透明质酸的生产郭学平凌沛学王春喜张天民透明质酸是一种酸性黏多糖，广泛存在于动物的组织细胞间质（基质）和某些细菌的荚膜中。
1934年Meyer等首先从牛眼玻璃体中分离出该物质，并命名为hyaluronic acid（HA）。
HA由葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖组成的双糖单位构建成的直链多糖，相对分子质量（Ｍr）为（1~10）×105。
HA的生产工艺主要分为两大类，以动物组织为原料的提取法和细菌发酵法。
几乎所有的动物组织中均含有HA，只是含量不同，能够用于生产的原料主要为鸡冠和人脐带。
细菌发酵法是利用某些种属的链球菌在生长繁殖过程中，向胞外分泌以HA为主要成分的荚膜。
细菌发酵法与动物组织提法相比，具有生产规模不受动物原料限制，发酵液中HA以游离状态存在，易于分离纯化，成本低，易于形成规模化工业生产，无动物来源的致病病毒污染的危险等优点。
HA无种属差异，不同动物组织提取的及不同菌种发酵生产的HA，在化学本质和分子结构上是一致的，只是Ｍr有差别。
1以雄鸡冠为原料的生产工艺[1，2]1.1 工艺过程[1，2]冻鸡冠解冻后，用绞肉机绞碎，加适量水用胶体磨磨成糊状，按每1kg 鸡冠加水8L，加氯化钠80g，搅拌加热至90℃，保温10min，冷却至50℃，用1mol/L氢氧化钠液调pH8.5~9.0，加入适量胰酶，45℃~50℃保温酶解5h~7h，酶解过程中维持pH8.5~9.0。
将酶解提取液用滤布加硅藻土加压过滤，得澄清滤液。
取滤液，调pH6.0~6.5，将滤液加到3倍体积的95%乙醇中，反复倾倒3次，待纤维状沉淀充分上浮后，取出沉淀，用适量乙醇脱水3~5次，真空干燥，得HA中间品。
将HA中间品溶于0.1mol/L氯化钠溶液中，溶解浓度为0.3%，溶解过程中加少量氯仿防腐。
溶解后，调pH4.5~5.0，加入等体积的氯仿搅拌处理2次，静置分出水相。
将水相用稀氢氧化钠溶液调pH7.5，加入适量链霉蛋白酶，37℃酶解24h。
酶解结束后，向酶解液中加入同体积的1%氯化十六烷基吡啶（CPC）溶液，静置，收集HA-CPC络合沉淀。
将HA-CPC 络合沉淀加入0.4mol/L氯化钠溶液中，搅拌解离5h~10h。
解离液先用硅藻土过滤至清，再用0.2μm微孔滤膜精滤。
将滤液加至3倍体积的95%乙醇中，反复倾倒3次，取出纤维状HA沉淀，脱水，真空干燥，得药用HA精品。
1.2 工艺说明与讨论鸡冠绞碎后用胶体磨处理时，注意不要磨得太细，以减少机械剪切力对HA的降解。
磨成糊状后，酶解和提取同时进行，提取效率高。
提取时，在水中加入1%的氯化钠。
加热至90℃可对原料有一定灭菌作用，并使蛋白质热变性，易被蛋白酶水解。
所用的蛋白水解酶为胰酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶等。
公鸡冠中的HA与蛋白质以结合状态存在，酶解的另一重要作用是切断HA与蛋白质分子的结合。
提取和酶解时，应注意防腐。
醇沉淀是分离提纯HA、肝素、硫酸软骨素等最常用的方法之一，在制备过程中，可多次重复使用，类似于重结晶的作用。
在从水溶液中用甲醇或乙醇沉淀HA或其它黏多糖时，必须有盐的存在，一般为1%左右的氯化钠。
沉淀形态有纤维状和无定型粉末状两种形态，纤维状HA容易制备，形态疏松，易于脱水和真空干燥，缺点是使用时，溶解速度慢。
制备无定型粉末状沉淀，需控制料液的盐浓度、料液和乙醇的混合速度及搅拌速度等诸多因素，工艺较复杂，但粉末状HA溶解速度快，使用方便。
第一次乙醇沉淀、脱水、真空干燥所得HA产品，可作为化妆品用保湿剂。
进行进一步精制时，可以使用干燥的产品，也可使用乙醇沉淀后未干燥的产品，这样可以缩短生产周期。
氯仿可使蛋白变性沉淀，利用此作用可除去一部分蛋白质杂质。
氯仿处理的另一个重要的作用，是除去致炎物质。
可反复多次进行氯仿处理。
CPC络合沉淀与解离步骤是分离提纯酸性黏多糖常用的方法之一，特点是纯化效率高、回收率高，可以从很低浓度的溶液中将HA或其它酸性黏多糖沉淀出来。
在低盐浓度下，HA与CPC络合沉淀，在高盐浓度下，HA-CPC 络合物解离溶解。
利用这一性质，可除去不能与CPC络合并沉淀的杂质。
HA在干燥之前要充分脱水，否则有机溶剂挥发后，残存的水分过多，会导致被干燥的产品黏结，不易于干燥，干燥时间延长，干燥后产品变硬、变黄。
脱水所用的溶剂为95%乙醇、无水乙醇、丙酮等。
丙酮的沸点低，用丙酮脱水易于干燥，但干燥后的产品带有特殊气味。
干燥的产品量较少时，可采用静止状态下，加五氧化二磷进行常温真空干燥；产品量较多时，可采用动态的真空干燥。
从雄鸡冠提取HA，产品的M r和收率与鸡的品种及生长期有很大的关系。
生长期在一年以上的雄鸡，尤其鸡冠较大的，产品的M r可达2×106，HA中间品的收率以鸡冠湿重计在1%左右，从中间品到药用精品的纯化收率为50%~70%。
药用精品的纯度以葡糖醛酸计可达46%以上（纯HA的葡糖醛酸含量为48.37%），蛋白质含量低于0.1%。
目前国际上提取的注射级HA的质量水平为：葡糖醛酸含量大于46%，M r大于1.5×106，蛋白质含量小于0.1%，内毒素含量小于0.2EU/mg。
2 细菌发酵法生产工艺2.1 工艺过程[3~5]取斜面菌种，接种于装有灭菌培养液锥形瓶中，37℃培养12h~16h，接种于种子罐中。
培养液中氮源为蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏等，碳源为葡萄糖。
37℃搅拌培养12h~16h，接种于发酵罐中。
接种比例1：10。
发酵液配方基本与种子液相同，只是葡萄糖含量较高，一般为3%~6%。
维持通气量0.3vvm~1.0vvm，搅拌转速120r/min，37℃发酵40h~46h。
在发酵过程中，发酵液的pH值不断下降，需调pH6.5~7.0。
发酵后期，葡萄糖浓度下降至0.5%以下，pH值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。
发酵结束，用三氯乙酸调pH4.0~4.5，板框过滤除菌体，滤液调pH6.0~6.5，加3倍体积95%乙醇，沉淀出HA。
沉淀用发酵体积的0.1mol/L氯化钠水溶液溶解，在搅拌下，加入过量的1%CPC与滤液中的HA发生络合沉淀，静置使沉淀下沉。
虹吸出母液，加入0.1mol/L氯化钠液洗涤沉淀两次。
沉淀在发酵体积的0.4mol/L氯化钠液中搅拌解离过夜。
过滤，滤液加乙醇沉淀，乙醇脱水，真空干燥得HA。
2.2工艺说明与讨论早在1937年，Kendall等[6]就发现链球菌可产生HA，许多人对此进行了研究。
链球菌属的多种细菌具有荚膜，这种荚膜的主要成分就是HA。
链球菌在生长过程中，荚膜的产生有几种不同的情况，有的菌株在整个生长期都有荚膜，有的在对数生长期的前段产生，后段消失，或稳定期消失，有的根本不产生荚膜。
进一步的研究发现这与菌种是否产生HA酶有密切关系，荚膜的消失是由于被酶水解。
MacLennan[7]根据是否产生HA和HA酶，将具有荚膜的链球菌C组分为三类：1）只产生HA，不产生HA酶；2）HA和HA酶都产生；3）只产生HA酶，不产生HA。
因此，HA酶的产生对HA的发酵非常不利，在菌种筛选时，要注意观察判断菌种是否同时产生HA酶。
可产生HA的链球菌多为A组和C组，A组中主要有酿脓链球菌等，由于致病性较强，较少用作菌种进行大规模发酵；C组致病性较弱，多采用此类菌，主要有兽疫链球菌、马链球菌和类马链球菌等。
发酵生产HA所用的菌种，一般是将产生HA的链球菌进行诱变处理得到，诱变方法有紫外线照射、化学诱变剂处理等。
除链球菌外，还有Pasteurella multocida可产生HA[8]。
早期对链球菌荚膜HA的研究，主要是为了探索链球菌的荚膜组成和其作用[9~11]及实验室少量制备等，以工业化生产为目的的发酵HA研究始于80年代初期[12]，在借鉴前人对某些链球菌产生HA荚膜这一重要发现，利用现代液体深层发酵技术和设备，对菌种、培养基、各种发酵参数条件进行了优化，并对细菌生物合成HA的代谢过程进行了深入研究，阐明了HA在菌体内的合成路线，使发酵产率和HA的Ｍr有了大幅度的提高，发酵法已成为HA生产的主流工艺。
链球菌的营养需求较高，通常需含血清、小牛肉浸出液（veal infusion broth）、脑心浸出液（brain heart infusion）等培养基，菌体才能较好地生长，但这类营养物质价格昂贵，大规模生产中用其作为培养基，成本太高。
所以在选择菌种时，要考虑其营养需求及所用培养基的成本问题。
发酵生产HA所用的培养基，氮源为蛋白胨、酪蛋白水解液、酵母膏或浸出粉、牛肉浸膏、大豆蛋白水解液、尿素、无机铵盐等。
其中酵母膏最常用，除了作为氮源外，还含有多种维生素和生长因子，有些是链球菌生长所必需的。
在发酵液中添加一定量的谷氨酸和精氨酸[13]，可以提高HA的产率。
碳源主要是各种单糖、蔗糖和淀粉水解物，最常用的是葡萄糖。
其他还有磷酸盐、硫酸盐，钾、钠、钙、镁等无机盐，铁、锰、铜、锌等微量元素。
链球菌属于兼性厌氧菌。
在HA的发酵工艺中，大多数采用有氧发酵，也有的采用厌氧发酵。
根据HA生物合成路线，有氧发酵的葡萄糖能量代谢可产生更多的A TP，有利于UTP生成，而UTP是合成HA的两个活化前提物，即UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖所必需的物质。
因此从代谢调控的角度来说，有氧发酵有利于HA的合成。
Nimrod等[14]用兽疫链球菌的一个变异菌株进行发酵，在厌氧条件下，HA的产率为2g/L；在通气条件下，为4g/L~6g/L。
在发酵过程中通常保持一个适当的溶氧量，也可在不同阶段采用不同的溶氧量。
通过增加通气量和提高搅拌转速可提高发酵液的溶氧，但转速过快可导致HA的机械降解。
在HA的发酵过程中，pH值是一个重要的因素，一般控制在6.0~8.5范围内，最好在7.0左右。
链球菌是一种乳酸菌，产生乳酸等小分子有机酸，需用碱液进行中和，以维持适当的pH值。
在摇瓶和种子罐培养阶段，温度一般控制在37℃。
发酵温度一般为37℃，也有的采用35℃或33℃等较低的温度，或在不同的阶段采用不同的温度。
在种子培养阶段和发酵的初期，37℃培养可使菌体较快的生长繁殖，发酵中期和后期可适当降低温度，据报道可使葡萄糖的代谢方向由合成菌体细胞壁转向合成HA，提高HA的产率。
药用级HA的Ｍr要求较高，发酵法生产的HA的平均Ｍr为（1~4）×106，人们试图通过葡萄糖的代谢调控，来提高HA的Ｍr。
Kitchen[16]等发现从成纤维细胞分离出的HA合成酶的半衰期仅有2h~4h，大约相当于一条HA分子链的合成时间，于是推断：一个HA分子的Ｍr或链长度，取决于合成它的合成酶在其生命期内可聚合前提物分子（UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡糖）的数量。
根据这一理论，菌体过多的表达HA合成酶，酶分子之间会竞争同一前提物资源，导致HAＭr的降低。
