植物基因组DNA的提取

植物基因组DNA的提取及分析一、植物基因组DNA提取的步骤：1.样本的准备：从植物中选择健康和新鲜的组织样本，如叶片、茎、根等。

样本选择要避免含有大量的绒毛、叶色不正常等因素的部位。

2.细胞破碎：将样本放入液氮中迅速冷冻，然后用研钵和研钉对样本进行研磨，直至样本完全破碎。

3.细胞裂解：将研磨的样本加入裂解缓冲液，边振荡边研磨使样本均匀混合。

4.蛋白质去除：使用酚/氯仿提取法去除蛋白质。

加入等体积的酚/氯仿/异丙醇混合液，轻轻混合，然后离心离心管以分离上清和下层。

5.DNA沉淀：将上清转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇进行DNA沉淀。

静置一段时间后，离心离心管以沉淀DNA。

6.DNA洗涤：将DNA沉淀物用70%乙醇洗涤一至两次，去除残留的盐和其他杂质。

7.DNA溶解：用适量的稳定缓冲液溶解DNA，使其达到一定浓度并避免降解。

二、植物基因组DNA分析的方法：1.PCR扩增：PCR技术可以通过放大DNA片段来研究特定基因或DNA 序列。

首先选择适当的引物，然后将DNA样本与引物、核酸酶、dNTPs等反应液混合，进行多次循环的变温扩增反应。

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳：将PCR扩增的产物与DNA分子量标记物置于聚丙烯酰胺凝胶中，然后进行电泳。

电泳结束后，通过紫外线照射或染色剂染色，观察电泳图谱，可以得到DNA片段的大小和数量。

3.酶切电泳：使用限制性内切酶切割DNA片段，然后将切割后的DNA 片段进行电泳分析。

根据DNA片段的大小和相对迁移速度，可以进行DNA 的分析和比较。

4.南方杂交：将DNA样本与标记了放射性同位素或荧光染料的DNA探针进行杂交反应。

通过探针与目标DNA片段的互补配对，可以检测目标DNA的存在和数量。

5.DNA测序：通过测序技术获得DNA序列信息，可以揭示基因组的结构和功能。

通过以上方法，我们可以提取和分析植物基因组DNA，更好地了解植物基因组的组成和功能，为植物的遗传改良和研究提供重要的信息。

植物基因组DNA提取第一篇：植物基因组DNA提取植物基因组DNA提取一、实验目的1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。

2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。

在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。

十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。

加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验仪器及试剂实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。

实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。

四、实验步骤1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。

2.将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。

3.加入700 μl的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。

4.置于65℃的水浴中，每隔10 min轻轻摇动，30 min后取出。

5.加入200 μl KAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30 min。

6.10000 rpm离心5 min，上清移至新离心管中，12000 rpm离心5 min。

7.上清移至新离心管中，加入700 μl异丙醇，-20℃冰箱30 min。

植物总DNA提取的原理及应用1. 植物总DNA提取的原理植物总DNA提取是一种从植物细胞中分离纯化DNA的方法。

它是研究植物基因组的基础，对于植物遗传学和分子生物学的研究具有重要意义。

以下是植物总DNA提取的主要原理：1.细胞破碎：为了释放细胞内的DNA，需要先将植物细胞破碎。

这可以通过机械方法（如研磨）或化学方法（如细胞壁降解酶）来实现。

2.DNA溶解：破碎的细胞释放出来的DNA会与其他细胞组分（如蛋白质和RNA）结合在一起形成复杂的混合物。

在这一步骤中，可以通过加入特定的缓冲液和洗涤剂来溶解细胞组分，将DNA纯化。

3.酒精沉淀：为了将DNA从溶液中分离出来，可以通过加入高浓度的酒精，使DNA以固体形式沉淀。

4.洗涤和纯化：沉淀的DNA表面可能附着有其他颗粒物。

为了去除这些杂质，可以用酒精和洗涤剂进行多次洗涤和离心。

5.DNA溶解：最后，纯化的DNA溶于适当的溶液（如Tris-EDTA缓冲液），以便后续应用。

2. 植物总DNA提取的应用植物总DNA提取的成功应用于以下几个方面：2.1 植物基因组研究植物总DNA提取是进行植物基因组研究的基础。

通过提取植物总DNA，研究人员可以了解植物基因组的组成、结构和功能。

这对于理解植物的遗传特性、进化历史以及种间亲缘关系具有重要意义。

2.2 植物遗传改良植物总DNA提取技术可以帮助研究人员进行植物遗传改良。

通过提取植物总DNA，可以发现植物中的有用基因或性状相关基因，并进行基因定位和序列分析。

这为培育具有优良性状的新品种提供了基础。

2.3 植物种群遗传学研究植物总DNA提取可以用于研究植物种群的遗传结构和变异情况。

通过分析植物总DNA中的遗传标记（如微卫星和单核苷酸多态性），可以推断不同个体和种群之间的遗传关系、基因流和遗传多样性等重要参数，从而深入了解植物的遗传背景和进化过程。

2.4 植物病害诊断植物总DNA提取可以应用于植物病害的诊断。

通过提取植物总DNA，可以检测病原体的存在和种类，从而确定植物是否感染了某种病害，进而采取相应的病害防治措施。

植物dna提取实验报告植物基因组研究已经成为生物学的一个重要分支，特别是在农业生产和生态环境保护方面。

在这个研究领域中，植物DNA提取是基础且必不可少的一步。

本文将详细介绍植物DNA提取实验的过程、步骤和注意事项。

一、实验材料和仪器本实验所需材料和仪器如下：植物样品、溶解缓冲液、提取缓冲液、酒精、异丙醇、洗涤盐溶液、碱性蛋白酶、液氮、离心机、温水浴、电泳仪、比色皿等。

二、实验步骤1. 样品准备首先，选取新鲜植物样品，清洗并研磨成粉末。

为了提高DNA的纯度，应尽量避免样品中的杂质和污染。

2. DNA提取将研磨后的样品加入提取缓冲液中，并加入适量的洗涤盐和碱性蛋白酶，混匀后加入异丙醇，离心分离DNA。

将得到的上清液加入溶解缓冲液中，使用离心机将DNA沉淀至底部。

上清液中的DNA可以通过多次酒精沉淀提高回收率。

3. DNA纯化将得到的DNA溶于TE缓冲液中，使用电泳方法确定DNA含量和质量。

DNA的含量和质量可以通过紫外线吸收光谱测定和琼脂糖凝胶电泳检测。

4. DNA保存DNA保存有两种方式：一种是在-80℃低温下保存，这种方式比较适合需要长期保存的植物DNA；另一种是将DNA溶液保存在干燥的、无污染的环境中，这种方式比较适合短期保存的植物DNA。

三、注意事项1. 在样品制备和提取过程中，应尽量避免污染和杂质的混入，否则会影响DNA的纯度和质量。

2. 在DNA提取和纯化的过程中，应注意洗涤缓冲液、异丙醇等试剂的使用时间和浓度，以免影响DNA的回收率和纯度。

3. 在电泳检测中，应根据植物物种的不同选择适合的电泳参数，以确保DNA检测的准确性和可靠性。

四、结语DNA提取是植物基因组研究的基础，它是了解植物遗传信息和探究植物繁殖机制的必要步骤。

本实验详细介绍了植物DNA提取的方法和注意事项，希望可以为植物基因组研究者提供帮助。

生命科学学院专业生物技术 2016级生技班666组姓名余梓棋同实验者黄剑宇黄少凯 2018年 5 月 8日题目：植物基因组DNA的提取与检测一．实验目的:1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理；2.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。

二．实验原理1.液氮研磨：液氮能迅速将植物组织温度降到零度以下，使组织细胞变得脆而易碎，此时对植物组织进行研磨，能大大提高研磨的效率，植物组织迅速变为粉末状，增大表面积，提高提取植物DNA的效率。

2.SDS等离子型表面活性剂处理：SDS等离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来，且使DNA保持溶解溶液状态，易于分离3.苯酚和氯仿处理：苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质；4.异丙醇处理：上清液中加入异丙醇使DNA沉淀，离心后DNA沉淀于离心管底部，便于移去提取液。

而后将沉淀DNA溶于TE缓冲液中，即得植物基因组DNA溶液；5.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。

DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。

DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。

因此，要有效地分离不同大小的DNA片生命科学学院专业生物技术 2016级生技班666组姓名余梓棋同实验者黄剑宇黄少凯 2018年 5 月 8日段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。

三．实验材料及设备1.实验材料：新鲜的植物幼嫩叶片2.实验仪器：（1）研磨皿，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，漩涡器；（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。

3.实验试剂：（1）植物DNA提取a.细胞提取液：100mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 5mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl, 1.25% SDS，1%β-巯基乙醇（去除酚类）；b.氯仿:异戊醇（24:1）；c.其它试剂：液氮、无水乙醇、 TE缓冲液、异丙醇、洗涤缓冲液；作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。

实验一植物基因组DNA提取目的：了解植物细胞的特点，掌握植物基因组DNA分离、纯化的原理。

原理：用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品，提取液中的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）能螯合金属离子，以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用，而细胞破碎液中的蛋白酶K在37℃温浴过程中还能降解蛋白质，从而减少了蛋白质对DNA的污染。

然后用CTAB处理，在特定的盐浓度下，CTAB 使基因组DNA处于溶解状态，而蛋白质仍为沉淀。

经细胞破碎液获得的DNA 粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理，其中酚是高效的蛋白变性剂，可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉，然后用氯仿、异戊醇处理，一方面可达到去蛋白的目的，另一方面还可去除残留的酚。

一、材料植物的根、茎、叶。

二、设备移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。

三、试剂1、CTAB或Nacl溶液：4.1克NaCl溶解于80ml水，缓慢加入10克CTAB，加水至100ml。

2、其它试剂：氯仿、异戊醇（24：1），酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），异丙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K（20mg/ml），5mol/LNaCl。

四、操作步骤1、选新鲜无病虫害的叶片用自来水冲洗吸干，用蒸馏水洗两次，然后用超纯水洗一遍，吸干，剪碎称0.5-0.25克。

2、将所取材料放入预冷的研钵（研钵提前要灭菌），研成粉末后置于7ml离心管内（可以换为将样品放置到7ml离心管中800ulＣＴＡＢ后用玻棒捣碎）。

3、加入2.4ml 65℃预热的CTAB，充分混合后65℃水浴90min以上，冷却到室温，加入等体积氯仿异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀4℃离心6000g×10min，取上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇轻轻混匀，-20℃度放置20min，4℃离心5000g×5min，去上清。

4、再沉淀中加入0.6ml的65℃CTAB温育30min，待沉淀充分溶解，加入等体积氯仿异戊醇充分混匀，4℃离心6000g×5min，去上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀-20℃放置20min。

实验6 转基因植物PCR检测一、植物DNA的提取技术(CT AB法)一、实验目的1.掌握用CTAB法提取植物总DNA的方法和基本原理。

2.学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。

二、原理CTAB法[十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)]是一种快速简便的提取植物总DNA的方法。

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，然后加入CTAB，CTAB是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使核酸(DNA、RNA)得以游离出来。

再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。

三、实验材料大豆幼苗[材料的采集与保存对提取DNA的产量和质量有很大影响。

通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料，采集过程中应尽可能保持组织材料所含的水分。

通常的做法是取样时立即用浸湿的纱布包裹采集到的组织材料，放置在带有冷藏功能的采集箱中，这样通常使组织材料在3-5d内仍然保持新鲜。

野外远距离采集样本时，在可能的条件下应冷冻保存（如放置于液氮中）；当不具备冷冻条件时，最好用盛有无水CaSO4的瓶子分别保存，使其迅速干燥，这种方法可将材料保存数月，返回后应尽快进行DNA的提取工作。

那些具有大量次生代谢产物（如单宁、酚类、醌类等）的植物材料，应尽可能采集幼嫩组织。

]四、试剂4.1 CTAB提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na2，1.4mol/L NaCl（如表1），2% CTAB，使用前加入0.1%（V/V）的β-巯基乙醇。

表1 CTAB提取缓冲液配制试剂*名称M.W. 配制1 000mL 配制100mLTris 121.14 12.114g 1.2114gEDTA-Na2372.24 7.4448g 0.74448gNaCl 58.44 81.816g 8.1816g* 用HCl调pH值。

植物基因组DNA的提取及其定性定量分析【实验目的】通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。

【实验原理】CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。

利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。

然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。

把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。

DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。

凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。

核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。

1 OD260相当于dsDNA 50 μg/m l，ssDNA 33 μg/m l和ssRNA 40 μg/m l。

可以此来计算核酸样品的浓度。

紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。

从植物DNA中找到奥妙：提取、扩增与电泳鉴定植物基因组的研究是揭示植物遗传特性以及开展植物基础科学研究的重要手段。

在开展植物DNA研究前，需要实施植物基因组DNA的提取、扩增及电泳鉴定等步骤。

以下是生物科技领域的一些灵活和有趣的技巧，可以助您成功进行植物基因组研究。

一、提取植物基因组DNA1. 细胞破碎法植物组织通常蕴含大量的细胞壁，因此破碎细胞壁是提取植物基因组DNA的一个重要步骤。

通过粉碎植物组织，然后用试剂将细胞排出来即可提取发现植物DNA，从而用于后续步骤。

2. CTAB法这是一种常用的植物基因组DNA提取方法，包括使用CTAB（己基三甲基溴化铵）试剂破解细胞壁。

CTAB法需前期准备，但提取到的DNA质量均很高。

二、扩增植物基因组DNAPCR（聚合酶链反应）是一个非常有用的技术，可使选定DNA序列扩增成百万甚至更多的分子，使它们可用于植物基因组研究。

FBP（前向单一引物PCR）可以用于检测植物基因组单个位点的多态性，这可以用于检测种内个体之间的遗传差异。

三、植物基因组DNA电泳鉴定分子量相似的DNA分子可以通过电泳鉴定分离，因此，DNA电泳成为提纯DNA的主要方式，促进扩大研究样本大小范围的同时又允许研究DNA随时间变化的结果。

电泳是植物DNA研究中必不可少的步骤。

考虑到复杂的操作流程和数据分析过程，实施植物基因组研究的关键是建立一个可重复和可靠的实验流程。

尽管一些方法已经得到确定，但基础技术并没有发展完全需要依靠科研者们的努力和实践。

让我们一起研究植物DNA的提取、扩增及电泳鉴定，加深紧密的交流与学习，与令我们感到兴奋的植物DNA世界同在！。

植物基因组D NA 提取2ml 离心管提取取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下：1. 2.0 ml 离心管加入离心管盖大小新鲜叶片2片；2. 液氮充分研磨成粉末，加入900 µL CTAB 缓冲液；3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次；4. 置于4℃冰箱冷却至15 ℃以下；5. 加入900 µL25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5 分钟，保证样品与氯仿充分混合；6. 12,000 rpm 离心20-30 分钟；7. 取上清液约800 µL，加入预先加好的700 µL 异丙醇的1.5 ml 离心管中，轻轻上下颠倒混匀；8. -20℃冰箱静止30 分钟以上；9. 12,000 rpm 离心15-20 分钟，弃上清夜；10. 75%酒精洗涤沉淀，弃上清液，12,000 rpm 离心15-20 分钟；11. 风干D NA，让酒精挥发干净（4 小时以上或过夜）；12. 加入100 µL 的纯水（含终浓度为1%RNase）溶解D NA；13. 放入37 ℃环境中，约60 分钟消化R NA；14. 取2 µL DNA 进行检测。

50ml 离心管提取取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下：1. 取新鲜叶片在研钵用液氮研磨成粉末；2. 向50ml 离心管里加入叶片粉末，至刚好覆盖住管圆底部，加入20mlCTAB 缓冲液充分混匀；3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次；4. 取出，冷却至15 ℃以下；5. 加入20ml 的25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5min，保证样品与氯仿充分混合；6. 4500rpm 离心40 分钟；（如不需要抽提第2次，可直接到9步骤）7. 小心吸取上清液至新的50ml 离心管中，加入20ml 的氯仿溶液，混匀2-5min左右8. 4500rpm 离心40 分钟；9. 取上清液于50ml 离心管中，加入等体积的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀，此时会看到絮状沉淀；10. -20℃冰箱静止30min 以上；11. 4500rpm 离心40min，弃上清夜；12. 加入5ml 的75%酒精洗涤沉淀，4500 rpm 离心30min，弃上清液；13. 风干D NA，让酒精挥发干净（4 小时以上或过夜）；14. 加入约300 µL 的纯水（含终浓度为1%RNase）溶解D NA；15. 放入37 ℃环境中，约60min 消化R NA；16. 取2 µL DNA 进行检测。

实验一植物基因组DNA提取一、目的与原理DNA是绝大多数生物(除少数RNA病毒外)储存、传递信息的生物大分子。

为了进行DNA 分子的体外重组，必须提取具有天然结构并具有一定长度的DNA大分子。

提取分离DNA大分子，有酚法，氯仿一异丙醇法、酶法、SDS法、CTAB法等方法。

主要操作都是围绕如何尽可能除尽结合蛋白质和多糖等杂质，本实验的目的是介绍CTAB法。

CTAB 法提取基因组DNA 原理：CTAB 是一种非离子去污剂。

CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（＞0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1－0.5 mM NaCl）下CTAB－核酸复合物就因浓度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。

经离心弃上清后，CTAB－核酸复合物再用75％酒精浸泡可洗脱掉CTAB。

二、实验材料、仪器和试剂(一) 实验材料：新鲜的植物叶片（水稻叶子），适量液氮(二) 试剂：(1)EDTA溶液(0.5M、pH=8.0、500 mL)(2)Tris·HCl溶液(1.0 M、pH=8.0、500 mL)(3)2％CTAB抽提液(pH=8.0、500 mL)①称取CTAB粉末10.000 g，NaCl粉末40.908 g，PVP 405.000 g；②0.5M EDTA溶液20 mL；1.0M Tris·Cl溶液50 mL；③定溶至500 mL，121℃高压灭菌后，常温放置，待用。

(4)1×TE缓冲液(pH=8.0、200 mL)(5)RNase(10 mg/mL)1.5 mL离心管(121℃高压灭菌)，加入0.015 g RNase，15μL 1M Tris·Cl溶0.001305 gNaCl(几小粒)，无菌ddH2O(重蒸水)定容至1.5 mL，100℃煮15min；低温放置，待用。

(RNaseA，Sigma，M=487.5)。

（三）仪器通风橱、天平、离心机、摇床、微量移液器、水浴锅、研钵三、植物组DNA提取步骤1.准备工作。

实验四植物DNA的提取一、实验目的掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。

采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。

二、实验原理1、核酸提取的基本原理核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。

核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。

在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。

在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。

因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。

分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。

用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。

如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。

②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。

③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。

吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。

反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。

为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。

生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。

在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。

植物基因组DNA提取实验操作步骤1取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分研磨。

（植物细胞有细胞壁,液氮可以让细胞冷冻起来,变得很脆,这样容易破细胞壁。

同时,液氮的超低温可以大大降低酶活性,防止降解。

注：1、液氮的温度是-196℃，不要冻伤自己的手，带上手套。

2、用一个保温杯，大一点的，把液氮取出来放在保温杯里，盖上盖子。

3、然后用液氮将研磨棒和研钵预冷。

4、将样品快速放入研钵中，快速研磨，在液氮挥发完之前再加入液氮，一定不要让液氮挥发完或者样品呈现那种黏糊的状态，这样样品中DNA容易降解。

5、等到样品呈现细粉末状态了基本就可以了，用药勺把样品迅速舀到1.5ml 离心管里。

）2将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

（水浴时间依实验具体情况而定，看样品裂解情况，具体看裂解液变得清澈透明为止）3加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm（~13,400×g）离心5min。

注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。

4小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。

5将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm（~13,400×g）离心30s，弃掉废液。

（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。

）6向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

CTAB法提取植物基因组DNA原理这种方法是由Murray 和Thompson（1980）修改而成的简便方法。

CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白、多糖类物质分开。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB 溶于乙醇或异丙醇而除去。

(1) 2×CTAB溶液CTAB（W/V）2%Tris-HCl 100mmol/L（pH8.0）EDTA 20mmol/L （pH8.0）NaCl 1.4mol/LPVP 1%灭菌备用。

没灭菌前呈粘稠状，CTAB灭菌后变成清亮的溶液。

(2) 氯仿/异戊醇（24:1）(3) RNaseA 10mg/ml(不用)(4)乙醇或异丙醇(5)β-巯基乙醇(6) 70%乙醇操作程序⏹1．在2mL离心管中，加入500μl的2×CTAB, 65℃预热，用前加入20 μl β-巯基乙醇。

⏹2．嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到预热的离心管中，总体积达到1mL混匀后置65℃水浴中保温45-60min，并不时轻轻转动试管。

⏹注：冻存材料直接研磨，绝对不能化冻。

而且粉末应在化冻前转移，否则内源性DNase有可能降解基因组DNA。

⏹3．加等体积的氯仿/异戊醇，轻轻地颠倒混匀，室温下10 000rpm离心10 min，移上清至另一新管中。

4．加入2倍体积的100%乙醇或0.7倍体积异丙醇，会出现絮状沉淀，-20℃放置30 min 或-80℃放置10min ，12 000rpm 离心10-15min 回收DNA 沉淀。

⏹ 5．用70%乙醇清洗沉淀两次，吹干后溶于适量的灭菌ddH2O 或TE 缓冲液中⏹ 6．0.8%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA 的完整性。

植物基因组DNA快速提取方法
步骤：
1.向无菌的1.5ml的EP管中加入400ul 的DNA提取液；
2.用小剪刀剪取少许（肉眼可见即可）拟南芥幼嫩叶片于上述1.5ml
的EP管中（为了防止DNA交叉污染，剪取一片拟南芥组织后需将剪刀用卫生纸擦干净）；
3.用无菌的研磨棒将1.5ml的EP管中的叶片研磨至无可见叶片颗粒；
4.12000 RPM室温离心5分钟后取上清液于新的1.5ml的EP管中；
5.向上述EP管中加入400ul的异丙醇轻轻混匀后，室温静止10分
钟；
6.12000 RPM室温离心10分钟后弃上清，并加入400ul的70%的乙
醇；
7.混匀后12000 RPM室温离心5分钟后弃上清，将EP管置于37度
培养箱大约10分钟（晾干酒精）；
8.晾干后加入50ul的无菌水溶解基因组DNA;
9.去上述提取好的基因组DNA大约2ul作为模板即可进行后续的
PCR反应；
所需仪器：离心机，1ml和200ul移液枪，无菌研磨棒，无菌的1.5ml 的EP管；卫生纸；
溶液配制：
DNA提取液（500ml）（可长期室温保存）
200mM的Tris盐酸加入100ml 1M 的Tris盐酸存储液（PH：8.0）250mM的NaCl 加入25ml 5M的NaCl存储液
25mM的EDTA 加入25ml 的0.5M的EDTA存储液
0.5%的SDS 加入12.5ml的20%的SDS存储液
选择是难，更何况是心灵选择。

高渐离为了荆轲，他选择了死；马本斋母亲为了革命，她选择了牺牲；祝英台为了真挚爱情，她选择了化蝶。

在这友情、亲情与爱情之间选择，他们是这样做。