色谱论文
高效毛细管区带电泳色谱的原理和应用
高效毛细管区带电泳色谱原理、方法和应用（化学化工学院 08级化学专业潘超张循）
摘要：高效毛细管电泳( High Performance Capillary Electrophoresis缩写为H P C E ) , 是20 世纪末发展的一种高效、快速的分离技术，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，是继高效液相色谱（HPLC）之后又一重大进展。
已在国际学术界引起强烈的反响和关注。
高效毛细管区带电泳是最基本、操作最简单、应用最广泛的一种毛细管电泳的分离模式, 通常看作其它模式的母体。
本文主要介绍它的原理和一些应用。
关键词：毛细管电泳毛细管区带电泳电渗流电渗现象
引言
在毛细管中进行区带电泳，一方面可减少焦耳热效应导致的区带加宽, 另方又可借用高效液相色谱的检测技术实现在线检测, 免除染色、脱色和扫描或照相。
1979年Mikkers 等[1]在内径为0.2mm长为20cm的毛细管中做区带电泳, 达到3.6万理论板。
1981年, Jorgenson和Lukacs做了理论上的初步考察, 认为在毛细管长度足够时, 电泳的分离效率与长度无关而与电压成正比：N=mV/2D。
其中N为理论板数, m为离子的迁移率, V为电压, D为离子的扩散系数。
为了提高电压而又不使电流太大, 同时也为了减小焦耳热效产生的径向温度梯度, 他们使用内径为0.075mm的毛细管。
在管长1米,电压3万伏时, 控制进样量尽量小, 达到约40万理论板的效率（用荧光胺衍生的肽）[2.3]是毛细管区带电泳的一次突破。
毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。
电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加，高效毛细管电泳的柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。
为今后毛细管区带电泳的快速发展奠定了基础。
1、高效毛细管区带电泳色谱的原理
1.1装置的结构
高效毛细管电泳指以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离通道, 依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实现分离的一类液相分离技术[ 4]。
高效毛细管电泳系统主要由高压电源、毛细管、检测器、电解液池、进样系统、冷却系统、计算机管理与数据处理等部分组成( 如图1 所示) 。
各个部分的特点介绍如
下。
图1 高效毛细管电泳装置示意图
1 . 高压电源
2 . 电解液池
3 检测器
4 . 毛细管
5 . 数据采集与处理系统6、冷却系统
高压电源【5】：是组成高效毛细管电泳装置的重要设备,它是样品在自由溶液中迁移的动力来源。
实验过程中要求高压电源具有良好的电压稳定度和很高的输出电压，目前常用的高压电源输出电压为5 ~ 30 k v 。
绝缘材料的限制, 电压不能太高, 以免损坏仪器。
同时,为使实验能够安全进行, 在操作者与仪器设备之间必须加绝缘系统, 以防止高电压可能在毛细管内和仪器内产生的电晕放电。
进样系统: 电碱液池要求化学惰性，机械稳定性好作。
C E 的进样量很小, 最小量仅为数纳升, 必须采用自动进样方式。
目前主要有真空进样和电动进样两种, 真空进样在定量和重复性方面较好。
检测器: H P CE 仪可以配以各种类型的检测器, 如紫外—可见光检测器、荧光检测器、拉曼光谱检测器、电化学检测器、放射俭测器和质谱检测器等。
目前商品化仪器中主要以紫外—可见光检测器和荧光检测器为主。
为了获得足够的光信号, 需要一个在毛细管上微聚焦的透镜系统。
迄今报道的紫外—可见光吸收检测器的灵敏度可达10 -14~1 0 -15 mol , 荧光检测器可达到10-7~10-19mol。
毛细管柱: 毛细管柱是H P C E 的关键部件。
它由石英组成, 外壁涂以聚合物以增强毛细管的韧性及强度。
内壁分为含有涂层和无涂层两种, 前者可有效地减小吸附作用和电渗现象。
毛细管柱一般为25 um 和5 0u m 。
与层析分离一样, 减小柱径和增加柱的长度都可以提高分辩率。
1.2CZE 的基本原理
组分在CZE 中的流出顺序主要与组分的荷质比有关。
它可实现很小体积带电离子的快速、高效分离。
在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下，以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。
而此时双电层中的水合阳离子引起流体整体向负极方向移动的现象叫电渗。
电渗流的大小取决于电场强度、电解质pH、缓冲液的组成和离子强度、内摩擦和毛细管表面的特点等，这些因素单一或互相结合，均能提高分离效果。
粒子在电解质中的迁移速度等于电泳流和电渗流两种速度的矢量和。
阳离子的移动方向和电渗流一致，最先流出；中性粒子的电泳流速度为零，其迁移速度等于电渗流速度；阴离子的移动方向与电渗流相反，但因电渗流速度一
般都大于电泳速度，它将在中性粒子之后流出，从而实现分离。
1.2.1分离过程
区带电泳是根据带电粒子的荷质比的不同来进行分离的。
电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。
带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。
正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；
中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；
阴离子：两种效应的运动方向相反。
ν电渗流>ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电力大小不一样也同时被相互分离。
电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度。
当带电离子以速度ν在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用
电场力：FE = qE
阻力：F = fν
故：qE = fν
q—离子所带的有效电荷；
E —电场强度；
ν—离子在电场中的迁移速度；
f —平动摩擦系数( 对于球形离子：f =6πηγ；γ—离子的表观液态动力学半径；η—介质的粘度；)
1.2.2电渗现象与电渗流
电渗现象: 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。
当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。
电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow ，简称EOF）。
石英毛细管柱，内充液pH>3时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，形成双电层。
毛细管内壁结构示意图
在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳
离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。
电渗流的大小用电渗流速度ν电渗流表示，取决于电渗淌度μ和电场强度E。
即ν电渗流= μ E
电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即
μ= ε0εξ
ε0—真空介电常数；ε—介电常数；ξ—毛细管壁的Zeta电势。
ν电渗流= ε0εξ E
实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算
ν电渗流= Lef/teo
Lef —毛细管有效长度；teo—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间
HPCE中电渗流的方向
电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：
内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；
内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；
石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；
改变电渗流方向的方法：
（1）毛细管改性
表面键合阳离子基团；
（2）加电渗流反转剂
内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。
电渗流流向阳极。
4. HPCE中电渗流的流形
电渗流的大小用电渗流速度ν电渗流表示，取决于电渗淌度μ和电场强度E。
即
ν电渗流= μ E
电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即
μ= ε0εξ
ε0—真空介电常数；ε—介电常数；ξ—毛细管壁的Zeta电势。
ν电渗流= ε0εξ E
1.2.3. 电渗流的作用
电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；
各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：
ν+ =ν电渗流+ ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；
ν- =ν电渗流- ν-ef 阴离子运动方向与电渗流相反；
ν0 =ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；
（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；
（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；
（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。
1.2.4、HPCE中影响电渗流的因素
电渗流速度与电场强度，管壁电势，介质的介电常数成正比，和介质的粘度成反比.
（1）.电场强度的影响
电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。
（2）毛细管材料的影响
不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；
（3）溶液性质的影响
溶液pH的影响
对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta 电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH<3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。
分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。
介质成分和浓度的影响
在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。
缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。
缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降
（4）温度的影响
毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。
温度变化来自于“焦耳热”
（5）添加剂的影响
<1>加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。
<2>加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。
加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁
表面负电荷增加，zeta 电势增大，电渗流增大；
<3>加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。
1.2.5 HPCE 中电渗流的流形
电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小）； 液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍（引起谱带展宽较大）。
在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。
1.3 HPCE 中的参数与关系式
1.3.1 迁移时间（保留时间） HPCE 兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。
有关色谱理论也适用:
V —外加电压；L —毛细管总长度；
1.3.2分离效率（塔板数）
在HPCE 中，仅存在纵向扩散，σ2=2Dt
1.2.4.分离度
影响分离度的主要因素；工作电压V ；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。
分离度可按谱图直接由下式计算
V L L E L L t ap ef ap ef ap ef ⋅⋅=⋅==μμν22/154.5;22⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛===Y t n D EL DL VL n R ef ap ef ap μμDL VL R ef ap μμμ
平均∆⋅=177.0
1.4、影响分离效率的因素—区带展宽
1.4.1.进样的影响
当进样塞长度太大时，引起的峰展宽大于纵向扩散。
分离效率明显下降；理想情况下，进样塞长度：
Winj= (24D t )1/2
实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%～2%。
1.4.2、焦耳热与温度梯度的影响
散热过程中，在毛细管内形成温度梯度（中心温度高），破坏了塞流，导致区带展宽。
改善方法：
（1）减小毛细管内径；
（2）控制散热；
1.4.3、纵向扩散的影响
在HPCE 中，纵向扩散引起的峰展宽：σ2=2Dt
由扩散系数和迁移时间决定。
大分子的扩散系数小，可获得更高的分离效率，大分子生物试样分离的依据。
1.4.4、溶质与管壁间的相互作用
存在吸附与疏水作用，造成谱带展宽；
蛋白质、多肽带电荷数多，有较多的疏水基，吸附问题特别严重，是目前分离分析该类物质的一大难题。
细内径毛细管柱，一方面有利于散热，另一方面比表面积大，又增加了溶质吸附的机会。
减小吸附的方法和途径： 加入两性离子代替强电解质，两性离子一端带正电，另一端带负电，带正电一端与管壁负电中心作用，浓度约为溶质的100-1000倍时，抑制对蛋白质吸附，又不增加溶液电导，对电渗流影响不大。
1.3电泳 电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度， 当带电离子以速度ν 在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。
电场力：FE = qE
阻 力：F = f ν
故： qE = f ν
q —离子所带的有效电荷；
E —电场强度；
ν—离子在电场中的迁移速度；
221ap ap μμμ+=平均1
212)(2W W t t R +-=
f —平动摩擦系数 ( 对于球形离子： f =6πηγ；γ —离子的表观液态动力学半径；η —介质的粘度； )
所以，迁移速度：
2、高效毛细管区带色谱的应用
CZE 的突出特点是简单、高效、快速、样品用量小、易自动化操作，比传统电泳如薄层电泳或柱电泳有强得多的分析功能。
它是化学超微量分析的有效手段，可用于生物、医学、环境和工业生产等各方面的分析工作中，到面前为止，CZE 测定过的对象有：无机离子、有机物（胺、酚、酮、酯、羧酸、硝基苯，多环芳烃等），氨基酸（包括光学异构体的拆分），肽和蛋白质，RNA 、DNA 及基片断，多糖，红细胞等。
2.1、毛细管区带电泳在手性药物对映体分离中的应用
其原理是，在背景电解质缓冲液中添加不同类型的手性选择剂，由两个对映体和手性选择剂构成了三点作用模式，所形成的包容络合物稳定性不同，使它们的表观迁移率产生差异，从而实现多种手性药物对映体的分离。
例如；配体交换CZE 。
手性配体交换毛细管区带电泳法分离手性化合物的原理【7】是，手性配体L(通常为L 型氨基酸及其衍生物)与金属离子M 形成络合物M[L]n ，并与待测对映体发生交换作用。
由对映体D 一和L 一型与手性配体、金属离子形成的三元配合物稳定常数不同，决定了它们在电泳力作用下迁移时间的不同，因而可以实现对映异构体的拆分。
Gasmann 等口]首次应用L 一氨基酸和Cu 2+为手性添加剂，成功地对丹酰化一氨基酸实现分离。
近年来，赵艳芳等口]用Cu 2+一L 一羟基脯氨酸作为手性选择剂，在13min 内同时拆分了3种；a 一羟基酸对映体，得到了较好的分离效果。
HOdlHo 等在高pH 条件下，应用Cu 2+-L 一酒石酸络合物为手性添加剂，分离了含有氨基醇结构的手性药物。
此后，他们又以三种糖酸和不同离子如Cu 2+、Co 2+、Np 和Zn 2+配位络合，手性分离氨基酸，结果表明Cu 2+的配位和分离效果最为理想【8】。
2.2 苹果品种／类型的毛细管区带电泳法鉴别
利用CZE 分离蛋白质被成功地应用到食品质量监控【9-11】和临床【12】。
毛细管区带电泳在植物品种鉴定方面，主要集中在对于种子中醇溶性蛋白质的分析来进行品种鉴定。
水溶蛋白的PAGE 已被广泛应用于多种作物的品种鉴定，综合水溶性蛋白在品种鉴定方面的广泛应用和毛细管区带电泳的分离蛋白质多态性高的优点，加之取样为生理功能旺盛的叶片(水溶性蛋白丰富)，认为通过毛细管区带电泳法进行苹果水溶蛋白多态性分析的方法鉴定苹果品种/类型具有较高的可行性。
田义等成功鉴别了苹果的种类。
【13】
2.3 运用高效毛细管区带电泳法对人血清蛋白的分析
采用毛细管电泳技术建立了血清蛋白毛细管区带电泳分析方法!同时可对白蛋白进行定量测定应用于临床五种疾病分析!结果显示分析结果与临床资料一致(所用电泳液为0.1mol/L PH 10硼砂.氢氧化钠缓冲液!电压为15KV 电泳时间为16min 检测波长为214nm 。
该方法快速!稳定!可作为临床实验室分析血清蛋白的常规分析方法。
E q f q E γηνπ6==
结束语：
高效毛细管区带色谱是最基本的一种毛细管色谱的分离模式，但它有很多需要改善的地方，譬如；无法将中性分子分离开来，对于荷质比相同的不同离子也无法分开。
针对于这些不足的改进，于是产生了胶束电动毛细管色谱和毛细管凝胶电泳。
但由于其独特的优点（上文提过），在很多领域内被广泛的应用，它是其他类型毛细广电泳发展的基础，具有很大的发展潜力。
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