CTAB法提取植物DNA

关于CTAB法提取基因组DNA，原理CTAB法原理CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。

通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

CTAB提取缓冲液的经典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，在于液相中；CTAB 溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

用酚抽提细胞DNA时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。

用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。

蛋白分子溶于酚相，而DNA 溶于水相。

使用酚的优点：1.有效变性蛋白质；2抑制了DNase的降解作用。

缺点：1.能溶解10-15%的水，从而溶解一部分poly(A)RNA。

2.不能完全抑制RNase的活性。

氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。

最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。

（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。

异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。

另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

ctab法提取dna实验报告CTAB 法提取 DNA 实验报告一、实验目的掌握 CTAB 法提取 DNA 的原理和操作方法，提取高质量的植物或微生物 DNA，为后续的分子生物学实验（如 PCR、基因测序等）提供纯净的 DNA 样本。

二、实验原理CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液中能与核酸形成复合物，并通过离心将其与蛋白质、多糖等杂质分离。

随后，用乙醇或异丙醇沉淀 DNA，使其从溶液中析出。

三、实验材料与试剂1、实验材料选取新鲜的植物叶片（或微生物培养物）。

2、实验试剂CTAB 提取缓冲液：2% CTAB，14 M NaCl，20 mM EDTA，100 mM TrisHCl（pH 80），02% β巯基乙醇（使用前加入）。

氯仿异戊醇（24 ： 1）异丙醇70% 乙醇TE 缓冲液（10 mM TrisHCl，1 mM EDTA，pH 80）四、实验仪器与设备1、高速冷冻离心机2、恒温水浴锅3、移液器4、涡旋振荡器5、微量紫外分光光度计五、实验步骤1、材料处理植物材料：取新鲜植物叶片约 2 g，用液氮速冻后研磨成粉末。

微生物材料：收集一定量的微生物培养物，离心收集菌体，用无菌水洗涤后重悬。

2、加入提取缓冲液将研磨好的植物粉末（或重悬的微生物）迅速转移至离心管中，加入预热至 65℃的 CTAB 提取缓冲液，充分混匀，65℃水浴保温 30 60 分钟，期间不时轻轻颠倒混匀。

3、抽提加入等体积的氯仿异戊醇（24 ： 1），涡旋振荡 10 15 分钟，使其充分混匀，然后 12000 rpm 离心 10 15 分钟。

4、转移上清用移液器小心吸取上清液至新的离心管中，避免吸取中间的蛋白质层。

5、 DNA 沉淀向上清液中加入 06 07 倍体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置10 20 分钟，使 DNA 沉淀。

6、离心收集12000 rpm 离心 10 15 分钟，弃上清。

7、洗涤用 70% 乙醇洗涤沉淀 2 3 次，每次离心 5 10 分钟，弃上清。

CTAB法提取植物基因组DNACTAB法原理CTAB（Cetyl trimethyl ammonium bromide），十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，具有从低离子强度溶液中沉淀核酸的特性。

当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3 mol/L NaCl）时，CTAB-核酸的复合物从溶液中沉淀，通过离心就可将其与蛋白，多糖类物质分开，在经过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，不能沉淀核酸。

CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

另外，它还能保护DNA不受内源核酸酶的降解。

主要试剂与溶液的配制：PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）巯基乙醇氯仿︰异戊醇（24︰1）异丙醇70%乙醇Tris-苯酚RNaseA无水乙醇CTAB 溶液：CTAB——20g/LNaCl（58.44）——1.4 mol/L（81.816g）EDTA（292.25）——10 mmol/L（2.9225g）Tris（121.14）——100 mmol/L（12.114g）pH 8.01×TE 缓冲液：EDTA（292.25）——1 mmol/L（0.29225g）Tris（121.14）——10 mmol/L（1.2114g）pH 8.0NaAC溶液：NaAC（82.03）——3mol/L（246.09g）pH 4.0植物总DNA的提取1、取适量甘薯新鲜叶片，用液氮迅速研磨，中间加PVP（聚乙烯吡咯烷酮K30）少许，成粉末后转入10mL的离心管中，放入液氮或-80℃冰箱储存（在研磨样品时，研的细和研的粗，提出的DNA量可以相差几倍，所以，在液氮保护的很好的情况下尽量多研磨几次）。

提取植物DNA方法提取植物DNA的方法有许多种，下面将介绍其中几种常用的方法。

1. CTAB法CTAB法（Cetyltrimethylammonium Bromide法）是一种经典的植物DNA 提取方法，适用于多种植物样本。

其基本步骤如下：（1）取植物样本，如叶片、茎等，将其研磨成细碎的粉末。

（2）将粉末加入含有CTAB（一种能溶解细胞膜的表面活性剂）的提取缓冲液中，加入蛋白酶K（能降解蛋白质）和β-巯基乙醇（能还原核酸）。

（3）在65下进行细胞破裂和DNA溶解。

（4）通过氯仿/异戊醇提取和乙醇沉淀的方法，将DNA从混合物中分离出来。

（5）最后用纯净水洗涤DNA，使其得以纯化。

2. 高盐法高盐法属于常规的DNA提取方法，适用于大部分的植物样本。

基本步骤如下：（1）取捣碎的植物材料加入含有高盐浓度的提取缓冲液中，并加入蛋白酶K和β-巯基乙醇。

（2）在室温下进行混合，并在高温下（如65）进行DNA的溶解。

（3）通过氯仿/异戊醇提取和乙醇沉淀的方法，将DNA分离和纯化出来。

（4）最后用纯净水洗涤DNA，使其得以纯化。

3. 磁珠法磁珠法是一种相对快速、高效的DNA提取方法，基于磁珠与DNA之间的亲和力。

该方法需要使用一些商业化的提取试剂盒，操作过程相对简单，适用于大规模样本的提取。

基本步骤如下：（1）将植物样本加入含有提取缓冲液和蛋白酶K的试管中，同时加入磁珠试剂。

（2）在高温下进行DNA的溶解和蛋白质的降解。

（3）将混合物与磁珠结合，并使用磁力架将DNA磁珠复合物分离出来。

（4）对磁珠复合物进行洗涤和溶解，获得纯化的DNA。

4. 二硫苏糖盐法二硫苏糖盐法是一种用于植物材料中DNA提取的改良方法，适用于纤维素含量较高的植物样本。

基本步骤如下：（1）将植物材料加入二硫苏糖盐提取缓冲液中，加入蛋白酶和β-巯基乙醇。

（2）对细胞质进行破裂和溶解，使DNA释放到溶液中。

（3）通过异丙醇的加入，将DNA从混合物中分离和沉淀。

CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)原理：CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

一、CTAB提取缓冲液的经典配方：Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。

二、CTAB提取缓冲液的改进配方：(1) PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA 中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖；(2) 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化；(3)多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。

用多糖水解酶将多糖降解。

在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。

用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500 μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化；(4) 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合；(5) 盐离子的去除：70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸，其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积的NaAc(pH5.2,3M)，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙醇洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE 中的EDTA能螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为8.0，可防止DNA发生酸解。

CTAB法提取植物总DNA
实验原理
CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。

在高离子强度的溶液中(>0.7mol/LNaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。

采用机械破碎植物细胞，然后加入CTAB分离缓冲液将DNA溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。

实验步骤
1. 取1-50g新鲜植物材料，于液氮中研成粉。

2. 将冻粉转入预冷的离心管中，立即加入等体积(w/v) 2×CTAB提取缓冲液，65℃保温10-20分钟，其间不时摇动。

3. 加入等体积的氯仿/异戊醇，轻缓颠倒离心管混匀，室温下，12000r/min 离心10-20分钟。

4. 将上清液转入另一离心管中,加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管混匀，室温、12000r/min 离心10分钟。

5. 将上层水相转入新的经硅烷化处理的离心管中，加入0.6-1倍体积的异丙醇,混匀，室温下放置30分钟。

6. 3500-4000r/min 离心5-10分钟，去上清液, 70%乙醇漂洗，沉淀吹干。

7. 风干后加入40ul的TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存备用。

8. 取2ul溶液电泳检测。

注意事项
所有操作均须温和，避免剧烈震荡。

1)取0.1~0.2 g幼叶片放入液氮预冷的研钵液氮种研磨成粉。

加入含有65℃预热的1 000 μl CTAB裂解液和20 μlβ-巯基乙醇的2 ml离心管中，65℃水浴裂解40~60 min，每隔10min颠倒混匀一次。

然后常温12 000 r/min离心10 min。

2)取上清，加入2 ml离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1), 旋涡混匀，4℃, 12 000 r/min, 离心10 min。

重复这一步骤至界面清晰。

3)取上清，加入到1. 5 ml离心管, 加入两倍体积-20℃预冷的无水乙醇和1/10体积3M的NaAc(pH=5.2), 小心颠倒均匀，-20℃沉淀10~30 min。

4)4℃, 12 000 r/min, 离心10 min。

弃上清，用70%的乙醇洗2~3次。

室温干燥30 min。

5)加入1μl 10 mg/ml RNase，37℃温浴30-60 min去除RNA。

6)溶于40μl灭菌的ddH2O，琼脂糖凝胶检测。

注：无水乙醇、NaAc、70%的乙醇预冷7)取0.1~0.2 g植物材料放入液氮预冷的研钵液氮种研磨成粉。

加入含有65℃预热的1 000 μl CTAB裂解液和20 μlβ-巯基乙醇的2 ml 离心管中，65℃水浴裂解40~60 min，每隔10min颠倒混匀一次。

8)加入等体积氯仿：异戊醇(24：1), 旋涡混匀静置3 min，4℃, 12 000r/min, 离心10 min。

9)取上清800 μl于2 ml离心管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1), 旋涡混匀冰上静置3 min，4℃, 12 000 r/min, 离心10 min。

10)取上清600μl，加入1/30体积的NaAc（3M，pH=5.2）和1/10体积的无水乙醇（均预冷），混匀，在冰上静置10 min，再加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，4℃，12 000 r/min, 离心10 min。

CTAB提取植物DNA步骤一、将冷冻干燥的样品用液氮研磨成粉末，转移到离心管，加入65℃预热的2ml CTAB抽提液，65℃保温30 min 以上，间或轻摇混匀；12 000 r／min室温离心10 min，取上清液；二、加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，轻轻混匀15 min 以上，12 000 r／min室温离心10 min，用剪去端部约0．8 cm的1 mL 吸头小心将上层液相转移至一干净的Eppendorf管中；加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀，12000 r/min 离心5 min 。

三、加入2/3体积( )的-20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动5 min，颠倒混匀至有白色絮状沉淀出现，在4℃下12000 r／min离心l0 min，沉淀出DNA，去上清；四、沉淀用75％乙醇／和0.2mol／L KAC洗涤2次，每次12000 r ／min室温离心10 min；五、加入预冷的无水乙醇，轻轻上下颠倒，l2 000 r／min室温离心20 min，弃乙醇，自然晾干；加入200μL 去离子水，轻轻敲打使沉淀溶解；六、加入l μL 10 mg／mL Rnase37℃水浴，保温l h，去除RNA；DNA 提取物于-20℃冰箱贮藏备用．一、母液配制方法1、1M Tris-HCl 1L配制量配制方法称量121.1g Tris 置于1L烧杯中。

加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。

按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。

pH值浓盐酸7.4 70ml7.6 60ml8.0 42ml将溶液定容到1L。

高温高压灭菌后，室温保存。

注意：应使溶液冷却后加调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。

2、5M NaCl 配制量 1L配制方法称取292.2gNaCl置于1L 烧杯中，加入约800 ml的去离子水后搅拌溶解加去离子水将溶液定容到1L 后，适量分成小份,高温高压灭菌后，4℃保存。

CTAB配方及植物DNA提取方法主要试剂的配制参考（美）萨姆布鲁克（sambrook，j.）等.分子克隆实验指南（下册）配置如下[94]：（1）0.5mo1/ledta(ph8.0)：称取edta-na218.61g，提80ml双蒸水，磁力搅拌器上频繁烘烤。

重新加入7ml10mo1/lnaoh调到ph8.0再用双蒸水定容至100ml，在1.03×105pa之下高压杀菌20min。

（2）5mol/lnacl溶液：称取nacl29.22g，溶解于90ml的双蒸水，加热到80℃溶解，冷却，再用双蒸水定容100ml，在高压灭菌20min。

（3）10mol/lnaoh溶液：称取40.00gnaoh溶80ml的双蒸水，烘烤，定容至100ml。

（4）1mol/ltris-hc1溶液(ph8.0)：称取12.114gtris碱，溶80ml的双蒸水，重新加入浓hc14.2ml，调整phsuperficial8.0，搅拌定容至100ml，高压杀菌20min。

（5）10%ctab（m/v）：称取ctab10.00g，熔化于80ml的双蒸水，冷却推动熔化，提双蒸水定容至100ml，室温留存。

（6）5mo1/lkac溶液(ph4.8和6.5)：分别称取kac晶体49.07g，溶于80ml的双蒸水，再用冰乙酸调至ph4.8和6.5，加双蒸水定容到100ml，在1.03×105pa之下杀菌20min。

4℃留存。

（7）3mo1/lnaac3h2o溶液(ph5.2)：称取naac晶体20.412g熔化于约30ml的双蒸水，用冰乙酸调到ph5.2，提双蒸水定容至50ml，高压杀菌20min。

4℃留存。

（8）提取缓冲液（0.4mol/l葡萄糖，3%pvp，2％β-巯基乙醇）250ml：称取葡萄糖19.817g、pvp7.50g，加水溶解并定容到250ml，在1.03×105pa下灭菌20min，β-巯基乙醇现用现加。