不可忽视的细节—血液基因组提取
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血液基因组DNA提取方法提取步骤:1.8ml抗凝血,4O C,2500rpm离心20min,小心吸去上清血浆,留血细胞;4O C 1×BLB加满2ml 离心管,反复颠倒充分混匀,-20O C静止30min,再摇匀,4O C 5000rpm离心10min,弃上清液;加1.8ml 1×BLB混匀,转入2.0ml离心管;4O C 12000rpm离心3min,弃上清液;加入1×BLB 1ml冲洗红细胞后弃冲洗液留底物(重复该步骤一次),加700ul STE;20%SDS 150ul,加20mg/ml PK 10ul,混匀;65 O C 间歇摇匀反应0.5-1小时;加入1mg/ml RNase A 20ul,混匀,反应30min;置冰上冷却5min,加入700ul饱和酚,摇15min;4O C 12000rpm离心3min,小心吸取上清液于2.0ml离心管;加700ul三氯甲烷,摇匀5min;12000rpm 离心3min,吸上清液于2.0ml离心管,加4O C预冷无水乙醇1ml,反复颠倒混匀,至出现明显纤维状沉淀析出,小心移入4O C预冷1ml 70%酒精中,反复颠倒洗涤沉淀,12000rpm离心3min,小心倾倒除去乙醇,静置待管壁液体完全挥发,加入600ul TE缓冲液溶解DNA,小心混匀待用。
准备试剂:BLB、STE、SDS、PK、RNaseA、饱和酚、三氯甲烷、无水乙醇、70%酒精、TE缓冲液10×红细胞裂解液配制过程:试剂:NH4CL(1.5M)80g;KHCO3(100nM)10g;Na2EDTA(10nM)3.7g;Distilled H2O 1000ml;(加1N HCL或1N NaOH,调节pH值用)。
配制:(1)将NH4CL(1.5M)80g;KHCO3(100nM)10g;Na2EDTA(10nM)3.7g试剂溶于900ml 去离子水中;(2)调节溶液pH值到7.2-7.4,加去离子水定容到1L;(3)在制备工作液时,将此储存液稀释10倍后使用。
从全血和体液中提取基因组DNA 的操作步骤提取DNA 需要的仪器和试剂:⑴ 1.5ml 离心管⑵ 移液管: 1000ul, 200ul, 40ul 各一支和移液管尖头: 100-1000ul, 1-200ul 各一盒⑶ 微型滤柱(备用)⑷ 小型旋转混合器一台⑸ 小型离心机: 可放入1.5ml 离心管和2ml 收集管.⑹ 恒温水浴⑺ 电冰箱: -20 C, 4 C⑻ 无水乙醇(自备)⑼ 70% 乙醇(自备)⑽ 利普生DNA 提取试剂盒。
内含: ⑴ 裂解液1 ⑵ 裂解液2 ⑶消化液 ⑷纯化液⑸弥散液 ⑹蛋白酶K ⑺ 带钩细玻棒一盒 ⑻ 微型滤柱若干。
提取DNA 前注意:⑴ 使血样品内容物达到室温(15 – 25 C )。
⑵ 预热水浴到58 C , 为步骤3作准备。
⑶ 置弥散液于58 C 内,为步骤4或步骤7作准备。
⑷ 所有的离心步骤均在室温下进行。
⑸ lml 全血可提得15-60ug DNA 。
一.从1ml 全血或体液中提取DNA 的步骤:⑴ 裂解1: 取1ml 全血,血桨,血清,淋巴细胞放入到1.5ml 的离心管中,加入400ul 裂解液1。
上下翻转,使沉淀物分散,旋转脉动15秒后放入离心机中离心,离心速率为8000rpm ,1min.。
倒掉上层液,可见离心管底部有血色沉淀。
重复此裂解步骤一次,这次是加入1ml 裂解液1。
最后用移液管吸净所有上层液弃去, 以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液1。
⑵ 裂解2: 在上面离心管中加入1ml 裂解液2。
上下翻转,务必使沉淀物分散, 旋转脉动15秒后放入离心机中离心,8000rpm ,1 min.。
倒掉上清液,可见离心管底部有微量淡红色沉淀。
重复此裂解步骤一次,这次仍然是加入1ml 裂解液2,最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的灰白色沉淀不再残留有裂解液2。
⑶ 消化: 吸取蛋白酶K 10ul ( = 0.2mg )加入到上面的离心管中,用移液管尖头反复吹打, 使蛋白酶K 与沉淀物均匀接触后, 加入320ul 消化液,上下翻转离心管, 务必使沉淀物分散于消化液中。