固相膜免疫测定

固相膜免疫测定

固相膜免疫测定与ELISA相类似，其特点是以微孔膜作为固相。固相膜的特点在于其多孔性、非共价键高度吸附抗体或抗原和易于漂洗等，固相膜像滤纸一样，可被液体穿过流出，液体也可以通过毛细管作用在膜上向前移行。标志物可用酶或各种有色微粒子，如彩色胶乳、胶体金或胶体硒等。

不需大型设备

易掌握操作要求和判定标准

家庭式保健检测和床旁检测

常用的固相膜

玻璃纤维素膜、尼龙膜、聚偏氟乙烯（PVDF）膜和硝酸纤维素（NC）膜等。其中最常用为NC膜。

固相膜的技术要求

1.孔径：即能通过粒子的大小，以微米（μm）表示。包括穿流法（0.4μm）、横流法（5～10μm）的膜。

2.流速：以ml/（cm2·min）表示。孔径大，流速快。

3.蛋白质结合力：吸附力很强，以μg／cm2表示。

4.均一性：优质的膜应具有良好的均一性，这样才能保证试剂批内的均一性。

免疫金标记技术

免疫金标记技术主要利用金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标志物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点，用于定性或半定量的快速免疫检测。这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称为免疫金银染色.

胶体金的制备

向一定浓度的金溶液（氯金酸）内加入一定量的还原剂（枸橼酸钠等）使金离子还原成金原子（内层为负离子层AuCl2-，外层是带正电荷的H+），形成金颗粒悬液，也称金溶胶。

枸橼酸三钠还原法制备金溶胶，如此制备的金溶胶其可见光区最高吸收峰在535nm。金溶胶的光散射性与溶胶颗粒的大小密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化，这就是金溶胶用于免疫沉淀或免疫凝集试验的基础。

免疫金制备

免疫金是指胶体金与抗原或抗体等大分子物质的结合物称为免疫金。制备原理为蛋白质被吸附到胶体金颗粒表面而结合的过程。

1.胶体金溶液的pH，原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。

2.蛋白质最适标记量。

3.聚乙二醇（PEG）和牛血清白蛋白（BSA）是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：①为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；②为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。

膜载体免疫测定的种类与原理

一、免疫渗滤试验

二、免疫层析试验

三、斑点酶免疫吸附试验

四、酶联免疫斑点试验

五、免疫印迹法

六、放射免疫沉淀试验

一、免疫渗滤试验

免疫渗滤试验（IFA）用于检测各种传染病的抗体和肿瘤标志物等。用于检测尿液HCG的“金标”早孕诊断试剂也已广泛应用。

原理

加标本、免疫金、洗涤液。

方法类型

双抗体夹心法：测抗原用抗体结合在微孔滤膜中央，滴加待检标本，若标本中为待测抗原则与膜上抗体结合，然后滴加金标抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。

间接法测特异性抗体：用抗原包被在微孔滤膜上，滴加待测标本，滴加洗涤液洗涤后，滴加金标抗抗体，加洗涤液洗涤后，阳性者即在膜中央呈红色斑点（胶体金聚集）。该法由于血清标本中非目的IgG的干扰，易导致假阳性结果，临床上较少用。

二、斑点金免疫层析试验

原理

方法类型

DICA多用于检测抗原，但亦可用于检测抗体。常见方法类型有：

双抗体夹心法测抗原。

竞争法测小分子抗原。

间接法（很少用）：为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗体常设计成反流免疫层析法。

双抗体夹心法

抗原竞争法

技术要点

临床应用

简便、快捷，无需特殊仪器设备

灵敏度高

定性或半定量试验

三、斑点酶免疫吸附试验（Dot-ELISA）

斑点酶免疫吸附试验（Dot-ELISA）的实验原理与常规的ELISA相同，不同之处在于斑点-ELISA所用载体为蛋白质具有极强吸附力（近100%）的硝酸纤维素（NC）膜，此外酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC染色。实验方法为：加少量（1～2μl）抗原于膜上，由于NC膜吸附能力强，故需在干燥后进行封闭；然后滴加样品血清，其中的待检抗体即与NC膜上抗原结合；洗涤后再滴加酶标二抗，最后滴加能形成不溶有色物的底物溶液（如HRP标志物，常用二氨基联苯胺）；阳性者即可在膜上出现肉眼可见的染色斑点。

原理

特点

NC膜吸附蛋白力强，微量抗原吸附完全，微量抗原吸附完全，故检出灵敏度可较普通ELISA高6～8倍；试剂用量较ELISA节约约10倍；操作简单，不需特殊仪器；可长期保存（－20℃可长达6个月），不影响其活性。

四、酶联免疫斑点试验（ELISPOT）

原理

细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP／NBT底物孵育后，PVDF膜出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。

ELISPOT特点

ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：

1.ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。

2.ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。

3.由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万～30万个细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。

4.捕获抗体为高亲和力、高特异性和低内毒素McAb，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

临床应用

非常广泛，如移植中排斥反应的预测、疫苗发展、Th1/Th2分析、自身免疫病研究、肿瘤研究、过敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原决定簇图谱分析、化合物和药物免疫学反应的筛选等。

五、免疫印迹法（IBT）

亦称酶联免疫电转移印迹法（EITB）是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的技术，具有分析容量大、敏感性高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。（Westernblot）

原理

第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。

第二阶段为电转移。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。

第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。常用的HRP底物为3，3-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。阳性反应的条带清晰可辨。并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。

六、放射免疫沉淀试验

放射免疫沉淀试验（RIPA）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法，是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法，同时弥补了免疫印迹法的不足。

习题

有关胶体金颗粒大小特性的正确描述

A.胶体金颗粒越大，最大吸收波长越小

B.溶液呈色与胶体金颗粒大小无关

C.颗粒越大，呈色越深

D.大小与制备时柠檬酸三钠加入量无关

E.大小与制备时柠檬酸三钠加入量呈正比

『正确答案』C

『答案解析』胶体金颗粒越大，呈色越深。

斑点金免疫层析试验竞争法测小分子抗原，层析条的待测样品结果判读处应包被

A.胶体金标记抗a抗体

B.标准抗原（a）

C.抗免疫金抗体

D.抗a抗体

E.小鼠IgG

『正确答案』B

『答案解析』斑点金免疫层析试验竞争法测小分子抗原，层析条的待测样品结果判读处应包被标准抗原（a）。

免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原b，层析条的待测样品结果判读处应包被

A.胶体金标记抗b抗体

B.抗b抗体

C.抗免疫金抗体

D.标准抗原（b）

E.人血清IgG

『正确答案』B

『答案解析』免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原b，层析条的待测样品结果判读处应包被抗b抗体。