微生物实验操作基础——灭菌及无菌操作

微生物的基本操作方法
微生物的基本操作方法包括以下几个方面：
1. 无菌操作：在进行微生物实验或培养时，需要保持操作环境的无菌。

操作者应注意洗手、穿戴实验服、戴手套，并在无菌工作台或无菌室内进行操作。

可用酒精灯或紫外线灯消毒操作区域，以杀灭空气中的微生物。

2. 培养基的制备：根据所需的微生物类型选择适当的培养基，并按照配方制备。

培养基通常包括基础培养基、食物源、pH调节剂和琼脂等成分。

制备时需要称取和溶解成分，并用高压蒸汽或高温灭菌来杀灭培养基中的微生物。

3. 培养器具的消毒：使用前要对培养器具进行消毒处理，常用的方法有高压蒸汽灭菌、高温灭菌、紫外线消毒等。

确保培养器具的表面和内部都不带有致病菌。

4. 菌种的接种：将所需的菌种接种到培养基上。

通常使用接种环、接种针或接种环针进行接种。

在接种时要注意无菌操作，以避免外来细菌的污染。

5. 培养条件：对于每一种微生物，根据其生长特性和要求，设置适当的培养条件。

例如，合适的温度、湿度、pH值和氧气浓度等都会影响微生物的生长。

6. 培养观察：在培养过程中，定期观察微生物的生长情况。

可以使用显微镜观察细菌或酵母菌的形态，或者通过目测观察细菌悬浊液的浑浊度和沉淀情况来判
断微生物是否生长良好。

7. 分离纯化：将培养基上生长的微生物单克隆分离纯化，得到纯系菌株。

通常可以使用藻糖水平板或琼脂斜面触点法进行分离，将不同的菌落孤立开来。

8. 培养维持：根据微生物的生长要求，每隔一段时间更换培养基、条件，以保持微生物的生长和繁殖。

同时，也需要妥善保存纯化的菌株，以备后续实验使用。

无菌技术操作流程简写一、介绍无菌技术是一种控制和预防微生物污染的方法。

在医疗、食品、制药等领域广泛应用。

本文将简要介绍无菌技术的操作流程。

二、准备工作在进行任何无菌实验前，必须确保工作区域及工具均处于无菌状态。

准备工作如下：1.清洁工作区：彻底清洁工作台，并用消毒剂擦拭。

2.穿戴无菌操作衣：穿戴无菌手套、衣服、帽子和口罩。

3.消毒操作工具：用高温高压灭菌器对操作工具进行灭菌处理。

三、操作流程1.打开无菌工作台：先进行手消毒，戴上无菌手套，然后打开无菌工作台的超净台面。

2.取出试验物品：将需要的无菌试验物品从包装中取出。

3.开启燃烧盖：打开无菌工作台的燃烧盖，并点燃蜡烛。

4.操作物品处理：将试验物品经过消毒的工具夹子夹取，置于燃烧盖上方进行燃烧处理。

5.灭菌试剂处理：将需要使用的灭菌试剂按照要求使用。

6.移液操作：使用无菌的移液器对液体进行移液操作。

7.杀菌操作：将操作好的液体或物品放入高温高压灭菌器进行杀菌。

8.清理工作区：实验结束后，对工作区进行彻底清洁。

四、注意事项1.不要触摸无菌操作区域以外的物品。

2.所有操作都必须在无菌条件下进行。

3.移液器在使用前需进行严格的清洁和消毒。

4.使用灭菌器时，遵守使用说明。

5.工作完成后，正确处理无菌试验物品及废弃物。

五、总结无菌技术框架下的操作流程可以帮助我们有效控制和预防微生物污染。

在操作过程中，我们需要按照一定的步骤和要求进行，严格遵守消毒和无菌处理的相关操作规范。

这样可以确保实验结果的准确性与可靠性，保护实验人员和被试物品的安全和健康。

希望本文对于理解无菌技术操作流程有所帮助！。

微生物培养及实验基本操作技术一、培养基配制培养基是指人工配制的、适合于微生物生长繁殖或累积代谢产物所需的各种营养物的混合基质。

配制培养基是进行微生物检验工作的基础,甚至是任何与微生物有关工作的基础。

注意事項–灭菌锅的使用①加水盖过底部铁板—②放入东西—③关门—④調整溫度時間—⑤关紧泄压阀灭菌結束後，等压力降回零時才可打開門進入灭菌锅之物品，蓋子不可關太緊或太鬆拿滅菌後物品請記得帶耐熱手套培养基中的主要成分及其作用：营养物质：N源、C源、无机盐、生长因子、水常用的N源：蛋白胨、牛肉膏、肉浸汁、酵母膏常用的C源：糖、醇类物质（单糖：葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖双糖：蔗糖、麦芽糖、乳糖；多糖：淀粉、纤维素、菊糖；醇类：甘露醇、卫茅醇、甘油）水：用蒸馏水，不能用自来水凝固剂：琼脂、明胶、血清等抑制剂：1、作用：鉴定细菌、抑制杂菌的生长繁殖，增加待检菌的检出率2、种类：盐类：氯化钠、氯化锂、氰化钾、亚碲酸钾（钠）、亚硒酸钠等染色剂类：煌绿、蔷薇酸、结晶紫、孔雀绿、孟加拉红、玫瑰红胆盐类：猪（牛、羊）胆盐、混合胆盐、三号胆盐、去氧胆酸盐、胆石酸盐抗菌素：青霉素、链霉素、杆菌肽、多粘菌素指示剂1、作用：用于指示鉴别细菌可否利用分解糖醇类物质和含氮化合物，产酸产碱的能力。

2、常用的指示剂：酚红、溴甲酚紫、中性红、中国蓝、甲基红、复红、伊红、美蓝、孔雀绿等。

培养基的类型：●根据培养基的物理状态来区分：1、液体培养基：主要用于增菌培养、鉴别性培养2、固体培养基：用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定3、半固体培养基：观察微生物的动力，有时用来保藏菌种4、脱水(商品)培荞基：脱水培养基也称为商品培养基、预制干燥培养基。

●将各种营养成分按比例配制完全,制成脱水的干粉状,装瓶出售;使用时只需按比例加人定量的水溶化、灭菌便可。

●根据培养基的用途来区分：➢增殖培养基选择培养基鉴别培养基1、增殖培养基：在普通培养基中加入一些某种微生物特别喜欢的营养物质，以增加这种微生物的繁殖速度，逐渐淘汰其它微生物，这种培养基称为增殖培养基。

微生物检验的基本操作技术一、无菌操作技术1、定义是指在执行实验过程中，防止一切微生物侵入机体和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术和管理方法；无菌操作技术是微生物实验的基本技术，是保证微生物实验准确和顺利完成的重要环节。

2、内容无菌操作技术主要包括两方面：1）创造无菌的培养环境。

包括提供密闭的培养容器、培养容器的灭菌、培养基的灭菌等；2）在操作和培养过程中防止一切其它微生物的侵入的措施。

包括紫外线杀菌、甲醛熏蒸、超净台的消毒与检测、操作工具、器皿灭菌、操作方法等。

3、无菌操作原则1）在执行无菌操作时，必须明确物品的无菌区和非无菌区，接种时必须穿工作服、戴工作帽，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球将手擦干净；2）在操作前20〜30分钟要先启动超净台和紫外灯，进行接种所用的吸管、平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼3次后使用。

严禁用手直接拿无菌物品，如瓶塞等，而必须用消毒的钳、镊子等；3）从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不能触及试管或平皿边；4）接种样品、转种细菌必须在酒精灯前操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞都要通过火焰消毒；5）接种环或接种针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必须时还要烧到环和针与杆的连接处；6）吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。

倾倒平板应在超净台内操作，并且在开启和加盖瓶塞时需反复用酒精灯烧。

二、无菌操作的环境要求1、无菌室（1）无菌室的结构：更衣间、缓冲间、操作间；(2)无菌室的消毒和防污染■每日(使用前)紫外线照射(0.5~1小时)；•每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒；•每季度用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸(2小时)，特殊情况下可增加熏蒸频次。

(3)无菌室使用要求①无菌室内应保持清洁，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作台面，不得存放与实验无关的物品；②无菌室使用前后应将门关紧，打开紫外线，如采用室内悬吊紫外灯消毒时，需30W紫外灯，距离在1.0m处，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻拭擦，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响；③处理和接种食品标本时，进入无菌室操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。

生活家庭·医生Family life guide -237-李晓英 （成都锦江大观医院）随着现代医学生物学、信息技术的不断进步，特别是医学分子生物学的快速发展，微生物检验技术也在长足进步。

但要想保证检验结果的准确性，还需做好检验的基本操作，即无菌操作，就是指在无菌环境下进行各项操作，例如细菌接种、植物组织培养、细胞传代培养等，避免微生物污染检测设备、培养基、样本等，进而才能得到可靠、准确的微生物检测结果。

基于此，本文讲讲微生物检验基本操作之无菌操作，以供各位借鉴。

保护标本（1）标本采集前，用75%的酒精对血培养瓶的橡皮塞进行消毒，并进行干燥处理。

除此之外，对穿刺位置的皮肤进行常规消毒，先用酒精初步消毒，再用含碘消毒剂进行再次消毒，然后再用酒精进行处理，且消毒时间要控制好，以免标本污染。

注意，严格执行无菌操作，消毒处理过的皮肤，不可再直接用手触摸静脉，需戴好无菌手套再操作。

（2）采集血液标本时，尽量选择外周静脉血，不建议采集动脉血，也不建议在静脉留置导管内采集血液样本，以免增加污染率。

若必须采集留置导管里面的血液，也需同时采集外周静脉血作为对照样本，以提升检验准确性。

（3）采集尿液标本时，需留取清洁的中段尿，具有易行、简单等优势，也是最常使用的一种尿液标本采集方式。

一般情况下，女性采集尿液样本时，需使用浓度0.1%的高锰酸钾溶液或者肥皂水清洁尿道口、阴部、外阴部等部位。

而男性需详细情节包皮，用浓度0.1%的新洁尔消毒液清洁尿道口，并用无菌纱布擦拭干净，然后在采集尿液标本。

（4）采集痰液标本时，需先刷牙，然后用清水漱口，再用力将呼吸道深部的痰液咳到无菌盒内，盖好盖子送检。

但注意，不可使用药瓶、卫生纸、无盖容器等留取，以免标本污染。

（5）采集粪便标本时，用专用容器收集粪便，然后挑取2至3克带有黏液、脓血部分的粪便作为标本。

除此之外，对于不宜留取粪便标本的婴幼儿等人群，可采集肛拭采集粪便样本，即先用无菌甘油水湿润拭子前端，然后将其置入患者肛门内4至5厘米部位，轻轻旋转，以采集直肠表面黏液，然后收集好，再送检。

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无菌及无菌操作名词解释
无菌（aseptic）是指没有任何微生物存在的状态。

在无菌条件下进行的操作被称为无菌操作（aseptic technique）。

无菌操作主要包括以下几个方面：
1. 消毒：使用化学物质或物理方法杀灭或去除微生物，以确保操作区域和实验器材的无菌性。

2. 灭菌：杀灭所有存在的微生物，包括耐热菌、芽胞等。

常用的灭菌方法包括高温蒸汽灭菌、紫外线灭菌、滤器灭菌等。

3. 无菌区域：特别设计的区域，通过过滤空气或其他方法来维持空气中微生物的数量极低。

在无菌区域内进行操作可以减少微生物的污染。

4. 严格遵守操作规程：无菌操作需要严格按照操作规程进行，包括洗手、穿戴无菌衣物和手套、正确使用消毒剂、避免操作器械接触非无菌物品等。

无菌和无菌操作在生物制药、医疗器械生产、实验室研究等领域中广泛应用，以确保产品和实验的无菌性，减少微生物的污染和传播。

基础生物学实验微生物学部分1 倒平板技术宦海霞原理倒平板就是火焰旁，将三角瓶中已融化的琼脂培养基倒入无菌培养皿中，然后置水平位置待凝，凝固后即成无菌培养基平板（简称平板），完成此操作的过程称为倒平板。

实验目的及原理*010203培养基其他：酒精灯，打火机，标签纸，记号笔等。

无菌培养皿若干套实验材料1右手持瓶，保持瓶口处于酒精灯火焰旁的无菌操作区域内并面向火焰。

迅速倒出瓶内融化的培养基液至无菌培养皿内。

一般倒入量为12~15ml 。

融化培养基，可用微波炉融化，也可用沸水浴融化或压力锅融化等左手取培养皿，用食指和拇指开启培养皿成一缝，恰好能让三角瓶口伸入。

倒无菌平板⏹持皿法倒无菌平板 ⏹叠皿法清洁桌面，正式倒平板前须清理与清洁台面，以减少台面尘埃，降低平板污染的概率。

盖上培养皿盖，置水平位置冷凝42方法和步骤567注意事项用于倒平板的培养基一定要彻底融化，否则会再所倒的平板培养基表面出现未融化的琼脂块。

倒平板时的培养基温度不能过高（50~60℃为宜），否则会在皿盖内侧或凝固的平板表面形成许多冷凝水，不利于单菌落的形成。

在无菌操作倒平板过程中，切忌用手抓、握三角瓶的瓶口处，以防灼热的瓶口烫伤手指，同时，手指上的微生物也会污染瓶口，进而严重污染培养基。

谢谢您的观看基础生物学实验微生物学部分2 平板划线技术张曈实验原理实验原理1 平板划线法是指把杂菌样品通过在平板表面划线稀释而获得单菌落的方法。

一般是将混杂在一起的不同种微生物戒同种微生物群体中的不同细胞，通过在分区的平板表面上作多次划线稀释，形成较多的独立分布的单个细胞，经培养而繁殖成相互独立的多个单菌落。

通常认为这种单菌落就是某微生物的“纯种”。

在实验中，我们将平板分成A、B、C、D 4个面积不同的小区进行划线，A区面积最小，作为待分离菌的菌源区，B和C区为经初步划线稀释的过渡区，D区则是关键的单菌落收获区，它的面积最大，出现单菌落的概率也最高。

因此，这4个区的面积安排应做到D>C>B>A。