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植物原生质体技术及其应用

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植物原生质体技术及其应用

中国蓉亏通报2009,25(08):22—26 ChineseAgriculturalScienceBulletin

植物原生质体技术及其应用

于晓玲,李春强,彭明

(中图热带农,『科学院热带生物技术研究所,海口571101)

摘要:原生质体技术是在原生质体分离基础上,进行一系列技术操作,包括原生质

体融合,遗传转化,植

株再生等.原生质体技术为细胞杂交,新品种培育,及其与有关的细胞,分子和遗传

等学科的交叉渗透,

提供一种使用范围广,可行性强的技术体系.阐述了植物原生质体的分离培养,遗

传转化等关键技术及

其应用,认为原生质体技术在高等植物遗传性状的改良及生产实践中有着广阔的

应用前景.

关键词:原生质体;制备;遗传转化

中图分类号:$336文献标识码:A AdvancesontheResearchofProtoplastTechnology

YuXiaoling,LiChunqiang,PengMing

(b~tituteofTropicalBioscienceandBiotechnology,ChineseAcademyofTropicalAgricultu

ralSciences,Haikou571101)

Abstract:ProtoplasttechnologyisaseriesoftechnicaloperationsbasedOilprotoplastisolati

on,including

protoplastfusion,genetictransformation,andplantregenerationandSOon.Theprotoplastte

chnologiesprovide

awideuserangeandfeasibletechnologysystem,forcellhybridizationandbreedingofnewsp

ecies,and

cross—

infiltrationamongsubjectsofcellculture,molecularandgenetics.Inthispaper,theseparation

,culture

andapplicationofprotoplasttechniqueweresummarizes.Webelievethattherehasfartherap

plicationinthe

geneticimprovementofhigherplantsandpractice.

Keywords:protoplast,preparation,genetictransfonnation

植物原生质体是指去除细胞壁被质膜所包围的,

具有生活力的细胞,其结构包括细胞膜,细胞质(包括

各种细胞器,细胞骨架系统及胞基质)和细胞核等部

分.原生质体技术是指在原生质体的分离培养基础上

进行的一系列技术操作,主要包括原生质体植株再生,

原生质体融合和细胞杂交,转基因等培育变异新类型

的生物技术等.原生质体培养和植株再生技术具有使

用范围广,可行性强等优点,是植物生物工程的基础.

对植物原生质体的研究,可追溯到20世纪60年

代,英国植物学家Cockingt用酶解方法降解细胞壁,

获得了番茄根尖原生质体,自此原生质体的研究得到

迅速发展.1970年Nagata和Takeble口首次报道烟草

叶肉原生质体经分离,培养得到再生植株.Carlson

于1972年利用原生质体融合技术从烟草中获得第一个

种间杂种,可部分克服有性杂交不亲和性,获得体细胞

杂种,从而为创造和选育优良品种找到了一条新途径.

近年来,由于原生质体具有结构简单,发育同步性

好,群体数量大,DNA分子易于进入细胞,易获得纯合

性转化子的特点,及其培养技术与有关的细胞,分子和

遗传等学科的交叉渗透,使植物原生质体的研究越来

越受到重视.研究领域也从分离原生质体进行的生理

生化和利用不同材料的原生质体得到再生植株的阶段

转到原生质体的应用(尤其是遗传性状改良)方面.笔

者对植物原生质体的关键技术及其应用进行综述. 1原生质体的分离和培养

1.1原生质体的分离

1.1.1分离方法原生质体的分离方法有两种:机械分

离法和酶解分离法.机械分离法由于产量低,方法繁

琐费力;以及对分生组织和液泡化程度不高的细胞不

适用的特点,现在已很少有人使用.

基金项目:中国热带农业科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金

资助"橡胶转基因技术平台的建立"(ITBBZD0711)a

第一作者简介:于晓玲,女,1979年出生,硕士,研究方向:基因工程通信地址:571101

海南省海口市城西学院路4号热带生物技术研究所,E—mail ******************.

收稿日期:2009.O1.07,修回日期:2009.02.18.

于晓玲等:植物原生质体技术及其应用?23?

酶解分离法为目前普遍采用的原生质体分离方

法.酶解是在25～28℃的恒温,黑暗或弱光下进行;酶

解后经过O.038nlnl孔径左右的镍丝网过滤,滤去消解

不完全的组织碎块(导管,筛管等)和细胞团.然后将

滤液离心,弃去上清液,将离心下来的原生质体重新悬

浮在洗液(CPW)中,再次离心,去上清液,重复3次.

在倒置显微镜下检查纯化效果,效果好,用原生质体培

养基离心,效果不好,用质量分数为20%的蔗糖离心,

使完整的原生质体浮于液面.

1.1.2影响原生质体分离的因素植物材料的选择,预

处理过程,酶制剂的使用等均可影响原生质体的分离

效果. (1)材料

选择适宜材料是成功分离原生质体的关键,主要

包括基因型,材料的类型及材料的生理状态等方面.

基因型影响原生质体分离的效果,包括原生质体产量,

活力和植株再生方面.材料及其生理状态对原生质

体的制备和活力的影响也很大阁.

叶片可以得到大量比较均一的原生质体且不使母

细胞受到破坏,许多资料报道双子叶植物分离原生质

体的最佳材料是叶片p.此外,子叶,胚轴,茎尖及愈

伤组织,悬浮培养物和体细胞胚等均可作为分离原生

质体的材料.在木本植物中,愈伤组织或细胞悬浮物

是应用最广泛的原生质体培养材料u.但是,采用愈

伤组织和细胞悬浮物往往需要经若干次的继代培养才

能达到适合分离原生质体的状态;而继代时间的长短

在很大程度上影响所获得原生质体的活力和产量n". (2)预处理

许多研究报道,酶解之前对材料进行预处理有利

于原生质体的分离,对保持原生质体的完整性及提高

原生质体的产量都有积极的作用.Power等[1报道,

酶解以前对材料进行暗处理,有利于原生质产量的提

高.Willin等同把苹果叶片放在附加质量分数为5%

PVP并添加0.5mmol/L的蛋氨酸的W5盐.糖溶液中处

理30min,原生质体的产量明显提高.金晓玲等的研

究表明,在分离草莓叶肉原生质体前将试管苗转入低

浓度蔗糖的培养基中预培养2～3周,或暗处理1周,原

生质体的产量大大提高【8].但是并非所有的原生质体

分离都需要经过预处理,如柑桔试管苗幼叶原生质体

的游离.在实验中,材料是否需要预处理要根据不

同的情况而定. (3)酶制剂

酶的类型及使用浓度:目前用于游离原生质体常

用的酶有纤维素酶,半纤维素酶,果胶酶和离析酶等,

其中纤维素酶和果胶酶对植物原生质体的制备是最必

要的.酶液中纤维素酶与果胶酶或离析酶的浓度和比

例对原生质体的解离效果具有较大的影响【".酶制剂

的选择要根据材料的不同而定.此外,由于不纯的酶

制剂所含杂质对原生质体可能有不同程度的毒害作

用,因此,也要特别重视酶的质量和来源.酶液浓度过

高或过低均不利于原生质体的解离.而酶浓度随其酶

活性高低而异,且每批次酶活性不一,因此不同批次的

酶宜先进行最佳浓度预实验.

酶液添加物:酶液对原生质体的产量和活力有很

大影响.原生质体在无稳压剂的介质中会因过分吸胀

而裂.过高或过低的渗透压对原生质体均有损伤,不

利于以后的培养.常用的渗透压稳定剂有两大类:一

类为糖醇或可溶性糖(如甘露醇,山梨醇,蔗糖或葡萄

糖等)组成有机溶液;另一类为无机盐溶液,常由 CaC1:,MgSO或培养基中的无机盐组成.通常用甘露

醇,山梨醇,葡萄糖来调节酶液的渗透压.W巴尔茨 (1983)等认为,代谢活跃的渗透压稳定剂(葡萄糖和

山梨醇)与代谢不活跃的渗透压稳定剂(甘露醇)一起使

用有利于维持酶液的渗透压.由于酶制剂中常含有核

酸酶,影响原生质体的活力,可以用降低保温温度或减

少酶解时间,提高原生质体的活力.加入适量的PVP

或MES能稳定酶解过程的pHt】.

酶液的处理时间:酶解处理～般静置在黑暗中进

行,也可偶尔轻摇,酶解时间几小时至几十小时不等.

实践表明:如果酶液处理时间太短,所获得的原生质体

量少而不能满足实验的需要,但过长时间酶液又会对

原生质体具有一定的伤害作用,从而影响原生质体的

产量和细胞壁再生的能力.因此,为了获得大量的具

有高活力的原生质体,酶解时间一般以12～14h为

宜.酶解温度一般在27℃左右. 1.2原生质体的培养

1.2.1培养基原生质体的培养基多采用以MS培养基

为基础的改良培养基,一般酸度为pH5.6—5.8.无机盐

是构成培养基的主要成分,较高的Ca2浓度能提高原

生质体的稳定性.高浓度的NH4+对原生质体的生长

发育不利".实验证明糖是原生质体培养中较理想的

渗透压稳定剂和碳源【l.

抗氧化剂(甘氨酸,PVP(聚乙烯吡咯烷酮),维生

素C等)的添加可较好地防止木本植物原生质体再生

细胞团的褐化现象[2o1.细胞壁脱离后,随着培养天数

的增加,RNase酶活性异常升高,加入BSA可降低该酶

的活性,保证原生质体的活力".

不同植物原生质体培养对激素的种类和浓度的要

24?中国农学通报http://www.casb.org.cn

求存在很大的差异,通常在培养前期需要较高水平的

生长素和细胞分裂素,才能启动细胞壁的再生和细胞

分裂. 1.2.2培养方法原生质体的培养方法主要有液体培

养,固体培养和固液结合培养等.液体培养法操作简

单,对原生质体损伤较小,且易于添加新鲜培养物,但

此法常会使原生质体分布不均匀,发育的原生质体之

间产生粘连而影响其进一步的生长和发育,尤其是难

以定点观察单个原生质体的命运.

最简单的固液结合培养法是在培养皿的底部先铺

上一薄层含或不含原生质体的固体培养基,再在其上

进行原生质体的液体浅层培养,此法有利于固体培养

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烟草叶片原生质体制备及其在蛋白互作研究中的应用

烟草叶片原生质体制备及其在蛋白互作研究中的应用

烟草叶片原生质体制备及其在蛋白互作研究中的应用

刘敏;顾志敏

【摘 要】[目的]获得高产量的烟草叶片原生质体.[方法]在前人的基础上,在酶浓度和酶解时间上,对简易大量制备本氏烟叶原生质体的条件进行了进一步的探索;并以此为基础,通过双分子荧光互补试验进一步研究了其在蛋白互作研究中的应用.[结果]在纤维素酶浓度为1.3％,离析酶浓度为0.4％,果胶酶浓度为0.3％,酶解4h,酶解温度28℃,并在简易纯化的条件下制备原生质体,所得到的完整原生质体产量最高,并且细胞碎片和杂质均最少.[结论]该方法为瞬时表达于本氏烟叶中的荧光蛋白研究提供了重要的技术参考.

【期刊名称】《安徽农业科学》

【年(卷),期】2014(000)016

【总页数】5页(P5002-5006)

【关键词】烟草(Nicotiana benthamiana);原生质体制备;双分子荧光互补试验;蛋白互作

【作 者】刘敏;顾志敏

【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华321004

【正文语种】中 文

【中图分类】S572 植物原生质体(protoplast)一词始自Hanstein，即指通过质壁分离，脱去细胞壁的细胞[1]。细胞壁是植物细胞的围墙，用其相对坚固的结构包围着其内部的原生质体，保护和支撑着植物细胞，其主要成分为纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质等。在原生质体的所有分离方法中，酶解法效果最佳[2]。随着植物生物学的发展，原生质体已经越来越广泛应用于植物生理学、细胞生物学、体细胞遗传学等研究领域[1]，是生理生化研究、基因表达调控研究、基因定位研究、细胞器制备、细胞融合和新品种培育等研究的理想材料[3]。

目前，原生质体在植物分子生物学领域应用非常广泛，其中就包括蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用研究。亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位。例如在核内、胞质内或者细胞膜上存在。GFP是绿色荧光蛋白，将所研究蛋白与GFP融合构建到一个同框阅读框内，然后转化到植物中，提取原生质体，在扫描共聚集显微镜的激光照射下观察绿色荧光信号，从而可以精确地定位蛋白质在细胞中的位置。植物原生质体双分子荧光互补试验(简称BiFC)使得活细胞内的蛋白互作可视化[4]。这种方法被成功的应用到不同生物中的不同表达系统。BiFC的基本原理是，增强的黄色荧光蛋白(eYFP)的片段通过分别融合到其末端的连接蛋白的互作重新形成荧光复合体。蛋白复合体的荧光能清晰观察到荧光的空间定位，如果连接的2个蛋白不互作，则只会形成背景荧光[5-6]。

植物原生质体培养

植物原生质体培养

第六章：植物原生质体培养

请问同学们你知道哪些植物育种的方法？（杂交育种、诱变育种、多倍体育种、单倍体育种、基因工程育种、植物组织培养、植物体细胞杂交、动物细胞核移植等。）

自1999年11月20日中国的神舟飞船首飞获得成功后，2012年6月16日18时许中国的载人航天飞船“神舟九号”发射成功，6月29日10时许，神九载人飞船返回舱在内蒙古主着陆场安全着陆，这次发射验证了空间交会对接技术，首次实现地面向在轨飞行器进行人员和物资的往返运输与补给，我国的载人航天工程的“空间实验室”工程有望实现。2002年12月30日凌晨“神舟”四号发射升天，一起带入太空的还有一批特殊的乘客——100粒牡丹花种子。有着“牡丹城”之称的洛阳，将牡丹种子送上太空进行育种，是洛阳城“牡丹战略”的一个重要组成部分。经过太空环境的各种重粒子、强辐射等作用，相当一部分种子的性状会发生较大的变异，也许牡丹花开的会更大更鲜艳。“神舟四号”共搭载了几百种的植物种子、组织胚胎试管苗、生物菌种等。

此外，太空环境还是一个微重力环境。中科院（上海生命科学研究院植物生理生态研究所和中科院上海生物化学细胞生物学研究所）的科研人员，分别将精心培育了10年的不同品系的烟草细胞，小白鼠淋巴细胞和骨髓瘤细胞也带入太空，进行了太空细胞电融合实验（由于重力沉降现象消失，不同的细胞更容易融合，提高融合率和细胞存活力），以期获得新品种。这就是这则新闻提到的动植物细胞举行的“太空婚礼”。

自然条件下，植物间遗传物质的交换可以通过有性生殖来实现，保持物种稳定性的同时，也推动了物种的进化。但物种间存在的生殖隔离，制约了物种间的遗传信息的交换和整合，也限制了通过杂交进行的作物遗传改良。因此，人们就想方设法，从其它的途径寻找突破口。细胞融合技术为克服这一障碍提供了一条新的途径。而植物细胞是有细胞壁包裹的，实现细胞融合，首先要突破细胞壁的障碍。

6.1 原生质体的概念和研究进展

原生质体融合技术

原生质体融合技术

原生质体融合技术的局限性

植物原生质体是指用特殊方法去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生团。这种裸露细胞在适当的外界条件下，还可形成细胞壁，进行有丝分裂，形成愈伤组织和诱发再生植株，因而仍然具有细胞的全能性。

植物原生质体融合技术是借鉴于动物细胞融合的研究成果，在原生质体分离培养的基础上建立起来的，以植物的原生质体为材料，通过物理、化学等因素的诱导，使两个原生质体融合在一起以致形成融合细胞的技术。它不是雌雄孢子之间的结合，而是具有完整遗传物质的体细胞之间的融合，是2种原生质体间的杂交。通过原生质体融合可以把带有不同的基因组的两个细胞结合在一起，与有性杂交相比，无疑可以使“杂交”亲本组合的范围扩大，不但可以利用细胞核内基因资源，还可以利用包含在细胞质中的诸如叶绿体和线粒体DNA的遗传资源。

原生质体培养是细胞杂交的基础，但是直到目前为止，也只有360多个种的原生质体培养再生了完整的植株，大多数重要的植物尤其是木本植物如葡萄、棕榈、橡胶、茶、香蕉、椰子和芒果等的原生质体再生仍然很困难，或者还未进行深入研究。在原生质体再生的物种中，茄科占了将近1/4，并且用于育种目的的大多数体细胞杂种和细胞质杂种也比较集中于茄属、烟草属、苜蓿属、柑橘属、芸薹属和番茄属等6个属中。因此，为了有效地进行植物遗传改良，不但要使杂种细胞再生成完整植物，而且还必须提高植株再生的频率，以便有足够的群体进行有效的选择。但目前存在的一个普遍的问题使许多原生质体再生的程序似乎较低，重复性较差，并且还具有基因型的依赖性。为了将体细胞杂交技术应用于更多的植物中，还需要更加深入地研究植物细胞的分化、脱分化和再分化等发育机制。

1.技术局限性

植物细胞杂交的本质是将两种不同来源的原生质体，在人为的条件下进行诱导融合。由于植物细胞的全能性，因此融合之后的杂种细胞，可以再生出具有双亲性状的杂种植株。因此，细胞融合也叫原生质体融合或细胞杂交。其包括三个主要环节：诱导融合；选择融合体或杂种细胞；杂种植株的再生和鉴定。

生物技术在园林植物育种中的应用

生物技术在园林植物育种中的应用

1 生物技术在园林植物育种中的应用

园林工程建设是一项公益性、民生性工程，做好植物育种工作至关重要。新时期，传统育种技术逐渐无法满足育种工作需求。在园林植物育种中应用生物技术，能够更好地满足新时期园林植物育种及绿化需求。

一、生物技术概述

生物技术属于新型综合性技术，该技术涵盖了多项技术，包括:发酵工程技术、基因工程技术，细胞工程技术、酶工程技术等等。生物技术是在传统技术的基础之上，融合现代技术的所形成的。传统生物技术的应用，主要体现在种子选育、啤酒发酵等领域，现代生物技术的应用，主要体现在试管核酸技术、细胞生物学技术、细胞融合技术等等。和传统生物技术相比较而言，现代生物技术的优势更加明显，目前被广泛应用于各个领域当中，为人们的工作及生活带来了极大的便利，极大地促进了社会发展与进步。

二、生物技术在园林植物育种中的具体应用分析

(一)细胞工程育种技术。现代生物技术凭借自身的诸多优势，被广泛应用于各个领域当中。在园林植物育种中，生物技术发挥着至关重要的作用，被越来越多的人所关注。细胞工程

2 育种技术作为现代生物技术的重要体现，利用该技术进行园林植物育种，主要以应用原生质体培养技术、体细胞融合及杂交技术等为主。充分结合园林植物的特点，对不同植物细胞进行融合，并借助细胞分子技术来改变植物原有性质，培养新型的植物品种。在细胞工程育种技术中，原生质体培养技术的应用最为广泛。生物学理论下，植物细胞和动物细胞相比较而言，具备了细胞壁，会给不同细胞的融合造成一定的影响。然而借助原生质体培养技术，则能够将上述阻碍消除掉，融合多种不同植物的细胞，并获得新的植物种类，使得园林植物种类更加丰富。现阶段，在园林植物育种工作中，细胞工程育种技术发挥着至关重要的作用，并且取得了良好的效果。以菊花为例，是园林绿化常见植物，具备较高的观赏性，同时也具备一定的商业价值。借助细胞工程育种技术展开菊花育种，能够实现组织培养、脱毒苗和大规模繁殖，并且能够更加稳定地遗传菊花的优良特性。在菊花育种的过程中，细胞工程育种技术应用价值较高，例如:辐射诱变育种，在应用时需要注意筛选不稳定的遗传性状。不仅如此，化学诱变在园林菊花育种中也起到了重要的作用，能够通过化学诱变的方式来改变菊花的形状，包括菊花叶片颜色、菊花叶片形状等。除此之外，体细胞融合及杂交技术，也是园林植物育种的一项重要技术。例如:将菊花和大