实验一 植物基因组DNA提取

实验一-DNA提取实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。

本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。

2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。

提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。

DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。

以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。

当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。

当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。

为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。

关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。

植物基因组DNA的提取及分析一、植物基因组DNA提取的步骤：1.样本的准备：从植物中选择健康和新鲜的组织样本，如叶片、茎、根等。

样本选择要避免含有大量的绒毛、叶色不正常等因素的部位。

2.细胞破碎：将样本放入液氮中迅速冷冻，然后用研钵和研钉对样本进行研磨，直至样本完全破碎。

3.细胞裂解：将研磨的样本加入裂解缓冲液，边振荡边研磨使样本均匀混合。

4.蛋白质去除：使用酚/氯仿提取法去除蛋白质。

加入等体积的酚/氯仿/异丙醇混合液，轻轻混合，然后离心离心管以分离上清和下层。

5.DNA沉淀：将上清转移至新的离心管中，加入等体积的冷乙醇进行DNA沉淀。

静置一段时间后，离心离心管以沉淀DNA。

6.DNA洗涤：将DNA沉淀物用70%乙醇洗涤一至两次，去除残留的盐和其他杂质。

7.DNA溶解：用适量的稳定缓冲液溶解DNA，使其达到一定浓度并避免降解。

二、植物基因组DNA分析的方法：1.PCR扩增：PCR技术可以通过放大DNA片段来研究特定基因或DNA 序列。

首先选择适当的引物，然后将DNA样本与引物、核酸酶、dNTPs等反应液混合，进行多次循环的变温扩增反应。

2.聚丙烯酰胺凝胶电泳：将PCR扩增的产物与DNA分子量标记物置于聚丙烯酰胺凝胶中，然后进行电泳。

电泳结束后，通过紫外线照射或染色剂染色，观察电泳图谱，可以得到DNA片段的大小和数量。

3.酶切电泳：使用限制性内切酶切割DNA片段，然后将切割后的DNA 片段进行电泳分析。

根据DNA片段的大小和相对迁移速度，可以进行DNA 的分析和比较。

4.南方杂交：将DNA样本与标记了放射性同位素或荧光染料的DNA探针进行杂交反应。

通过探针与目标DNA片段的互补配对，可以检测目标DNA的存在和数量。

5.DNA测序：通过测序技术获得DNA序列信息，可以揭示基因组的结构和功能。

通过以上方法，我们可以提取和分析植物基因组DNA，更好地了解植物基因组的组成和功能，为植物的遗传改良和研究提供重要的信息。

实验一SDS法提取植物基因组DNA【实验目的】学习和掌握常用基因组DNA提取方法。

【实验要求】1.设计所采用实验方案并独立完成所有实验操作；2..获得高纯度、完整DNA样品。

一、原理利用含高浓度SDS的抽提缓冲液在较高温度（55—65℃）条件下裂解植物细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后提高盐浓度（KAc）和降低温度（冰上保温）的办法沉淀除去蛋白质和多糖（在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

二、药品试剂及耗材——液氮——提取缓冲液：500 mmol/L NaCl, 100 mmol/L Tris-HCl ph8, 50 mmol/L EDTA ph8，10 mmol/L 2-巯基乙醇（用前加入） ---- 20% SDS ph7.2 ---- 5 mol/L KAc---- 氯仿：异戊醇（24：1）——异丙醇—— 70%乙醇—— TE缓冲液 :10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA,PH8.0 耗材：移液枪，15、2.0、1.5ml离心管，篮、黄、白枪头各四套离心管架4个，离心管盒2个，水浴泡沫8个，研钵及小药勺8套棉手套，薄膜手套，透明胶布，剪刀三、操作程序1. 将1 g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2 ml离心管中。

2. 加入 1.2 ml预热至65℃的提取缓冲液(3V)，轻缓振荡混匀，加入120μl 20%SDS(达到终浓度2%)，混匀，置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。

3. 加入0.45 ml 5M的醋酸钾（1/10V），混匀，冰浴20分钟，在10000 rpm离心20 min。

需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，取上清液转入另一离心管中。

4. 加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀， 12000 rpm离心15 min。

实验一植物组织DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的（1）掌握用氯仿-异戊醇-核糖核酸酶法提取植物组织DNA的基本操作。

（2）掌握植物基因组DNA的提取方法。

（3）了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作。

二、实验原理利用液氮对植物组织冻干脆化进行研磨，从而破碎细胞。

细胞提取液能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来，核裂解液能使细胞核裂解释放DNA。

EDTA 抑制 DNA 酶的活性，氯仿、异戊醇能使蛋白质乳化沉淀去除蛋白，得到的 DNA 溶液经乙醇沉淀。

琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。

琼脂糖是一种线性多糖聚合物。

浓度越高，空隙越小，其分辨能力就越强。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。

溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离的目的。

三、材料、器材及药品1．材料玉米或水稻幼嫩的叶片2．药品十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、山梨醇、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸（HCl）、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基肌氨酸钠、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、液氮、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙酸钠、无水乙醇、RNA酶（RNase A）、乙酸、硼酸、溴酚蓝、溴化乙锭等。

3．器材研钵、研杵、玻璃棒、50mL离心管、1.5mL离心管、水浴锅、离心机、—20℃冰箱、高压灭菌锅、超净工作台、微量移液器及吸头、电泳仪、电泳槽及灌胶模具等。

4．试剂配制（1）DNA提取缓冲液：0.35mol/L山梨醇，0.1mol/L Tris-HCl（pH7.5）（用前需灭菌）。

（2）核裂解缓冲液：0．2mol/L Tris-HCl（pH7.5），0．05mol/L EDTA，2mol/L NaCl，2%CTAB（用前需灭菌）。

（3）5%十二烷基肌氨酸钠（用前需灭菌）。

实验一DNA的小量制备小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）1 实验目的：随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern 分析、酶切及克隆等，这是研究基因结构和功能的重要步骤。

本实验目的是学习从植物材料中提取和测定DNA 的原理并掌握CTAB 提取DNA 的方法，进一步了解DNA 的性质。

2 实验原理细胞中的DNA 绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。

提取DNA 时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，最后用乙醇把DNA 从抽提液中沉淀出来。

DNP 与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。

以NaCl 溶液为例：RNP 在0.14mol/L NaCl中溶解度很大，而DNP 在其中的溶解度仅为纯水中的1％。

当NaCl 浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP 的溶解则随之不断增加。

当NaCl 浓度大于1mol/L 时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2 倍，因此通常可用1.4mol/L NaCl 提取DNA。

为了得到纯的DNA 制品，可用适量的RNase 处理提取液，以降解DNA 中搀杂的RNA。

关于植物总DNA 的提取主要有两种方法：1．CTAB 法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammonium bromide, 简称CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB 与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB 与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB 能溶解于乙醇中。

生命科学学院专业生物技术 2016级生技班666组姓名余梓棋同实验者黄剑宇黄少凯 2018年 5 月 8日题目：植物基因组DNA的提取与检测一．实验目的:1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理；2.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。

二．实验原理1.液氮研磨：液氮能迅速将植物组织温度降到零度以下，使组织细胞变得脆而易碎，此时对植物组织进行研磨，能大大提高研磨的效率，植物组织迅速变为粉末状，增大表面积，提高提取植物DNA的效率。

2.SDS等离子型表面活性剂处理：SDS等离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来，且使DNA保持溶解溶液状态，易于分离3.苯酚和氯仿处理：苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质；4.异丙醇处理：上清液中加入异丙醇使DNA沉淀，离心后DNA沉淀于离心管底部，便于移去提取液。

而后将沉淀DNA溶于TE缓冲液中，即得植物基因组DNA溶液；5.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。

DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。

DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。

因此，要有效地分离不同大小的DNA片生命科学学院专业生物技术 2016级生技班666组姓名余梓棋同实验者黄剑宇黄少凯 2018年 5 月 8日段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。

三．实验材料及设备1.实验材料：新鲜的植物幼嫩叶片2.实验仪器：（1）研磨皿，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，漩涡器；（2）电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。

3.实验试剂：（1）植物DNA提取a.细胞提取液：100mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 5mmol/L EDTA,500mmol/L NaCl, 1.25% SDS，1%β-巯基乙醇（去除酚类）；b.氯仿:异戊醇（24:1）；c.其它试剂：液氮、无水乙醇、 TE缓冲液、异丙醇、洗涤缓冲液；作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。

实验一植物DNA的提取与纯化一、实验目的：掌握植物DNA的提取与纯化的原理和一般步骤。

二、实验原理：植物DNA的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学研究的基础要求。

对DNA提取一般有三个要求：1. DNA的纯度可以满足下游操作的要求；2. DNA必须完整；3. DNA应当有足够的量。

一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。

而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。

天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。

要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白质和糖去除，同时除去RNA及无机离子等，从中分离DNA 。

提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法，对它们进行稍加修改就可以应用于DNA的微量提取。

两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。

本实验采用SDS法提取DNA。

SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。

具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。

细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。

EDTA抑制DNA酶的活性。

再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。

三、实验材料和试剂：1.实验材料：新鲜植物组织（小麦嫩叶）。

2.器材：研钵和研棒、水浴锅、离心机、移液器及枪头、离心管。

3.药品试剂：提取液、无水乙醇、70%乙醇、TE缓冲液、氯仿:戊醇（24:1）。

四、实验步骤：1.取新鲜叶片约3g, 剪碎, 加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中；2.在65℃预热的提取液中按3.8g/L加入Na Bisufite，充分混匀；3.在管中加入适量提取液，60℃水浴保温约30min，不时颠倒混匀；4.冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇动15min左右；5.室温下10000rpm离心15min，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体积的冷酒精，-20 ℃放置1h；6.挑出DNA置于新的管中。

实验一植物基因组DNA提取目的：了解植物细胞的特点，掌握植物基因组DNA分离、纯化的原理。

原理：用植物基因组DNA提取液处理研磨、收集后的样品，提取液中的乙二胺四乙酸二钠（EDTA）能螯合金属离子，以防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解作用，而细胞破碎液中的蛋白酶K在37℃温浴过程中还能降解蛋白质，从而减少了蛋白质对DNA的污染。

然后用CTAB处理，在特定的盐浓度下，CTAB 使基因组DNA处于溶解状态，而蛋白质仍为沉淀。

经细胞破碎液获得的DNA 粗提取液再用酚、氯仿、异戊醇处理，其中酚是高效的蛋白变性剂，可进一步将蛋白、脂类和细胞碎片去掉，然后用氯仿、异戊醇处理，一方面可达到去蛋白的目的，另一方面还可去除残留的酚。

一、材料植物的根、茎、叶。

二、设备移液管，高速冷冻离心机，台式离心机，水浴锅。

三、试剂1、CTAB或Nacl溶液：4.1克NaCl溶解于80ml水，缓慢加入10克CTAB，加水至100ml。

2、其它试剂：氯仿、异戊醇（24：1），酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），异丙醇，TE，10%SDS，蛋白酶K（20mg/ml），5mol/LNaCl。

四、操作步骤1、选新鲜无病虫害的叶片用自来水冲洗吸干，用蒸馏水洗两次，然后用超纯水洗一遍，吸干，剪碎称0.5-0.25克。

2、将所取材料放入预冷的研钵（研钵提前要灭菌），研成粉末后置于7ml离心管内（可以换为将样品放置到7ml离心管中800ulＣＴＡＢ后用玻棒捣碎）。

3、加入2.4ml 65℃预热的CTAB，充分混合后65℃水浴90min以上，冷却到室温，加入等体积氯仿异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀4℃离心6000g×10min，取上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇轻轻混匀，-20℃度放置20min，4℃离心5000g×5min，去上清。

4、再沉淀中加入0.6ml的65℃CTAB温育30min，待沉淀充分溶解，加入等体积氯仿异戊醇充分混匀，4℃离心6000g×5min，去上清加入2/3体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀-20℃放置20min。

实验1 转基因植物PCR 检测一、植物DNA 的提取技术(CTAB 法)一、实验目的1.掌握用CTAB 法提取植物总DNA 的方法和基本原理。

2.学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA 抽提方法。

二、原理CTAB 法[十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide ，简称为CTAB)]是一种快速简便的提取植物总DNA 的方法。

通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，然后加入CTAB ，CTAB 是离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使核酸(DNA 、RNA)得以游离出来。

再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA 、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。

上清液中加入无水乙醇使DNA 沉淀，沉淀DNA 溶于TE 溶液中，即得植物总DNA 溶液。

三、实验材料大豆幼苗[材料的采集与保存对提取DNA 的产量和质量有很大影响。

通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料，采集过程中应尽可能保持组织材料所含的水分。

通常的做法是取样时立即用浸湿的纱布包裹采集到的组织材料，放置在带有冷藏功能的采集箱中，这样通常使组织材料在3-5d 内仍然保持新鲜。

野外远距离采集样本时，在可能的条件下应冷冻保存（如放置于液氮中）；当不具备冷冻条件时，最好用盛有无水CaSO4的瓶子分别保存，使其迅速干燥，这种方法可将材料保存数月，返回后应尽快进行DNA 的提取工作。

那些具有大量次生代谢产物（如单宁、酚类、醌类等）的植物材料，应尽可能采集幼嫩组织。

]四、试剂4.1 CTAB 提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl （pH8.0），20 mmol/L EDTA-Na 2，1.4mol/L NaCl （如表1），2% CTAB ，使用前加入0.1%（V/V ）的β-巯基乙醇。

表1 CTAB 提取缓冲液配制4.2 TE 缓冲液：10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA （ pH8.0）。

实验一植物基因组DNA提取一、目的与原理DNA是绝大多数生物(除少数RNA病毒外)储存、传递信息的生物大分子。

为了进行DNA 分子的体外重组，必须提取具有天然结构并具有一定长度的DNA大分子。

提取分离DNA大分子，有酚法，氯仿一异丙醇法、酶法、SDS法、CTAB法等方法。

主要操作都是围绕如何尽可能除尽结合蛋白质和多糖等杂质，本实验的目的是介绍CTAB法。

CTAB 法提取基因组DNA 原理：CTAB 是一种非离子去污剂。

CTAB 与核酸形成复合物，此复合物在高盐（＞0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1－0.5 mM NaCl）下CTAB－核酸复合物就因浓度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。

经离心弃上清后，CTAB－核酸复合物再用75％酒精浸泡可洗脱掉CTAB。

二、实验材料、仪器和试剂(一) 实验材料：新鲜的植物叶片（水稻叶子），适量液氮(二) 试剂：(1)EDTA溶液(0.5M、pH=8.0、500 mL)(2)Tris·HCl溶液(1.0 M、pH=8.0、500 mL)(3)2％CTAB抽提液(pH=8.0、500 mL)①称取CTAB粉末10.000 g，NaCl粉末40.908 g，PVP 405.000 g；②0.5M EDTA溶液20 mL；1.0M Tris·Cl溶液50 mL；③定溶至500 mL，121℃高压灭菌后，常温放置，待用。

(4)1×TE缓冲液(pH=8.0、200 mL)(5)RNase(10 mg/mL)1.5 mL离心管(121℃高压灭菌)，加入0.015 g RNase，15μL 1M Tris·Cl溶0.001305 gNaCl(几小粒)，无菌ddH2O(重蒸水)定容至1.5 mL，100℃煮15min；低温放置，待用。

(RNaseA，Sigma，M=487.5)。

（三）仪器通风橱、天平、离心机、摇床、微量移液器、水浴锅、研钵三、植物组DNA提取步骤1.准备工作。

实验一植物基因组DNA提取所需试剂1、1M Tris·Cl (pH 8.0)：称Tris·base 12.11g，加50ml水，用玻璃棒或搅拌器搅拌，用浓HCl 调pH 至8.0，定容至100ml，分装后高压灭菌。

(100ml)2、0.5M EDTA (pH 8.0)：称16.82g EDTA 溶于80ml水中，用NaOH调pH 至8.0，加水定容至100ml，高压灭菌。

(100ml)3、5M NaCl: 在80ml水中加入29.2g NaCl, 加水定容至100 ml, 分装后高压灭菌。

(100ml)4、SDS（20%）：在90ml水中溶解20g电泳级SDS，加热至68℃助溶，用HCl 调pH至7.2,加水定容至100ml,高压灭菌。

5、STE溶液：0.5mol/l NaCl，100 mmol/l Tris.Cl (pH8.0)，5mmol/l EDTA (pH8.0)，1.25% SDS, 高压灭菌。

500 ml STE: 在200ml 水中加入50ml 5M NaCl, 50ml 1M Tris·Cl, 5ml 0.5M EDTA, 31.25 ml 20% SDS,加水定容至500 ml.STE 酚/ 氯仿异丙醇70%乙醇ddH2O离心管及盒枪头及枪头盒移液枪离心机水浴锅离心管架研钵牙签记号笔剪刀磁盘写黑板实验一植物基因组DNA的提取一、实验目的通过本实验学习从植物组织中提取DNA的方法和实验技术。

二、实验原理在低温条件下对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。

细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀。

EDTA抑制DNA酶的活性，再用酚氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液经异丙醇或乙醇沉淀。

三、实验步骤１、取５片新鲜植物叶片，研磨成粉末状；２、转移至1.5 mL离心管中，加入600uL 细胞提取液，充分混合，65℃保温20min；３、12000r/min 离心10min；４、将上清液转移至另一支离心管中；５、加入等体积酚/氯仿（１：１）混合均匀，12000r/min 离心５min；６、将上清液转移至新的离心管中，加入等体积氯仿混合均匀，12000r/min 离心５min；７、取上清，加入等体积的异丙醇，混合均匀；８、12000r/min 离心５min，弃上清，沉淀用600uL 70%乙醇清洗；９、晾干后，加入100uL双蒸水溶解DNA。

实验一SDS法提取植物基因组DNA 一材料、试剂和仪器
1材料新鲜的组织材料或-80℃冻存的材料
2试剂
(1)提取缓冲液
Tris-HCl100mmol/L（pH8.0）
EDTA50mmol/L（pH8.0）
NaCl500mmol/L
灭菌后加β-巯基乙醇至10mmol/L
(2)裂解液20%SDS
(3)高盐溶液5mol/LKAc
(4)RNaseA10mg/ml
(5)异丙醇
(6)灭菌ddH2O或TE
3.仪器:离心机，恒温水浴,台式高速离心机，电泳装置
二实验程序
1、取幼嫩的组织材料1-2g,用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌
ddH2O冲洗2次，放入经液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状，用干净的灭菌不锈钢勺转移粉末到加有500μL提取液的离心管中,轻轻混匀。

2、向管中加入50μL20%SDS溶液，混匀，不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂，65℃保温10min，并不时摇动。

3、加入150μL5mol/LKAc，混匀，置冰上20-30min。

4、4℃,15000rpm离心15min,转移上清到另一离心管中，加入0.7V的异丙醇，混匀，-20℃沉淀30min。

5、12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀，吹干后加入适量的灭菌ddH2O或TE溶解DNA。

6、加入1/10体积的RNaseA，37℃保温20min，除去RNA。

7、CI抽提后，加2V乙醇，-20℃沉淀30min。

12000rpm离心10min回收基因组DNA沉淀。

8、用400μL70%乙醇洗一次后，吹干，加入适量的灭菌ddH2O 或TE溶解DNA。

9、电泳检测完整性。

实验一--CTAB法提取植物基因组DNA.doc
CTAB法是一种提取植物基因组DNA的标准技术，它是将植物组织或细胞固定剂与有机溶剂混合溶解后，利用高通量PCR技术显微镜适用的植物DNA提取方法，将病毒与细菌遗
传学上的DNA提取技术应用到植物DNA提取上来。

CTAB法的提取策略主要是先收缩细胞壁，然后分解细胞质，使DNA与蛋白质、核酸等其他物质分离。

有两种方法可以用于收缩细胞壁，一种是使用脱水剂，另一种是使用温和
的柱状体破碎物质，这两种方法可以使细胞壁被开裂。

随后，有机溶剂被用来分离DNA，
有机溶剂会与蛋白质和核酸结合，然后消除组织成份，使DNA易于收集。

在有机溶剂洗涤后，用CTAB溶液在冰上半小时沉淀DNA，紧接着用脱盐水冲洗，最后用70%的乙醇对DNA
进行沉淀。

最后，DNA可以被收集，净化，脱水或冻存，随时可用。

此外，为了获得精确的结果，在使用CTAB法提取植物基因组DNA时也有一些需要考
虑的因素，其中包括样本所处的第一步，样品消毒，采取合适的收缩细胞壁和有机溶剂剂量，CTAB溶液沉淀时间，脱盐水洗涤次数，乙醇沉淀次数，DNA注射缓冲液等，如果这些
步骤都能得到恰当的处理，则可以保证获得的 DNA 极为纯净。

为了提高植物DNA提取效率，CTAB法在提取植物基因组DNA时也可以使用DNA限制酶，例如酸性磷酸酶和热胡萝卜素变性酶之类的酶，这种方法可以使细胞壁更易被分解，从而
使DNA更容易被收集。

总而言之，CTAB法提取植物基因组DNA是一种比较有效的方法，能够获得更高质量的DNA，但是在使用这种技术提取植物DNA时，需要注意一些关键的步骤及酶的使用，以确
保获得的DNA有较高的纯度。