原生质体在 遗传育种中的应用
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植物组织培养读书报告
原生质体培养及在遗传育种中的应用
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论文提交日期 ### 年 ## 月 # 日 原生质体培养及在遗传育种中的应用
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摘要：原生质体技术包括原生质体植株再生、原生质体融合技术等，在植物育种应用工作中取得了一定的成果，对育种工作的发展起了非常重要的作用。本文主要介绍原生质体及原生质体融合技术和这一技术在植物遗传育种中的应用。
关键词：原生质体 融合 遗传育种
Protoplast culture and its application in genetic breeding
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Abstract：Protoplast techniques include protoplast plant regeneration and protoplast fusion
technology etc. It has achieved some results in the application work of plant breeding, and has
played a very important role in the development of breeding. This paper describes the protoplast
and protoplast fusion techniques and the applications in plant genetics and breeding.
Key words：Protoplast fusion genetic breeding
0. 关于原生质体
原生质是有组织的生物活性物质，是细胞生命活动的物质基础，所有的原生质有相似的基本组成成分和特性。原生质体是由原生质特化而来细胞内由原生质组成的各种结构的统称，它们彼此联系相互影响而构成一个有机整体，担负着细胞的所有生命活动。
1. 原生质体培养发展简史及其意义
1.1 发展简史
1892年Klereker首先用机械的方法分离得到了原生质体，但数量少且易受损伤。1960年，英国植物生理学家Cocking首先用酶解法从番茄幼苗的根分离原生质体获得成功。他使用一种由疣孢漆斑菌培养物制备的高浓度的纤维素酶溶液降解细胞壁。然而，直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。并且能从烟草、胡萝、矮牵牛、茄子、番茄等70种植物的原生质体再生成完整的植株。此外，原生质体融合，体细胞杂交的技术也得到广泛的应用。
1.2 原生质体培养的意义：
（1）为细胞融合奠定基础。有性杂交不能进行细胞质交流；（2）是遗传工程的理想受体。能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物。原生质体也具有全能性，原生质体是分子水平和细胞水平上研究遗传信息动态的结合点；（3）是进行理论研究的重要生物材料。
2. 原生质体分离
2.1 材料选择与预处理 获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂，因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞。原生质体预处理即对植株限制供水，首先对外植体进行预处理，有两种方法。低温处理：外植体放在4℃下，黑暗中1-2天。等渗溶液处理：外植体放在等渗溶液中数小时。
2.2 分离方法
机械法：利刃机械切割。1982年，Klercker第一次用机械方法从Stratiots aloides中获得原生质体。他们的做法是首先使细胞发生质壁分离,然后切开细胞壁释放出原生质体。该方法的缺点是原生质体产量低，因此液泡化程度低的细胞也不能采用此方法。目前，该方法没有得到广泛应用。
酶解法：主要用到的酶是果胶酶与纤维素酶。酶解法又可分为两步法和一步法。两步法即先用果胶酶处理使成为游离单细胞，纤维素酶处理单细胞成为原生质体。优点：所获得的原生质体均匀一致、质量好；缺点：操作复杂，已被淘汰。酶处理目前常用的多是"一步法"，即把一定量的纤维素酶，果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，材料在其中处理一次即可得到分离的原生质体。两种方法的关键在于酶液配制，酶溶液的渗透压和pH值对原生质体的产量和生活力影响很大。因此要注意纤维素酶、果胶酶和渗透压稳定剂（甘露醇）的配比及pH。
2.3 分离步骤
取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外表皮切成4cm的小块。制作混合酶液（纤维素酶2％和果胶酶0.5％）并加入的0.7mol甘露醇0.1mmolCaCl2，pH5.6。将小块烟叶放入混合酶液25℃处理8~10小时。过滤、离心、洗涤(0.7mol甘露醇液含0.1mmolCaCl2)。如此2~3次，得原生质体。
3． 原生质体的纯化
在分离的原生质体中，常常混杂有亚细胞碎片，维管束成分，未解离细胞，破碎的原生质体以及微生物等。这些混杂物的存在会对原生质体产生不良影响。此外，还需去掉酶溶液。以净化原生质体。原生质体纯化方法有：离心沉淀法，漂浮法，接口法三种。
3.1 离心沉淀法
原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质沉于底部。步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。第二步离心（500~1000r/min离心5~6min）。第三步吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新悬浮，再离心沉淀，如此2~3次。第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。洗涤液成分：0.45mol/L甘露醇，10mmol/LCaCl2、H2O，0.7mmolKH2PO4。洗涤液pH：5.6。
3.2 接口法: 原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种浓度的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间。
3.3 漂浮法：
原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。洗涤液：3％蔗糖+0.4mol/L甘露醇+1480mg/LCaCl22H2O。或11％~23％的蔗糖溶液。
4. 原生质体的培养
4.1 培养基
1.碳源
2.氮源
3.生长物质
4.钙镁
5.渗透压。常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。原生质体的渗透压原则：培养基渗透压与细胞渗透压等渗。
6.pH及灭菌
4.2 培养方法
1.液体浅层培养
液体培养法是在培养基中不加凝胶剂，原生质体悬浮在液体培养基中，常用的是液体浅层培养法，即含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层。这种方法操作简便，对原生质体伤害较小，日便于添加培养基和转移培养物，是目前原生质体培养工作中广泛应用的方法之一。其缺点是原生质体在培养基中分布不均匀，容易造成局部密度过高或原生质互相粘连而影响进一步的生长发育．并且难以定点观察，很难监视单个原生质体的发育过程。
2.平板法培养
取1ml原生质体密度为4×105/ml悬浮液，与等体积已溶解的含有1.4%低熔点（40℃）琼脂糖的培养基均匀混合后，置于直径为6cm培养皿中，此时密度为2×105/ml，待凝固后，将培养皿翻转，置于四周垫有保湿材料的直径为9cm培养皿内。
3.悬滴法培养
将含有一定密度原生质的悬浮液，用滴管或定量加液器，滴在培养皿的内侧上，一般直径为6cm培养皿盖滴6～7滴，皿底加入培养液或渗透剂等液体以保湿，轻而快的将皿盖盖在培养皿上，此时培养小滴悬挂在皿盖内。
4.双层培养法
为固体培养和液体培养想结合的方法。
5.饲喂层培养
培养方法是将饲喂层的细胞用培养基制作平板，此平板即“饲喂层“。 4.3 培养条件
培养温度保持在25～27℃，光照16h/d左右，净置为主，但为了不使细胞集聚，最初几天需经常轻轻摇动，以助通气。
4.4 影响原生质体培养的主要因素：
基因型：如番茄和秘鲁番茄有性杂交后对性状分离的遗传分析，证明其愈伤组织的再生能力是2个显性基因所决定。
原生质体的来源：供体材料体类型、供体细胞的分化程度、供体细胞的生长同步性；
其实培养密度与培养基；基本起始密度、培养基激素水平、密度与培养基营养成分完全性。
5. 原生质体再生
将有生活力的原生质体在适当的培养基和培养条件下培养，很快就开始出现细胞壁再生和细胞分裂的过程。约1～2个月后，通过细胞的持续分裂，在培养基上出现肉眼可见的细胞团。细胞团长到2～4mm左右，即可转移到分化培养基上，诱导芽和根长成完整的植株。
6．原生质体培养在育种上的应用
原生质体技术作为细胞工程的核心部分，作为传统育种的辅助手段，能克服作物有性杂交的不亲和性，突破传统育种的某些限制，而达到种属之间甚至不同科之间的融合，实现远缘杂交。这是目前进行作物改良和新种质创造的一种重要方法。到目前为止，原生质体技术在十字花科、茄科、伞形科、菊科、百合科和葫芦科蔬菜育种中均作了大量的研究，并取得了一些成果。
6. 1 通过原生质体融合创造新的育种材料，丰富种质资源
原生质体体积小，群体大，对培养体系中的理化因素更加敏感，因而原生质体的无性变异率也比一般的体细胞无性系变异率更高。因此，在原生质体培养过程中进行人为地诱导，将会得到更多的变异，从而为增加种质资源提供更多的可能。杂交不亲和性是远缘杂交育种成功率不高的主要原因之一，然而原生质体融合技术在某种程度上可以消除杂种不亲和障碍而形成杂和二价体，理论上，如果杂种植株可育并能稳定地遗传，则可能形成农业上有用的新品种。另外，原生质体也是进行非载体遗传操作的良好受体，它能够直接从外界摄取病毒、 细菌、细胞器、细胞核、蛋白质、核酸等，为高等植物的遗传转化创造了有利条件。用根瘤农杆菌感染芦笋嫩茎切段，可以诱导产生肿瘤，用改建后的Ti质粒农杆菌感染芦笋嫩茎部，可以诱导大量不定芽的形成30%，而且获得了转化再生植株
[1]。Mukhopa - dhyay等报道甘蓝下胚轴原生质体在PEG的介导下，直接摄取了抗潮霉素的标记基因的质粒DNA。由此可见，细胞质融合技术明显优于有性杂交之处是它可以对细胞质进行遗传操作，从而引起各种细胞器如线粒体、 叶绿
