植物基因组DNA的提取及其定性定量分析
【实验目的】
通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。
【实验原理】
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。
核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 μg/ml，ssDNA 33 μg/ml和ssRNA 40 μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。
基因组DNA提取步骤
1. 从无水乙醇中取出少许组织（约50mg）加入干净灭菌的EP管中，剪碎；
2. 加入400ul 1％的SDS，8ul（20mg/ml）的蛋白酶K，充分浸润，入55℃摇床（100转/分），期间振荡助溶至澄清（5-6h）；
3. 取出消化液，加入6mol/L的NaCl300ul，氯仿200ul，轻柔正反颠倒，使其充分乳化，4℃13000转/分离心30min；
4. 取出上清（约400ul），加入等体积氯仿抽提一次，轻柔颠倒后，4℃13000转/分离心10min；
5. 上清加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
6. 取上清加入等体积异丙醇，轻柔混匀后-20℃沉淀10min；
7. 4℃13000转/分离心15min，弃上清；
8. 用75％乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心2min），弃上清；
9. 冰冻无水乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心4min）弃上清，自然晾干或烘干，DDW溶解，30-50ul。
基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 第
26卷 第
5期 植 物 研 究
2006年
9月
Vol.26
No.5
BULLETINOFBOTANICALRESEARCHSep., 2006
基金项目
:黑龙江省博士后科研基金项目和东北林业大学科研启动基金项目资助
第一作者简介
:王军(
1966—)
,男
,博士
,教授
,主要从事植物资源研究。
3 通讯作者
收稿日期
:2005-10-08木本植物基因组
DNA提取及鉴定
王 军 杨传平3
刘桂丰
(东北林业大学林学院
,哈尔滨
150040)
摘 要 采用改良后的
CTAB法
,对山葡萄、软枣猕猴桃、蒙古栎、核桃楸、西伯利亚红松和偃松基
因组
DNA进行提取。结果表明
,所提基因组
DNA分子量与λ
DNA(
48kb)接近
,其紫外吸收比在
11
66～
11
89之间。第
3次和第
4次上清提取的
DNA质量优于第
1次和第
2次。从提取产量看
,
每克鲜重提取
DNA量最小为
15μ
g・
g-1
(核桃楸第
4次上清)
,最高的为
272μ
g・
g-1
(山葡萄第
3次上清)。西伯利亚红松和偃松第
1次和第
2次上清基本未提出
DNA,第
3次和第
4次上清中
得到了较高质量的
DNA。经酶切鉴定和
PCR扩增
,所提的基因组
DNA可以用于进一步研究。
关键词 木本植物
;基因组
DNA;提取
ExtractionofgenomicDNAfromwoodyplantsandit’
sidentification
WANGJun
YANGChuan2
Ping3
LIUGui2
Feng
(
CollegeofForestry,NortheastForestryUniversity,Harbin
150040)
Abstract
GenomicDNAwasextractedfromleavesof
Vitisamurensis,Actinidiaarguta,Quercusmon2
ANIMAL DNA的提取与纯化
抽提缓冲液：
10 mM Tris-HCl(pH8.0)
0.1 M EDTA(pH8.0)
20 ug/ml 胰RNA酶
0.5% SDS
1. 组织样品和培养细胞的裂解
（1）组织样品
① 将lg新鲜切取的组织在液氮中速冻，并用液氮预冷的研钵研磨。
② 液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有10倍体积裂解液的烧杯中，使其分散于裂解液表面，后振摇烧杯使粉末浸没。
③ 将悬液转移至50ml三角瓶中，并于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。
（2）培养细胞
①单层培养细胞
i.从孵箱中取出长满单层细胞的培养皿，迅速吸去培养液，用冰冷的TBS洗2次，加入1ml新鲜的冰冷的TBS。
ii. 用橡胶刮棒将细胞刮入1ml TBS中，用吸管将细胞悬液转移到冰上的离心管中。用0.5
ml冰冷的TBS冲洗培养皿，后并入离心管的细胞悬液。
iii.于4℃3000r/min离心10min以收集细胞。
iv. 将细胞重悬于5倍~10倍体积的冰冷TBS中并再度离心。
v. 用1 ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。
vi. 每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。
②悬浮培养的细胞
i.将细胞转移至离心管，于4℃3000r/min离心10min以收集细胞，吸去上清。
ii.用1倍体积冰冷的TBS重悬细胞并再度离心，吸去上清，小心地再次重悬细胞于冰冷的TBS中，离心收集细胞。
iii.去上清，用1ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。
iv.每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。
2.将裂解液转移至离心管中，裂解液不能超过1/3体积。
3.加入蛋白酶K（20mg/ml）至终浓度100µg/ml。用一灭菌玻璃棒温和地将酶混入细胞裂解液中。
