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DNA的提取及电泳检测

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外周血 DNA提取

【实验原理】

真核细胞DNA分子存在于细胞核中，并与核蛋白结合而稳定存在，故而可以通过提取Buffer液破坏胞膜及核膜，释放出高分子量的基因组DNA，并用蛋白酶K将核蛋白降解成小片段从核酸上分离下来，这样便初步得到了基因组DNA，然后通过苯酚、氯仿等提取进一步去除蛋白质，再用乙醇洗涤沉淀，得到的DNA分子便可以满足一般的实验要求了。

【操作步骤】

1. 取500μl冰冻血样，加等体积1×PBS，混匀15000r/min离心4min，弃去上液重复两次。

2. 加350μl抽提Buffer，RNase1μl（10μg/ml）37℃温育30min。

3. 再加prok酶（10mg/ml）10μl，55℃消化过夜，根据消化情况可补加一次prok酶。

4. 加等体积（500ul）酚抽提，离心（15000r/min 5min），取上层液于另一支Eppedorf管中。

5. 加酚：氯仿（1∶1）(200ul:200ul)抽提，离心（15000r/min 5min）取上层液与另一支Eppedorf管中。

6. 加氯仿（等体积）(500ul)抽提，离心（15000r/min 5min）取上层与另一支Eppedorf管中。

7. 加1/5V(60ul)的乙酸铵和2V(600ul)的无水乙醇（-20℃）静置10min后，离心（15000r/min

5min），倒去上清夜。

8. 加75%乙醇(500ul)洗DNA沉淀一次，（12000r/min 1min），倒去上清夜，将离心管倒置在滤纸上，除尽残余的乙醇，

9. 加灭菌水70-80μl溶解（室温1-2h，4℃过夜）。

琼脂糖凝胶电泳

【实验原理】

核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中（PH8.0~8.3），其碱基不解离，而磷酸全部解离，核酸分子带负电荷，向正极移动，采用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，达到分离目的。此外，直接用低浓度的荧光嵌入染料溴乙锭或4S Green Plus进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置，少至1—10ng的DNA条带即可直接在紫外灯下检出。

【操作步骤】

1.选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平，检查稳压电源与负极的线路。

2.用胶纸将制槽板两端封住，形成一个胶膜，将胶膜放在工作台的水平位置上。选择孔径大小适宜的梳板。

3.配制1%的琼脂糖凝胶：准确称量1g琼脂糖凝胶，溶于100ml电泳缓冲液0.5×TBE中，加热溶解待溶液冷却至60℃，加入溴乙锭5μl（10mg/ml）至终浓度为0.5μg/ml或Green

Plus染料10-12μl，充分混匀后，将温热的琼脂糖液缓慢到入胶膜中，注意使其不产生气泡。

4.待凝胶完全凝固后，小心移去梳板和胶纸。将凝胶放入电泳槽中。

5.加入没过胶面约1mm的足量电泳缓冲液（0.5×TBE）。

6.取待测DNA样品15μl加入加样缓冲液4μl，混匀小心加样，记录样品次序与点样量。

7.盖上电泳槽并通电，采用90-120V的电压，时间为0.5~1小时即可。

8.切断电源，取出凝胶直接在紫外透射仪（溴乙锭）或蓝光切胶仪（4S Green Plus）上观察记录结果。

4S Green 是EB（溴化乙锭）的新型替代品，无毒无致癌作用。其灵敏度与EB相当，使用方法完全相同，可与单、双链DNA和RNA结合。

【实验结果】

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质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物

质粒DNA的提取与电泳鉴定_百替生物

service@ 质粒DNA的提取与电泳鉴定

质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一

种最常用的方法：

碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银

染序列分析。方法如下：

1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。

2、37℃振荡培养过夜。

3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。

4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。

7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管

8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置10min。

9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。

10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有液体。

11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中

煮沸法

1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4℃下12000ｇ离心30秒。

2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。

3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。

4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。

5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。

6、用微量离心机4℃下12000g离心10分钟。

7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。

8、取20ml进行电泳检查。

质粒DNA的大量提取和纯化

在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA,为此需要大量提取质粒

质粒DNA的提取及电泳检测

质粒DNA的提取及电泳检测

实验 质粒DNA的提取及电泳检测

一 实验目的

通过本实验学习掌握碱裂解法提取细菌质粒DNA。

二 实验原理

1. 细菌中有两种DNA，即染色体DNA和质粒DNA。

2. 质粒DNA的提取方法有三种：碱裂解法，煮沸法，去污剂（如Triton和SDS）裂解法。

3. 碱裂解法比较剧烈，可破坏碱基配对，使宿主细胞DNA变性，共价闭合环状DNA由于空间缠绕，两条链不会彻底分开。当外界条件到达复性条件时，质粒DNA的双链又迅速恢复原状，而较大的线性染色体DNA难以复性。

三 实验材料：转化后的细菌(含有质粒的大肠杆菌)

四、实验用具和药品

1. 实验用具:

摇床，离心机，移液器及枪头，玻璃试管（15mL）及塞子，离心管（）

2. 实验试剂：

（1）溶液I

50 mmol/L 葡萄糖

25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl（）

10 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）（）

（2）溶液II

L NaOH，2%SDS，用前等体积混合

（3）溶液III 5 mol/L 乙酸钾 60ml

冰乙酸

水

（4）TE 缓冲液

10 mmol/L Tris·HCl（）

1 mmol/L EDTA（）

（5）70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

（6）加样缓冲液（6X）：40%蔗糖、%溴酚兰

（7）电泳缓冲液：L Tris-硼酸 L EDTA （ TBE buffer） 电泳缓冲液贮存液：5X：54g Tris碱、硼酸、20ml L EDTA（）

五 实验步骤

（一）细菌繁殖

挑取白色的单菌落若干，转移到3mL液体LB培养基(附加100mg/ml

质粒dna提取及电泳检测实验报告

质粒dna提取及电泳检测实验报告

质粒dna提取及电泳检测实验报告

质粒DNA提取及电泳检测实验报告

引言

质粒DNA提取及电泳检测是生物学实验中常用的技术手段，用于分离和检测质粒DNA样本中的目标序列。本实验旨在通过提取质粒DNA并进行电泳检测，验证提取的质粒DNA的纯度和完整性。

材料与方法

1. 材料：

- 质粒DNA样本

- 细菌培养液

- 细菌裂解液

- 氯仿

- 异丙醇

- TE缓冲液

- 琼脂糖

- TAE缓冲液

- DNA分子量标记物

2. 方法：

1. 质粒DNA提取：

a. 将细菌培养液中含有质粒DNA的细菌进行离心，收集细菌沉淀。

b. 加入适量的细菌裂解液，裂解细菌细胞，释放质粒DNA。

c. 加入氯仿，离心分离上清液和有机相。

d. 收集上清液，加入异丙醇，使DNA沉淀。

e. 用TE缓冲液溶解DNA，得到质粒DNA提取物。

2. 质粒DNA电泳检测：

a. 准备琼脂糖凝胶，加入TAE缓冲液，制备电泳槽。

b. 加载质粒DNA提取物和DNA分子量标记物于琼脂糖凝胶孔中。

c. 连接电源，进行电泳分离。

d. 观察电泳结果，记录质粒DNA的迁移情况和分子量。

结果与讨论

通过质粒DNA提取及电泳检测实验，我们成功地提取到质粒DNA，并进行了电泳分离和检测。在电泳结果中，我们观察到质粒DNA片段在凝胶中呈现出带状分布，且迁移距离与分子量呈正相关关系。

根据电泳结果，我们可以初步判断质粒DNA的纯度和完整性。如果质粒DNA在电泳过程中呈现单一的清晰带状分布，且没有明显的附加杂带，说明质粒DNA的纯度较高，没有明显的污染物。而如果质粒DNA呈现模糊或多条不清晰的带状分布，可能存在其他DNA片段或杂质的污染。

通过电泳结果中质粒DNA片段的迁移距离，我们可以估算出质粒DNA的大致分子量。通过与DNA分子量标记物的比对，我们可以初步判断质粒DNA的大小和可能的构造。这对于进一步的研究和应用具有重要意义。

质粒dna的提取及电泳检测实验报告

质粒dna的提取及电泳检测实验报告

质粒dna的提取及电泳检测实验报告

一、实验目的

本实验的主要目的是学习质粒DNA的提取方法和电泳检测技术，并通过实验观察质粒DNA的提取情况和电泳检测结果。

二、实验原理

质粒DNA的提取方法主要采用碱裂解法，通过将细胞裂解后，用酸性物质中和碱性物质，使DNA分离出来，最后用酒精沉淀纯化。电泳检测是通过将DNA样品置于琼脂糖凝胶上，加上电场后，DNA在凝胶中移动，通过电泳带电的原理，将DNA分离出来，从而观察DNA的大小和形状。

三、实验步骤

1.准备样品：将含有目标DNA的菌落挑出放入EP管中，加入100μl TE缓冲液（10mmol/L Tris-HCl,1.0mmol/L EDTA,pH8.0），用微量移液器均匀混合。

2.制备裂解液：取10μl 0.25mol/L NaOH加入菌液中，轻轻摇匀，并立即加入200μl 1%SDS（十二烷基硫酸钠）液，翻转混匀。

3.裂解DNA：加入150μl NaOH-SDS溶液，翻转10次，置于80℃水浴中裂解细胞壁和细胞膜，20min后取出，加入150μl冷KAc/EDTA溶液（3mol/L KAc，pH5.2，0.5mol/L EDTA），翻转混匀，冰上静置5min。

4.离心沉淀：10000r/min离心10min，将上清液移至新的96孔板中，加入0.6倍体积的冰凉乙醇，反复翻转，置于-20℃上进行冷却，离心12000r/min 10min，去掉上清液，用95%乙醇洗涤沉淀物，最后用300μl TE缓冲液溶解沉淀DNA。

5.电泳检测：取相同浓度的DNA样品，加入琼脂糖，混合后加入电泳槽中，通电检测10min。

四、实验结果

经过实验操作后，取出DNA样品，通过电泳检测，观察到有一条长度合适的条带，证明质粒DNA已经成功提取，并且检测结果与对照组差异不大，说明实验操作规范，结果可信。

五、实验结论

本次实验通过碱裂解法成功提取了质粒DNA，并通过电泳检测技术检测到了DNA条带，证明提取质粒DNA的方法可行，同时也说明电泳检测是一种可靠的分子生物学技术，对于DNA分离和检测有着重要的应用价值。