GRAS级别的透明质酸生产_DuanRS

GRAS级别的透明质酸生产段荣帅1,2,3，王凤山1，张天民1,2，凌沛学1,2（1. 山东大学药学院，山东济南250012；2. 山东省生物药物研究院博士后科研工作站，山东济南250108；3.山东商业职业技术学院，山东济南250103）摘要：透明质酸是一种具有重要生理功能的大分子黏多糖。

目前，透明质酸的生产主要通过兽疫链球菌发酵法进行，但寻求或通过基因工程手段构建更安全、高效的透明质酸工程菌株的研究一直是该领域的研究热点。

本文对GRAS级生产HA的安全菌株的研究进展做一综述。

关键词：透明质酸；GRAS；透明质酸合酶Hyaluronic Acid Production by Genetic Engineered GRAS Strains DUAN Rong-shuai1,2,3, WANG Feng-shan1, ZHANG Tian-min1,2, LING Pei-xue1,2 (1. School of Pharmaceutical Science, Shandong University, Jinan 250012, China; 2.Postdoctoral Scientific Research Workstation, Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province, Jinan 250108, China; 3. Shandong Institute of Commerce andTechnology, Jinan 250103, China)Abstract: Hyaluronic acid is an important polysaccharide of various physiological functions. Nowadays, it is produced mainly through microbial fermentation of Streptococcus zooepidemicus. HA production in more safe and efficient genetic engineered GRAS strains is a hot research area. Here, we provide a comprehensive review of HA production by genetic engineered GRAS strains.Key Words: hyaluronic acid; GRAS; hyaluronan synthase透明质酸（hyaluronic acid, HA）是一种广泛分布于生物体内的大分子黏多糖，有着良好的黏弹性、可塑性、渗透性及生物相容性，具有保水、润滑、调节渗透压、信号的识别与传导等重要生理作用，因此在医药、食品、化妆品领域有着广泛的应用和需求前景。

目前，微生物发酵生产法已取代传统提取法成为HA主要的生产方式，但以兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）为发酵菌株的大规模发酵法亦有其局限性，寻求或通过基因工程手段构建更安全、高效的透明质酸工程菌株的研究一直是该领域的研究热点。

1透明质酸发酵生产的现状从80年代开始，HA的工业生产主要采用微生物发酵法进行，应用较广泛的发酵菌株为A型或C型链球菌，尤其是兽疫链球菌。

采用兽疫链球菌发酵生产HA，具有产量高、发酵技术成熟等特点。

以野生型或HA高产突变株作为生产菌株，易于得到高产量的HA（5-10g/L），而更高浓度的HA因发酵液黏度的限制在实际生产中应用并不可行。

因此，对兽疫链球菌菌株的选育以及HA发酵工艺的优化，主要在于提高HA的质量，例如纯度或分子量分布，而不是HA的产量。

[1-2]对兽疫链球菌HA发酵的改良主要包括以下几个方面：（1）非溶血性和透明质酸酶缺陷菌株的选育[2]；（2）分子量控制，如代谢通路调节[3]、高分子量HA 突变株[2]或低分子量HA发酵工艺[4]；（3）成分培养基的改良[1]；（4）连续培养[5]；（5）通气、pH控制[6-8]等发酵参数。

上述措施虽然可在一定程度上改善HA的质量，但难以从根本上克服兽疫链球菌自身作为动物病原菌发酵生产所带来的安全风险、培养基成分复杂以及基因操作手段有限等缺点。

2可用于生产HA的GRAS级安全菌株多种微生物透明质酸合酶的发现[9]，HA的生物合成途径的阐明[1-2]，以及大众对公认安全（Generally recognized as safe, GRAS）级菌株生产医药产品的需求，推动了通过基因工程手段构建产HA的GRAS级菌株的研究。

细菌的透明质酸合酶主要包括两个类群，HASs（由多种革兰阳性A/C型链球菌产生）和pmHAS（由革兰阴性A型多杀巴斯德菌Pasteurella multocida产生）[9]。

相应的，根据转移的透明质酸合酶不同，HA的重组表达系统也可分为两类，即采用HASs的革兰阳性菌包括枯草杆菌（Bacillus subtilis）[10-12]和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）[13-15]，采用pmHAS的革兰阴性菌土壤杆菌（Agrobacterium sp.）[16]。

而革兰阴性的大肠埃希菌（Escherichia coli）则比较特殊，引入HASs及pmHAS均有报道[17-18]。

此外，Izawa等[19]最近报道了部分革兰阳性的嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）亦可产生HA。

枯草杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌一般皆被视为GRAS级安全的菌株，土壤杆菌则大量用于发酵生产食品用热凝胶多糖（Curdlan），部分大肠埃希菌（如K12）亦被专家认定安全。

因此，利用这些菌株生产医用或食用的HA易于被一般大众接受。

2.1枯草杆菌枯草杆菌具有强大的合成和分泌胞外产物的能力，培养成本低廉，不会产生外毒素和内毒素，且没有透明质酸酶。

此外，枯草杆菌已完成基因组测序，基因操作技术和手段非常成熟。

这些使其成为理想的HA外源表达系统，并可用于透明质酸合酶的酶学研究。

[10, 12]枯草杆菌仅缺乏透明质酸合酶，因此理论上只需将链球菌的透明质酸合酶基因hasA导入表达即可合成HA。

但Widner等人[12]的研究表明，UDP-葡糖醛酸的合成限制了枯草杆菌中HA的合成，因此需在操纵子中同时引入UDP-葡糖脱氢酶基因hasB或枯草杆菌内源的类似基因tauD。

构建的枯草杆菌进行发酵HA产量可达到每升几克的级别，分子量在1.1～1.2MDa之间，多分散系数1.5。

将透明颤菌血红蛋白基因（Vitreoscilla hemoglobin，VHb）同时引入枯草杆菌，可改善其产能状况。

以携带VHb、hasA和tauD的枯草杆菌发酵时，菌体密度增加25%，而HA产量提高一倍。

[11]枯草杆菌合成的HA不与细胞黏附在一起，因此简化了回收过程，利于下游工艺[12]。

2.2乳酸乳球菌乳酸乳球菌与兽疫链球菌亲缘关系相近，遗传背景清楚，并且具有一些成熟的高效诱导表达系统，例如NICE表达系统（Nisin-controlled expression system）。

借助NICE系统，将透明质酸合酶基因hasA和UDP-葡糖脱氢酶基因hasB导入乳酸乳球菌，可借助乳酸链球菌素（nisin）诱导HA合成，其HA浓度可达0.65g/L。

[13]Prasad等[14]发现UDP-葡糖焦磷酸化酶基因hasC与hasA、hasB共同引入乳酸乳球菌可进一步提高HA产量，在发酵实验时，达到1.8g/L。

借助NICE诱导表达系统，可进行透明质酸合酶表达量、HA得率和HA分子量大小三者关系的研究，通过调节nisin的浓度，可获得分子量550～850kDa不同大小的HA，在通过发酵调节生产不同分子量HA方面具有应用前景。

[15]2.3嗜热链球菌Izawa等[19]研究乳制品中嗜热链球菌产生的胞外多糖，发现一株嗜热链球菌YIT 2084可合成HA（约8mg/l），其胞外多糖高分子量部分（约2000kDa），经由HPLC与NMR分析，成分与商品化HA类似。

作为自然状态下已发现的产HA的微生物的新成员，嗜热链球菌由于其自身为GRAS级安全菌株，可能在医用及食用级HA生产上具有应用的潜力，但其培养条件、发酵工艺还需进一步实验，高产菌株的进一步选育亦需进行。

2.4土壤杆菌土壤杆菌常用于工业发酵生产热凝胶多糖，由于其与多杀巴斯德菌同为革兰阴性，因此Mao等[16]对其能否表达pmHAS合成HA进行了实验。

将多杀巴斯德菌的pmHAS基因与大肠埃希菌K5的UDP-葡糖脱氢酶基因kfiD重组导入土壤杆菌，则土壤杆菌获得合成HA的能力，其摇瓶培养HA产量可达0.3g/L，分子量在0.7～2MDa之间。

此外，土壤杆菌较容易的基因操作使其有进一步遗传改造的可能。

2.5大肠埃希菌大肠埃希菌以其最为丰富的载体工具及基因操纵手段，常常成为研究HA生物合成途径的模型菌株。

Yu等[18]考察了链球菌透明质酸合酶基因sphasA，大肠埃希菌基因ugd（hasB）、galF（hasC）和glmU（hasD）表达与HA合成的关系，发现sphasA、ugd和galF对于大肠埃希菌合成HA是必需的。

因革兰阳性与革兰阴性细胞壁结构差别较大，其构建的菌株HA产量不高（160-190mg/L），分子量在3.5 x 105～1.9 x 106 Da之间。

HA合成亦使菌体生长受到抑制。

Mao等[17]采用了相反的策略，将革兰阴性的多杀巴斯德菌的pmHAS导入至大肠埃希菌中。

一同导入的还有来自大肠埃希菌K5的UDP-葡糖脱氢酶基因。

采用分批补料发酵工艺时，HA产量可达到2.0～3.8g/L。

GRAS级细菌HA表达系统的对比如表1所示。

表1. GRAS级细菌HA表达系统的对比菌株操纵子结构革兰染色HA产量g/LHA分子量枯草杆菌Vhb+hasA+tauD(hasB) + 1.8-2.1 1.1～1.2MDa 乳酸乳球菌hasA+hasB+hasC + 0.46-1.8 550～850kDa 嗜热链球菌- + 8 x 10-32MDa土壤杆菌pmHAS+kfiD - 0.3 0.7～2MDa大肠杆菌hasA+ugd+galF或pmHAS+kfiD-0.192.0-3.8350k～1900kDa-3结束语兽疫链球菌发酵生产HA有产生毒素及其他细胞蛋白的风险，其生长速度慢、发酵能力差、培养基成本高等劣势也日益明显。

同时，随着大众对医用及食用原料或添加剂的要求的苛刻，兽疫链球菌发酵生产HA可能会受到限制。

以基因工程手段构建GRAS级安全菌株发酵生产HA是未来发展的趋势。