毛细管区带电泳

毛细管区带电泳（CZE）分离硝基苯酚异构体一、实验背景毛细管电泳、气相色谱、液相色谱是目前应用最广泛的高效分离技术，与气相色谱、液相色谱相比，毛细管电泳具有许多独特的优点，如分析速度快、柱效可高达数十万塔板/米、适用于带电样品的分离等，另外毛细管电泳具有样品消耗少、实验试剂成本低等优点，已广泛应用于生物、医药等领域的分离检测。

毛细管电泳技术是现代分离科学中必不可少的重要内容。

二、实验目的1．了解CZE分离的基本原理。

2．了解毛细管电泳仪的基本构造，掌握其基本操作技术。

3．学会计算CZE的重要参数。

4．运用CZE分离硝基苯酚异构体。

三、实验原理毛细管电泳是指以毛细管为通道、以高压直流电场为驱动力的一类液相分离分析技术。

毛细管区带电泳是最常用的一种毛细管电泳分离模式，它是根据被分离物质在毛细管中的迁移速度不同进行分离。

毛细管电泳分离分析装置如图1所示。

被分离物质在毛细管中的迁移速度决定于电渗淌度和该物质自身的电泳淌度。

一定介质中的带电离子在直流电场作用下的定向运动称为电泳。

单位电场下的电泳速度称为电泳淌度或电泳迁移率。

电泳速度的大小与电场强度、介质特性、离子的有效电荷及其大小和形状有关。

电渗是伴随电泳而产生的一种电动现象。

就毛细管区带电泳而言，电渗是指毛细管中电解质溶液在外加直流电场作用下的整体定向移动。

电渗起因于固液界面形成的双电层。

用熔融石英拉制成的毛细管，其内壁表面存在弱酸性的硅羟基，当毛细管中存在一定pH值的缓冲液时，硅羟基发生电离，在毛细管内壁形成带负电荷的“定域电荷”。

根据电中性的要求，“定域电荷”吸引缓冲液中的反号离子（阳离子）形成双电层。

在直流电场作用下双电层中的水合阳离子向负极迁移，并通过碰撞等作用给溶剂施加单向推力，使之通向运动，形成电渗。

单位电场下的电渗速度称为电渗淌度。

电渗速度与毛细管中电解质溶液的介电常数和粘度、双电层的 电势以及外加直流电场强度有关。

若同时含有阳离子、阴离子和中性分子的样品溶液在正极端引入毛细管后，在外加直流电场的作用下，样品组分在毛细管中的迁移情况如图2所示。

毛细管电泳法概述毛细管电泳法是一种分离和测定化合物的方法，主要通过在毛细管中施加电场，利用化合物在电场作用下的电荷性质和分子大小来实现分离。

毛细管电泳法具有快速、高效、高分辨率、高灵敏度和易于自动化等特点，广泛应用于生命科学、化学分析和药物研发等领域。

原理毛细管电泳法的原理基于化合物在溶液中的电荷性质和分子大小。

在毛细管中施加电场后，带正电荷的化合物（称为阳离子）会向负极移动，带负电荷的化合物（称为阴离子）会向正极移动。

此外，较小的分子会比较大的分子更快地移动。

毛细管电泳法通常涉及两种类型：区域电泳和溶剂前移电泳。

区域电泳区域电泳是毛细管电泳法中常用的方法。

在区域电泳中，毛细管中的电场强度不均匀，其中一个区域的电场强度较弱，另一个区域的电场强度较强。

样品被注入到电场强度较弱的区域，然后通过施加电场使样品向较强的电场区域移动。

不同化合物的迁移速度取决于它们的电荷和分子大小，因此可以实现化合物的分离。

溶剂前移电泳溶剂前移电泳是另一种常用的毛细管电泳法。

在溶剂前移电泳中，毛细管中的电场强度是均匀的。

样品被注入到毛细管中，然后施加电场使样品移动。

不同化合物的迁移速度取决于它们在溶剂中的溶解度和电荷性质，因此可以实现化合物的分离。

仪器和操作步骤进行毛细管电泳法需要一些特定的仪器和材料，如毛细管电泳仪、毛细管、高电压电源、样品注射器、电解质缓冲液等。

下面是一般的操作步骤：1.准备工作：检查仪器是否正常工作，准备所需的电解质缓冲液和样品。

2.毛细管准备：将毛细管切割为适当长度，并连接到毛细管电泳仪。

3.缓冲液填充：将电解质缓冲液注入毛细管的两端，确保整个毛细管都充满缓冲液。

4.样品注射：使用样品注射器将待分离的样品缓慢而均匀地注入到毛细管中。

注射点距离电极一定距离。

5.施加电场：从高电压电源上施加适当的电场，在实验过程中保持稳定电场。

6.记录结果：观察样品的迁移情况，根据需要调整电场强度和时间，记录分离结果。

毛细管电泳法分离水杨酸、苯甲酸及阿司匹林中的含量测定毛细管电泳法分离水杨酸、苯甲酸及阿司匹林中的含量测定毛细管电泳又称高效毛细管电泳( High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 是一种仪器分析方法。

通过施加10-40kV 的高电压于充有缓冲液的极细毛细管，对液体中离子或荷电粒子进行高效、快速的分离。

现在，HPCE 已广泛应用于氨基酸、蛋白质、多肽、低聚核苷酸、DNA 等生物分子分离分析，药物分析，临床分析，无机离子分析，有机分子分析，糖和低聚糖分析及高聚物和粒子的分离分析。

人类基因组工程中DNA 的分离是用毛细管电泳仪进行的。

毛细管电泳较高效液相色谱有较多的优点。

其中之一是仪器结构 简单（见图1）。

它包括一个高电压源，一根毛细管，紫外检测器及计算机处理数据装置。

另有两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液池。

high-v oltagepower supply BufferV ialBuffer V ial Detector Recording dev icecapillaryElectrode Electrode图1 CE 仪器组成示意图毛细管中的带电粒子在电场的作用下，一方面发生定向移动的电泳迁移，另一方面，由于电泳过程伴随电渗现象，粒子的运动速度还明显受到溶液电渗流速度的影响。

粒子的实际流速 V 是电泳流速度 Vep 和渗流速度 Veo 的矢量和。

即:V = Vep + Veo (1)电渗流是一种液体相对于带电的管壁移动的现象。

溶液的这一运动是由硅/水表面的Zeta 势引起的。

CE 通常采用的石英毛细管柱表面一般情况下(pH>3)带负电。

当它和溶液接触时，双电层中产生了过剩的阳离子。

高电压下这些水合阳离子向阴极迁移形成一个扁平的塞子流，如图2。

毛细管管壁的带电状态可以进行修饰，管壁吸附阴离子表面活性剂增加电渗流， 管壁吸附阳离子表面活性剂减少电渗流甚至改变电渗流的方向。

毛细管电泳仪原理
毛细管电泳仪是一种利用毛细管中的电泳现象进行物质分离的仪器。

其原理简述如下：
1. 毛细管: 毛细管是一种细长而细腻的玻璃管或石英管，内径通常为10-100微米。

毛细管的内壁具有一定的静电性质，可以吸附带电物质。

2. 缓冲液: 毛细管中填充有一种称为缓冲液的溶液。

缓冲液可以调节溶液的pH值，并提供离子，以保持毛细管内部电荷平衡。

3. 样品注入: 需要分离的样品溶液通过吸管或注射器被注入毛细管中。

4. 应用电场: 在毛细管的两端施加电压，产生电场。

由于毛细管内部具有一定的电导性，电场会导致带电物质在毛细管中移动。

5. 分离过程: 带电物质在电场的作用下，根据其电荷大小和分子大小的不同，会以不同的速度向毛细管两端移动。

带电物质移动的速度与其电荷量和分子大小成反比。

6. 检测: 分离过程中，可以通过光散射、荧光等方法对物质进行检测。

常见的检测方法包括紫外吸收检测和荧光检测。

通过调节电场强度、缓冲液pH值和样品注入量等参数，可以
实现对不同样品的有效分离和检测。

毛细管电泳仪因其高效、高灵敏度和快速的优点，在生化、制药、环境监测等领域有广泛的应用。

常用分离模式毛细管电泳是指所有在极细毛细管内进行的电泳新技术，它根据分离机理不同具有多种分离模式，能够提供互不相关而又相互补充的信息。

毛细管电泳常用的分离模式包括毛细管区带电泳（CZE）或称自由溶液毛细管电泳（FSCE）、胶束电动毛细管色谱（MECC）、毛细管凝胶电泳（CGE）、毛细管等电聚焦（CIEF）和毛细管等速电泳（CITP），各分离模式、分离机理见下表。

在大多数情况下，可以通过改变缓冲液的组成来实现不同的操作模式。

毛细管区带电泳毛细管区带电泳（CZE）是毛细管电泳中最简单、最基本、应用最广泛的一种分离模式。

在毛细管中仅填充缓冲液，基于溶质组分的迁移时间或淌度的不同而分离。

除了溶质组分本身的结构特点和缓冲液组成，不存在其他因素如聚合物网络、pH梯度或另一分配相对分离的影响。

CZE分离无需固体支持介质，不存在基质效应，能分离淌度差别很小的组分。

CZE 中由于电渗流的存在，阴、阳离子可以同时分析，中性溶质电泳迁移为零与电渗流同时流出，如下图。

CZE的特点是操作简单、快速、分离效率高，应用范围广。

从原理上讲可以适用于所有具有不同淌度的荷电粒子的分离，分子量范围从十几的小分子离子到几十万的生物大分子。

胶束电动毛细管色谱胶束电动毛细管色谱（MECC或MEKC）是电泳技术和色谱技术巧妙结合的分离新技术。

MECC是在电泳分离缓冲液中加人离子型表面活性剂胶束，使电中性物质能根据其在胶束相和水相的分配系数不同而进行分离。

MECC是毛细管电泳中唯一能同时分离中性物质和离子型物质的分离模式。

它是1984年由Terabe首先报道的一种新型的毛细管电泳技术，也是目前研究较多，应用较广的一种毛细管电泳操作模式。

MECC是基于胶束增溶和电迁移过程进行的，因此其分离要求有两相：一相是带电的离子胶束，是不固定在毛细管中的假固定相，它具有与周围缓冲液介质不同的电泳淌度，也可称为胶束电泳淌度（μmc），并且与分离溶质相互作用（胶束增溶过程）；另一相是导电的水溶液相，在电场作用下，水相由电渗流驱动流向阴极（电迁移过程）。

分离的原因：电泳迁移，电渗迁移电泳迁移：在高压电场下，带电离子向相反的方向移动。

电渗迁移：当毛细管内充满缓冲溶液时，毛细管壁上的硅羟基发生解离，生成氢离子溶解在溶液中，这样就使毛细管壁带上负电荷与溶液形成双电层，在毛细管的两端加上直流电场后，带正电的溶液就会整体的向负极端移动，这就形成了电渗流。

在操作缓冲溶液中，带电粒子的运动速度等于电泳速度和电渗速度的矢量和，电渗速度一般大于电泳速度，因此即使是阴离子也会从阳极端流向阴极端。

加大缓冲溶液的酸度、在缓冲溶液中加入有机试剂都会减少硅羟基的解离，减小电渗流。

分离模式毛细管电泳的分离模式有以下几种。

（1）毛细管区带电泳（CZE）将待分析溶液引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端，按阳离子、中性粒子和阴离子及其电荷大小的顺序通过检测器。

中性组分彼此不能分离。

出峰时间称为迁移时间（tm），相当于高效液相色谱和气相色谱中的保留时间。

（2）毛细管凝胶电泳（CGE）在毛细管中装入单体和引发剂引发聚合反应生成凝胶，这种方法主要用于分析蛋白质、DNA等生物大分子。

另外还可以利用聚合物溶液，如葡聚糖等的筛分作用进行分析，称为毛细管无胶筛分。

有时将它们统称为毛细管筛分电泳，下分为凝胶电泳和无胶筛分两类。

（3）毛细管等速电泳（CITP）采用前导电解质和尾随电解质，在毛细管中充入前导电解质后，进样，电极槽中换用尾随电解质进行电泳分析，带不同电荷的组分迁移至各个狭窄的区带，然后依次通过检测器。

（4）毛细管等电聚焦电泳（CIEF）将毛细管内壁涂覆聚合物减小电渗流，再将样品和两性电解质混合进样，两个电极槽中分别加入酸液和碱液，施加电压后毛细管中的操作电解质溶液逐渐形成pH梯度，各溶质在毛细管中迁移至各自等电点（pI）时变为中性形成聚焦的区带，而后用压力或改变检测器末端电极槽储液的pH值的办法使溶质通过检测器。

（5）胶束电动毛细管色谱（MEKC或MECC）当操作缓冲液中加入大于其临界胶束浓度的离子型表面活性剂时表面活性剂就聚集形成胶束，其亲水端朝外憎水非极性核朝内，溶质则在水和胶束两相间分配，各溶质因分配系数存在差别而被分离。

毛细管区带电泳技术及应用毛细管区带电泳技术（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）是一种高效的分离和分析技术，利用背景电解质在毛细管中形成的电动流动及外加电场的作用，将被检测的样品分离开来。

毛细管区带电泳技术具有高分离效率、灵敏度高、样品需量小、分析速度快、适用于各种离子、小分子有机化合物、大分子如蛋白质和核酸等的分析等优点。

下面将介绍毛细管区带电泳技术的基本原理及其应用。

1. 毛细管区带电泳技术基本原理：毛细管区带电泳技术是基于电泳分离原理的一种分析方法。

毛细管内的电测电流和电压作为工具信号直接测量电导率，由于电导率与离子浓度成正比，通过计算可知样品中离子的浓度。

其基本原理如下：- 外加电场：在毛细管两端施加直流电场，样品中的带电粒子会被拉动向阳极或阴极方向移动。

- 毛细管内电动流动：在毛细管内部，背景电解质（电导率较高的缓冲溶液）通过浓度梯度与电场作用下形成电动流动，背景电解质的流动速度较高，背景电解质流动会带动样品分子的运动。

- 电渡效应：毛细管内的带电粒子在电渡效应的作用下会不同程度地移动，不同的离子在电场下移动速率不同，从而实现离子和样品分子的分离。

2. 毛细管区带电泳技术的应用：毛细管区带电泳技术在分析化学、生物医学等领域得到广泛应用，下面列举几个常见的应用领域：- 离子分析：毛细管区带电泳技术可以用于离子的分离和测定。

它可以是无色离子，如金属离子、无机阴离子、有机阴离子等的分析，也可以是发色离子的分析。

- 小分子有机物分析：毛细管区带电泳技术可以用于分离和检测食品、药物、环境样品等中的小分子有机物。

例如，可以用于药物成分的分析、食品添加剂的检测等。

- 蛋白质分析：毛细管区带电泳技术在蛋白质分析方面得到广泛应用。

由于毛细管区带电泳技术分离效率高、分析速度快，对蛋白质样品需求量小，可以有效地分离和定量测定多肽、蛋白质混合物。

- 核酸分析：毛细管区带电泳技术可用于分离和分析DNA、RNA等核酸样品。

毛细管电泳的原理
毛细管电泳是一种高效液相色谱技术，利用电场的作用将样品中的化合物沿着内径较小的毛细管进行分离和分析。

在毛细管电泳中，有两种常用的电泳模式：毛细管区带电泳和开列电泳。

毛细管区带电泳中，毛细管两端分别注入带有不同荧光标记的样品，再施加直流电场，荧光标记的样品由于在电场作用下带电移动，在毛细管中形成不同带电物质的区带；而在开列电泳中，毛细管中注入样品后，在施加电场的同时使用在线探测器进行实时监测，通过测量峰面积或峰高来判断样品的含量。

毛细管电泳的分离机理主要包括电泳迁移和色谱效应两个因素。

电泳迁移是指样品分子在电场作用下由于带电而移动，其移动速度与电场强度和分子带电量有关；色谱效应是指毛细管内壁与样品分子的相互作用，在毛细管中形成不同的分离机制，如离子交换、氢键作用、静电作用等。

毛细管电泳的原理还与毛细管内径、电场强度、缓冲液pH值
等因素有关。

毛细管内径越小，分离效率越高；电场强度越大，迁移速度越快，但也会增加毛细管的热效应；缓冲液pH值的
选择要根据样品的性质来确定。

在实际应用中，毛细管电泳具有分离效率高、分析速度快、耗样量小、操作简便等优点。

它广泛应用于生物医药、环境监测、食品安全等领域。

同时，还可以与其他技术如质谱联用，进一步提高分析的灵敏度和准确性。