基因组DNA提取
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基因组DNA的提取
一、从哺乳动物组织提取基因组DNA
实验材料：
液氮、消化缓冲液、PBS（冰冷）、25:24:1酚/氯仿/异戊醇、7.5M乙酸铵、无水乙醇及70%乙醇、0.1%SDS、RNA酶、TE缓冲液（pH8.0）、离心管、研钵、冷冻离心机。
实验步骤：
1.取新鲜或冰冻动物组织块，剪成小块。置于液氮中冻结。
2.将500mg的组织用预冷的研钵和研杵研碎，或用小锤子将其捣为细粉末，每100mg组织用1.2 mL消化缓冲液悬浮。
3.将6ml样品在盖紧的离心管中于50℃摇荡下温育12～18 h。
4.用6ml酚/氯仿/异戊醇抽提样品，1700g离心10 min。如果样品溶解得不好，再加6ml不含蛋白酶K的消化缓冲液，并重复离心。如果在界面上有一层厚的白色物质，重复有机抽提，将上层(水溶液)转移至一个新管中。
5.加入6ml 7.5M乙酸铵和24ml 100%乙醇，1700g离心2 min。
6.用70%乙醇洗涤，晾干，沉淀用TE缓冲液重新溶解，使终浓度在约1mg/mL左右。
7.加入0.1%的SDS和1pg/mL无DNA酶的RNA酶，37℃温育1h,以除去残留的RNA.重复步骤 4～5。
二、从植物组织提取基因组DNA
实验材料：
液氮/干冰、2-巯基乙醇(2-ME)、 CTAB抽提液、CTAB/NaCl溶液、24:1(v/v)氯仿/异戊醇、CTAB沉淀液、高盐TE缓冲液、80%乙醇、TE缓冲液、抗有机溶剂的试管和烧杯、研钵和研杵、粉碎器/匀浆器、捣碎机、恒温金属浴、冷冻离心机。
实验步骤：
1.取1g的鲜叶组织，在3.2ml CTAB抽提液中加入0.8ml 2-巯基乙醇，使终浓度达2%(v/v)。将此溶液及1ml CTAB/NaCl溶液加热至65℃。
2.用液氮(-196℃)或干冰(一78℃)冷却粉碎器/匀浆器，将植物组织粉碎成为细粉，然后将冷冻的组织转移到一个抗有机溶剂的试管或烧杯中。
3.往粉碎的组织中加入预热的2-ME/CTAB,混合使之充分湿润，65℃温育10～60min,不时混匀：
4.用4ml的24:1氯仿/异戊醇抽提匀浆液，颠倒使充分混合，于4℃,
7500g离心5 min(对于小样品，在离心机上以10000 r/min离心),回收上(水)相。
5. 在回收的上层相中加入0.8ml 65℃ CTAB/NaCl溶液，颠倒混匀。
6.用等体积的氯仿/异戊醇抽提，混匀，离心，回收上(水)相。
7.加入等体积的CTAB沉淀液，颠倒混匀，如果沉淀可见，继续做步骤8,否则于65℃温育30 min。
8.于4℃,500g(或离心机上约2700 r/min)离心5 min。 9.移出上清，但不要丢弃，用0.5-1ml高盐的TE缓冲液重悬沉淀。如果沉淀难于重悬，于65℃温育30 min,重复直至所有的或大部分沉淀溶解。
10.加入3/5体积的异丙醇沉淀DNA，充分混匀，于4℃,7500 g,离心15 min。
11.用80%乙醇洗涤沉淀物，干燥，用0.1-0.5ml的TE缓冲液重悬。
三、从细菌中提取基因组DNA
实验材料：
TE缓冲液、10%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)、20 mg/mL蛋白酶K、
5M NaCl、 CTAB/NaCl溶液、24：1氯仿/异戊醇、25:24:1酚/氯仿/异戊醇、异丙醇、70%乙醇、离心管、冷冻离心机、冻干机。
实验步骤:
1.培养5mL的细菌培养物至稳定期，取1.5mL的培养物离心2min。
2.沉淀物加入500μL的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入50μL 10% SDS 和5μL 20 mg/mL的蛋白酶K,混匀，于37℃温育1h。
3.加入5μl 5M NaCl,充分混匀，再加入80μL CTAB/NaCl溶液，混匀，于 65℃温育10 min。
4.加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，离心4～5 min。将上清液转入一个新管中，如果难以移出上清，先用牙签除去界面物质。
5.加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，离心5 min,将上清液转入一只新管中。
对于某些细菌菌株由于氯仿抽提后形成的界面不够紧密，不容易移出上清液，这种情况下，在移出上清液之前，用无菌牙签挑出大部分的界面物质，残存的CTAB沉淀物随后在酚/氯仿抽提中被除去。
6.加入3/5体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，用1mL的70%乙醇中洗涤管内的沉淀。
相应地，沉淀可稍加离心和再用1mL 70%乙醇洗涤。
7.离心5 min,弃上清，用冻干机稍加干燥，重溶于100μL的TE缓冲液，每次酶切反应用10～15μL。
四、实验试剂的配制
1.消化缓冲液
100mmol/L NaCl
10mmol/L Tris ·HCl,pH8.0
25mmol/L EDTA,pH8.0
0.5%(w/v)SDS
0.1mg/mL蛋白酶K
蛋白酶K不稳定，应在每次临用前加入。
2.高盐TE缓冲液
10mmol/L Tris ·HCl,pH8.0
0.1mmol/L EDTA,pH8.0
1moi/L NaCl
于室温保存(可在几年内保持稳定)
3.CTAB抽提液
2%(w/v) CTAB(十六烷基三乙基溴化铵) 100mmol/L Tris ·HCl,pH8.0
20mmol/L EDTA,pH8.0
1,4mol/L NaCl
于室温保存(可在几年内保持稳定)
4.CTAB/NaCl溶液
在80mLH2O中溶解4.1g NaCl,缓慢加入10g CTAB(十六烷基三乙基漠化铵),同时加热并搅拌。如果需要，可加热至65℃溶解。定容终体积至100mL。
5.CTAB沉淀液
1%(w/v) CTAB
50mmol/L Tris ·HCl,pH8.0
10mmol/L EDTA,pH8.0
于室温保存(可在几年内保持稳定)
