2. 高准确性：PacBio三代测序技术可以实现单分子级别的准确性，能够准确地检测到DNA序列中的各种变异。
3. 高通量：PacBio三代测序技术可以在短时间内完成大量的测序工作，提高了测序效率和产出量。
4. 适用范围广：PacBio三代测序技术可以用于各种样本类型的测序，包括基因组、转录组、表观基因组等。
第三代测序技术的原理和应用第一部分：引言随着基因组学研究的快速发展，测序技术也在不断进步。
第一代测序技术（Sanger测序）和第二代测序技术（高通量测序）已经取得了重大突破，但仍存在一些限制。
为了克服这些限制，第三代测序技术应运而生。
本文将介绍第三代测序技术的原理和应用。
第二部分：第三代测序技术的原理第三代测序技术是一种新型的高通量测序技术，其原理与传统的测序技术有所不同。
第三代测序技术的原理主要包括以下几个方面：1.基于单分子扩增：第三代测序技术采用单分子扩增的方法，不需要PCR过程和文库构建步骤，从而避免了样本损失和引入偏差。
2.实时测序：第三代测序技术实时监测DNA合成过程，可以直接检测每个碱基的加入，无需后续的显著化和检测步骤。
这大大提高了测序速度，并降低了成本。
3.长读长读长读：相比第二代测序技术生成的短读长度，第三代测序技术可以产生更长的读长，一次读取几千个碱基。
这种特点对于重复序列的分析、基因组结构建模和个体基因组描绘等研究非常有用。
第三部分：第三代测序技术的应用第三代测序技术广泛应用于不同领域的基因组学研究。
以下是第三代测序技术的几个重要应用方面：1.药物研发：第三代测序技术可以快速高效地获得个体基因组序列信息，帮助科学家识别药物靶点，推动个体化药物研发。
2.疾病研究：通过第三代测序技术，我们可以快速识别临床样本中的致病基因，深入研究疾病的遗传基础，并帮助制定个性化治疗方案。
3.农业研究：第三代测序技术可以高通量地鉴定和分析作物、家畜和其它农业生物的基因组信息，有助于优化农业生产和提高农作物品质。
4.环境研究：第三代测序技术可以帮助科学家研究环境中的微生物群落，揭示微生物对环境变化的响应，从而提供更好的环境保护策略。
5.进化研究：第三代测序技术可以提供大量的遗传信息，促进生物的进化研究，深入了解物种的起源、演化和适应性变化等问题。
第四部分：结论第三代测序技术以其独特的原理和广泛的应用前景吸引了基因组学研究领域的关注。
第三代DNA测序技术是近年来生物学领域的一项重大突破，它的原理和应用在基因研究和生物科学中具有重要意义。
本文将深入探讨第三代DNA测序技术的原理，并分析其在不同领域的应用。
1. 引言DNA测序技术是生物学研究中最基础、最重要的工具之一。
传统的第一代和第二代DNA测序技术虽然有着高效和准确的特点，但在测序速度、数据质量和测序长度方面存在一定的局限性。
而第三代DNA测序技术的出现，为我们提供了更高的测序速度、更长的测序读长和更低的测序成本。
2. 原理第三代DNA测序技术的原理与传统技术有所不同。
它不再依赖于离散的信号和化学反应，而是通过直接读取单个DNA分子中的碱基序列来实现测序。
下面将介绍几种常见的第三代DNA测序技术原理及其特点。
2.1 单分子实时测序技术单分子实时测序技术是第三代DNA测序技术中的一种重要方法。
它利用了DNA链的线性自我扩增特性，通过监测单个DNA分子的合成过程来实现测序。
这种方法具有实时性好、测序速度快、数据产量高的优点，适用于高通量测序和长读长要求的研究。
2.2 纳米孔测序技术纳米孔测序技术是一种基于离子传导原理的第三代DNA测序方法。
它使得DNA分子能够通过纳米孔的通道，并且依据碱基的化学特性在电流传导上产生差异，从而实现测序。
这种方法具有高速度、低成本和无需扩增的特点，适用于快速测序和实时监测。
2.3 光学测序技术光学测序技术是第三代DNA测序技术中的又一种重要方法。
它利用了荧光染料的性质和光信号的检测来实现测序。
通过将DNA分子与特定的荧光染料标记，然后在测序仪器中激发并检测荧光信号，从而获取对应的碱基信息。
这种方法具有高灵敏度和高分辨率的特点，适用于复杂样品和高标准的测序要求。
3. 应用第三代DNA测序技术在生物学研究和医学领域的应用十分广泛，下面将介绍几个典型的应用案例。
3.1 基因组测序第三代DNA测序技术在基因组测序中具有重要意义。
其高通量、长读长和低成本的特点使得科学家们能够更快地完成全基因组的测序工作，并且能够检测到一些传统方法难以观察到的基因变异。
第三代测序技术介绍目前，主要的第三代测序技术包括单分子测序技术和纳米孔测序技术。
单分子测序技术是指将DNA样本直接读取成单个分子的测序技术。
这种技术的一个典型代表是PacBio Single Molecule Real-Time（SMRT）测序技术。
这种技术基于真核生物DNA聚合酶的特点，通过监测单个DNA分子的合成过程来实现测序。
在PacBio SMRT测序技术中，DNA分子被固定在悬浮在荧光物质中的微小光子学平台上，随着DNA合成的进行，DNA聚合酶会释放出光子，从而可以实时监测到DNA的合成过程。
这种技术能够实现长读取长度和高保真度，具有快速、高效、高通量的特点，被广泛应用于基因组学、转录组学等研究领域。
纳米孔测序技术是指通过将DNA样本引导通过一个纳米孔，并通过监测DNA分子在纳米孔中电信号的变化来实现测序的技术。
这种技术的一个代表是Oxford Nanopore Technologies（ONT）的MinION测序技术。
在MinION测序技术中，DNA样本通过纳米孔时，会引起电信号的变化，这种变化可以被转化成测序信息进行读取。
这种技术具有实时、长读取长度、低成本的特点，可以在实验室和户外等多种场合进行测序，被广泛应用于移动基因组学、环境监测等领域。
第三代测序技术的出现极大地推动了基因组学、转录组学等研究领域的发展。
它们不仅提高了测序的速度和准确性，还降低了测序的成本，使得大规模基因组和转录组的测序成为可能。
在人类基因组计划中，第三代测序技术被广泛应用于完成全基因组的测序任务，为研究人类基因组提供了重要的数据资源。
同时，第三代测序技术也被广泛应用于微生物学、农业科学、生物多样性研究等领域，为相关研究提供了有力的支持。
然而，尽管第三代测序技术在测序速度和准确性上有了巨大的进步，但其仍然存在一些挑战和限制。
比如，第三代测序技术在读取长度和错误率等方面仍有改进的空间，同时对于复杂的基因结构和重复序列的测序仍然存在困难。
三代基因组测序技术原理简介【写在前面的话】：首先，这一篇博文中的内容并非原创，而是对多篇文献中内容的直接摘录，有些图片和资料还来自身边的同事（在此深表谢意！），再夹杂自己的零星想法，写在这里分享与大家，同时也是为了方便自己日后若有需要能够方便获得，文章比较长。
摘要：从1977年第一代DNA测序技术（Sanger法）1，发展至今三十多年时间，测序技术已取得了相当大的发展，从第一代到第三代乃至第四代，测序读长从长到短，再从短到长。
虽然就当前形势看来第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三和第四代测序技术也已在这一两年的时间中快速发展着。
测序技术的每一次变革，也都对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生巨大的推动作用。
在这里我主要对当前的测序技术以及它们的测序原理做一个简单的小结。
图1：测序技术的发展历程生命体遗传信息的快速获得对于生命科学的研究有着十分重要的意义。
以上（图1）所描述的是自沃森和克里克在1953年建立DNA双螺旋结构以来，整个测序技术的发展历程。
第一代测序技术第一代DNA测序技术用的是1975年由桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创的链终止法或者是1976-1977年由马克西姆（Maxam）和吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解）. 并在1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基1。
自此，人类获得了窥探生命遗传差异本质的能力，并以此为开端步入基因组学时代。
研究人员在Sanger法的多年实践之中不断对其进行改进。
在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础，Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2’和3’都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列（图2）。
这个网址为sanger测序法制作了一个小短片，形象而生动。
值得注意的是，就在测序技术起步发展的这一时期中，除了Sanger法之外还出现了一些其他的测序技术，如焦磷酸测序法、链接酶法等。
其中，焦磷酸测序法是后来Roche公司454技术所使用的测序方法2–4，而连接酶测序法是后来ABI公司SOLID技术使用的测序方法2,4，但他们的共同核心手段都是利用了Sanger1中的可中断DNA合成反应的dNTP。
图2：Sanger法测序原理第二代测序技术总的说来，第一代测序技术的主要特点是测序读长可达1000bp，准确性高达99.999%，但其测序成本高，通量低等方面的缺点，严重影响了其真正大规模的应用。
因而第一代测序技术并不是最理想的测序方法。
经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa，Hiseq技术和ABI公司的Solid技术为标记的第二代测序技术诞生了。
第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性，以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。
表1和图3对第一代和第二代测序技术各自的特点以及测序成本作了一个简单的比较5，以下我将对这三种主要的第二代测序技术的主要原理和特点作一个简单的介绍。
图3. 测序成本的变化1. IllumineIllumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的技术核心原理是相同的2,4。
这两个系列的机器采用的都是边合成边测序的方法，它的测序过程主要分为以下4步，如图4.（1）DNA待测文库构建利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段，目前除了组装之外和一些其他的特殊要求之外，主要是打断成200-500bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头，构建出单链DNA文库。
（2）FlowcellFlowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell的时候会随机附着在flowcell表面的channel上。
每个Flowcell有8个channel，每个channel的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对（这就是为什么flowcell能吸附建库后的DNA的原因），并能支持DNA在其表面进行桥式PCR的扩增。
（3）桥式PCR扩增与变性桥式PCR以Flowcell表面所固定的接头为模板，进行桥形扩增，如图4.a所示。
经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。
（4）测序测序方法采用边合成边测序的方法。
向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP（如同Sanger测序法）。
这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP。
在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。
接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并有光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。
这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。
Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP 的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换，目前它的测序错误率在1%-1.5%之间，测序周期以人类基因组重测序为例，30x测序深度大约为1周。
图4. Illumina测序流程1. Roche 454Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。
它的主要测序原理是（图5 abc）2：（1）DNA文库制备454测序系统的文件构建方式和illumina的不同，它是利用喷雾法将待测DNA打断成300-800bp长的小片段，并在片段两端加上不同的接头，或将待测DNA变性后用杂交引物进行PCR扩增，连接载体，构建单链DNA 文库（图5a）。
（2）Emulsion PCR （乳液PCR，其实是一个注水到油的独特过程）454当然DNA扩增过程也和illumina的截然不同，它将这些单链DNA结合在水油包被的直径约28um的磁珠上，并在其上面孵育、退火。
乳液PCR最大的特点是可以形成数目庞大的独立反应空间以进行DNA扩增。
其关键技术是―注水到油‖（水包油），基本过程是在PCR反应前，将包含PCR所有反应成分的水溶液注入到高速旋转的矿物油表面，水溶液瞬间形成无数个被矿物油包裹的小水滴。
这些小水滴就构成了独立的PCR反应空间。
理想状态下，每个小水滴只含一个DNA模板和一个磁珠。
这些被小水滴包被的磁珠表面含有与接头互补的DNA序列，因此这些单链DNA序列能够特异地结合在磁珠上。
同时孵育体系中含有PCR反应试剂，所以保证了每个与磁珠结合的小片段都能独立进行PCR扩增，并且扩增产物仍可以结合到磁珠上。
当反应完成后，可以破坏孵育体系并将带有DNA的磁珠富集下来。
进过扩增，每个小片段都将被扩增约100万倍，从而达到下一步测序所要求的DNA量。
（3）焦磷酸测序测序前需要先用一种聚合酶和单链结合蛋白处理带有DNA的磁珠，接着将磁珠放在一种PTP平板上。
这种平板上特制有许多直径约为44um的小孔，每个小孔仅能容纳一个磁珠，通过这种方法来固定每个磁珠的位置，以便检测接下来的测序反应过程。
测序方法采用焦磷酸测序法，将一种比PTP板上小孔直径更小的磁珠放入小孔中，启动测序反应。
测序反应以磁珠上大量扩增出的单链DNA为模板，每次反应加入一种dNTP进行合成反应。
如果dNTP能与待测序列配对，则会在合成后释放焦磷酸基团。
释放的焦磷酸基团会与反应体系中的ATP硫酸化学酶反应生成ATP。
生成的ATP和荧光素酶共同氧化使测序反应中的荧光素分子并发出荧光，同时由PTP板另一侧的CCD照相机记录，最后通过计算机进行光信号处理而获得最终的测序结果。
由于每一种dNTP在反应中产生的荧光颜色不同，因此可以根据荧光的颜色来判断被测分子的序列。
反应结束后，游离的dNTP会在双磷酸酶的作用下降解ATP，从而导致荧光淬灭，以便使测序反应进入下一个循环。
由于454测序技术中，每个测序反应都在PTP 板上独立的小孔中进行，因而能大大降低相互间的干扰和测序偏差。
454技术最大的优势在于其能获得较长的测序读长，当前454技术的平均读长可达400bp，并且454技术和illumina的Solexa和Hiseq技术不同，它最主要的一个缺点是无法准确测量同聚物的长度，如当序列中存在类似于PolyA的情况时，测序反应会一次加入多个T，而所加入的T的个数只能通过荧光强度推测获得，这就有可能导致结果不准确。
也正是由于这一原因，454技术会在测序过程中引入插入和缺失的测序错误。
图5. Roche 454测序流程1. Solid技术Solid测序技术是ABI公司于2007年开始投入用于商业测序应用的仪器。
它基于连接酶法，即利用DNA 连接酶在连接过程之中测序（图6）2,4。
它的原理是：图6-a. Solid测序技术（1）DNA文库构建片段打断并在片段两端加上测序接头，连接载体，构建单链DNA文库。
（2）Emulsion PCRSolid的PCR过程也和454的方法类似，同样采用小水滴emulsion PCR，但这些微珠比起454系统来说则要小得多，只有1um。
在扩增的同时对扩增产物的3’端进行修饰，这是为下一步的测序过程作的准备。
3’修饰的微珠会被沉积在一块玻片上。
在微珠上样的过程中，沉积小室将每张玻片分成1个、4个或8个测序区域（图6-a）。
Solid系统最大的优点就是每张玻片能容纳比454更高密度的微珠，在同一系统中轻松实现更高的通量。
（3）连接酶测序这一步是Solid测序的独特之处。
它并没有采用以前测序时所常用的DNA聚合酶，而是采用了连接酶。
Solid连接反应的底物是8碱基单链荧光探针混合物，这里将其简单表示为：3’-XXnnnzzz-5’。
连接反应中，这些探针按照碱基互补规则与单链DNA模板链配对。
探针的5’末端分别标记了CY5、Texas Red、CY3、6-FAM这4种颜色的荧光染料（图6-a）。
这个8碱基单链荧光探针中，第1和第2位碱基（XX）上的碱基是确定的，并根据种类的不同在6-8位（zzz）上加上了不同的荧光标记。
