无细胞百日咳菌苗发酵罐培养

微生物培养实验方法_一、选材和操作环境1.选材：根据实验目的，选择适当的微生物进行培养。

可以选择广谱微生物培养基来适应多种微生物的生长，或者选用特定的微生物培养基来培养其中一种特定的微生物。

2.操作环境：为了避免实验污染和交叉感染，实验室应该严格执行无菌操作，使用无菌操作台进行培养实验。

二、无菌技术1.灭菌：使用高压蒸汽灭菌器或者乙醇灭菌器将培养器具、培养基和植物培养基灭菌，以杀灭存在的菌种。

2.无菌操作：将培养器具放在无菌操作台上，进行接种、移植以及采样等操作，确保操作过程中不受外界菌种污染。

三、液体培养实验1.静态培养：在无菌培养基中接种微生物，放入试管或培养瓶中，静置培养。

根据需求，可以在静态培养过程中添加适量的养分补充剂。

2.摇床培养：将含有微生物的培养基放在摇床上进行培养，设置合适的温度和摇动速度，可以促进微生物的生长和代谢。

3.发酵罐培养：将含有微生物的培养基放入发酵罐中进行大规模培养。

控制发酵罐内的温度、pH值、氧气供应等条件，可以实现微生物的高密度培养。

四、固体培养实验1.平板培养：将含有微生物的培养基倒入培养皿中，使其均匀分布在培养皿表面，待其凝固后，将微生物接种于其上。

培养过程中可以观察到微生物的孤悬、菌落的形成和生长情况。

2.涂布法：将含有微生物的培养基均匀涂布在玻璃片、培养皿或者培养瓶内壁上，形成薄膜状，待其凝固后，进行微生物的接种。

3.动植物体内培养：将微生物接种在动植物的体内，如动物的腹腔、皮肤或者植物的叶片、根系等，利用动植体提供的养分来满足微生物的生长需求。

五、检测微生物生长和代谢特性1.可视方法：通过观察培养基上微生物的生长情况、菌落的形态和颜色等，判断微生物的生长情况。

2.双抗法：使用特定的抗体和染料来染色微生物，使其表现出不同的颜色或者形态，以便于鉴别和分析微生物。

3.生化检测方法：通过检测微生物在培养基上产生的特定代谢产物，如酶活性、气体产生等，来评估微生物的生长情况和代谢特性。

发酵罐接种和取样的实验操作流程-回复【发酵罐接种和取样的实验操作流程】在微生物发酵工程中，接种与取样是两个至关重要的环节，它们直接影响到发酵过程的效率、产物质量以及对发酵过程的控制。

以下将详细阐述发酵罐接种和取样的实验操作流程，确保实验的精确性和安全性。

一、发酵罐接种操作流程1. 前期准备：- 菌种活化：首先，需从冷冻保藏库中取出待接种的菌株，在适宜的培养基上进行复苏及活化，确认菌种活性良好。

- 设备消毒：彻底清洗并灭菌发酵罐及相关管道、接种枪等器材，确保无菌环境，防止杂菌污染。

2. 菌液制备：- 扩大培养：将活化的菌种接种于小规模液体培养基中进行扩大培养，至对数生长期或稳定期，保证菌体数量足够且活力旺盛。

- 浓度调整：通过离心浓缩或稀释等方式，将菌液浓度调整至适合接种的浓度，一般根据发酵工艺要求设定。

3. 接种操作：- 连接系统：确保发酵罐与无菌空气过滤系统、冷却水循环系统等正常连接，并开启搅拌装置预热发酵罐内环境至合适温度。

- 无菌接种：在严格的无菌条件下，使用无菌接种枪或设备将菌液注入已灭菌的发酵罐中，操作过程中尽量避免接触非无菌部位。

- 启动发酵：接种完毕后，立即开始调控发酵参数（如温度、pH值、溶解氧、搅拌速度等），正式进入发酵阶段。

二、发酵罐取样操作流程1. 取样前准备：- 工具消毒：取样瓶、移液器、试管等所有接触样品的器具均需经过高温高压灭菌处理，确保无菌状态。

- 确定取样时间点：按照实验方案或发酵进程设计，选择合适的取样时间点，以便观察和分析发酵过程中的生理变化和代谢产物积累情况。

2. 取样操作：- 停止搅拌：为防止取样瞬间造成菌体分布不均，通常在取样前短暂停止搅拌，但具体是否停止应视发酵工艺特点而定。

- 无菌取样：迅速打开取样口，用预先准备好的无菌取样瓶或管插入发酵液中抽取一定体积的样品，整个过程应在无菌罩下进行。

- 样品转移：立即将取样瓶内的样品分装至其他无菌容器中，用于后续的生化指标检测、细胞计数或其他分析实验。

培养菌种的方法有几种培养菌种是微生物学研究中的基础技术之一，它是指将微生物在适宜的环境中得以生长和繁殖，以便进行相关的研究和应用。

根据不同的目的和需求，培养菌种的方法可以分为多种不同的类型。

下面将详细介绍一些常见的培养菌种的方法。

一、液体培养菌种的方法液体培养是利用液体培养基来培养微生物。

液体培养常用于大规模的菌种生产和实验室试验，它具有操作简便、易于扩展培养规模的优点。

液体培养可以分为摇瓶培养和搅拌罐培养两种。

1. 摇瓶培养摇瓶培养是将菌种接种到含有适宜营养物的培养基中的密封瓶内，通过摇动瓶子来提供充足的氧气和养分供给，促进微生物的生长繁殖。

在实验室中，常用的摇瓶培养器有搅拌培养器、震荡器等。

摇瓶培养可以适用于各类微生物的培养。

2. 搅拌罐培养搅拌罐培养是将液体培养基和菌种接种到搅拌罐中，通过搅拌罐内的搅拌装置来提供充足的氧气和均匀的营养物供给，促进微生物的生长和繁殖。

搅拌罐培养主要适用于培养需要大量氧气的菌种和生产过程中的大规模培养。

二、固体培养菌种的方法固体培养是指将微生物接种到固体培养基上，通过固体培养基提供的营养物来支持菌种的生长。

固体培养可以分为平板培养和斜面培养两种。

1. 平板培养平板培养是将液体培养基倒入培养皿中，使其凝固成为固体培养基，然后将菌液等接种于培养基表面，使菌落在培养基上生长。

平板培养常用于鉴定微生物种类和菌群分析。

2. 斜面培养斜面培养是将液体培养基倒入试管中，然后将试管斜放，在培养基凝固之前稍微晃动试管一下，使培养基凝固成为一层斜面上，然后将菌液等接种于斜面上，使菌落在斜面上生长。

斜面培养常用于长期保存和分离纯培养菌种。

三、溶液培养菌种的方法溶液培养是将微生物接种到液体溶液中，通过溶液中的养分物质来支持微生物的生长和繁殖。

溶液培养常用于病毒和酵母菌等微生物的培养。

1. 细胞培养细胞培养是通过将细胞接种到含有适宜营养物的液体培养基中，提供合适的生长条件来培养和繁殖细胞。

如何利用高效摇瓶进行食用菌液体菌种的
培养？
液体菌种的培养方式主要有振荡培养和发酵罐培养两类。

振荡培养又称为高效摇瓶培养，是利用机械振荡，使培养液振动而达到通气的目的，是将斜面试管菌种接种到培养液中，置摇床上振荡培养。

高效摇瓶培养的工艺流程为：制备培养基一分装一灭菌一冷却一接种一摇床培养一一级液体菌种一二级液体菌种。

经高效摇瓶培养的菌丝体一般呈球状、絮状等多种形态，培养液呈黏稠状或清液状，有或无清香味及其他异味。

菌液中因有菌体发酵产生的次生代谢产物，可呈不同的颜色。

采用高效摇瓶培养液体菌种时，可采用往复式摇床或者旋转式摇床。

往复式摇床的往复频率一般在80～140r/min，冲程一般为5～14cm，在频率过快、冲程过大或瓶内液体过多时，振荡使液体容易溅到瓶口纱布上而造成污染。

旋转式摇床的偏心距一般为3～6cm，旋转次数为60～300r/min，它的结构比较复杂，加工安装要求比往复式摇床高，造价也较贵，但是氧的传递好、功率消耗低，培养基一般不会溅到棉塞上。

因此，要根据实际需要选择合适的摇床及振荡速度。

以上是利用高效摇瓶进行食用菌液体菌种培养的要点，高效摇瓶除了用于食用菌液体菌种的培养外，还可用于全时悬浮细胞培养，培养基制备或储存。

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百日咳菌苗原液制造及检定要求本品系用百日咳第Ⅰ相菌种经培育后取菌体制成悬液，加适当杀菌剂，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释制成，每ml含菌45亿～90亿。

用于制备百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂。

1 菌种1.1 制造百日咳菌苗之菌种、检定用的Ⅰ相诊断血清、百日咳分型血清及百日咳参考菌苗，由中国药品生物制品检定所分发或经同意。

1.2 菌种检定1.2.1 培养特性于包-姜（Bordet-Gengou）氏或其他适宜的培养基上培育，各菌株应具有典型的形态及生化特性。

1.2.2 血清学特性将35～37℃培育40～48小时的菌苔，混悬于生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水内，使每ml含菌20亿个，与Ⅰ相血清做定量凝集反应，凝集效价应达到血清原效价之半。

同时与单价分型血清做定量凝集反应，其型别应与该菌种标定型别相同。

1.2.3皮肤坏死试验用健康家兔或豚鼠至少2只，用培育40～48小时的菌苔混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内，然后稀释为几个不同浓度的菌液，分别用每一稀释度的菌液注射于家兔或豚鼠的皮内0.1ml，经72小时观察反应。

如2只家兔或豚鼠中有1只注射0.4亿个菌以下的菌液部位出现出血性坏死者为阳性反应，判为合格。

1.2.4 毒力试验用体重16～18g之小白鼠至少3组，每组至少10只，在麻醉状态下从鼻腔滴入经培育40～48小时，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释的菌液0.05ml观察14天，记录小白鼠生死情况，按Reed Muench法计算LD50，LD50菌数不超过1.2亿判为合格。

1.2.5 免疫力试验1.2.5.1 方法按附录2《百日咳菌苗原液免疫力试验方法》进行。

1.2.5.2判定试验菌液每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IU。

若试验菌液的效价低于此要求时，可复试，其结果的几何平均值（如用概率分析法时，应用加权几何平均值）≥4.0IU，仍判为合格。

1.3 菌种保存1.3.1 菌种应用冻干法保存。

1.3.2 冻干菌种应保存在2～8℃。

一．机构与人员[检查要点]药品生产和质量管理的组织机构对做好药品生产全过程监控至关重要；适当的组织机构及人员配备是保证药品质量的关键因素；人员的职责必需以文件形式明确规定；培训是实施药品GMP工作中的重要环节。

0402 生物制品生产企业生产和质量管理负责人是否具有相应得专业知识（细菌学、病毒学、生物学、分子生物学、生物化学、免疫学、医学、药学等），并具有丰富的实践经验以确保在其生产、质量管理中履行其职责。

1．主管生物制品生产企业的生产和质量管理的企业负责人应具备医药及生物学等方面的专业知识和实践经验才能确保其在生产、质量管理中履行职责。

生物制品是药品的一大类别。

生物制品是应用普通的或以基因工程（GeneticEngineering）、细胞工程（CellEngineering）、蛋白质工程（ProteinEngineering）、发酵工程（FermentationEngineering）等生物技术获得的微生物（细菌、噬菌体、立克次体、病毒、寄生虫等）、细胞及各种动物和人源的组织和体液等生物材料制备，其制备过程是生物学过程和无菌操作过程，并用于预防、治疗、诊断疾病的药品。

我国目前生产和使用的生物制品有200多种，各生物制品生产企业所生产的品种各不相同，基于生物制品起始原辅材料、生产制备过程及质量控制等的固有特性，细菌类或病毒类疫苗（包括毒素、类菌素、抗毒素及抗血清等）生产企业的生产和质量管理负责人应具备细菌学或病毒学、生物化学、分子生物学、免疫学、流行病学等方面的专业知识；细胞因子及其他活性生物制剂生产企业，应具备生物化学、免疫学、分子生物等方面的专业知识；DNA产品生产企业，应具备现代生物技术、分子生物学、遗传学、免疫学等方面的专业知识；体内及体外诊断试剂生产企业应具备生物学、免疫学、生物化学等方面的专业知识；血液制品生产企业，应具备生物化学、分析生物学、病毒学等方面的专业知识。

2．本项规定应具备的相应专业知识，也不可机械地局限到一个人所学的具体专业学科。

白僵菌生产中发酵罐培养技术研究戈媛媛;赵东容;沈伟清;张建华【摘要】In order to master the technology of fermentation culture of Beauveria bassiana ,and put the culture of ex‐panding Beauveria bassiana into industrial production ,we used Beauveria bassiana strain of Yiling district ,Yichang as the material and fermentation technical parameters such as the appropriate liquid fermentation medium and the growth mor‐phology of strain and pH values of growth environment were studied by liquid fermentation tank culture which could help identify the time of transferring liquid from seed tank to fermentation tank .The results showed that Carbon ,Nitrogen and Phosphorus were three kinds of necessary nutrient elements in the liquid fermentation .Besides ,these three essential factors for the growth of Beauveria bassiana had different proportion ,the addition of a small amount of microelement in the liquid fermentation medium at the early stage could increase growth rate and the number of Beauveria bassiana evi‐dently;Beauveria bassiana has the cyclic growth history that is mutual transformation between saprophyte and mycelium in its multistage continuous liquid fermentation ,and the comparative analysis of spore form and the numbers showed that the fastest growth appeared in the pH value between 4 and 5 which the growth environment of Beauveria bassiana owned by self‐regulation and artificial adjustment ,although we had given condition that the medium was a pH of 6 initially;Considering the growth morphology and thenumber and the activity of Beauveria bassiana and the workshop operation schedule ,we made the following arrangements ,and the first process was producing mycelium in the seed tank for 42~45 hours ,and the second one was producing saprophyte which was the strain of solid fermentationpr oduction in the fermen‐tation tank for 21 to 26 hours .%为掌握白僵菌发酵罐培养技术，白僵菌可工业化生产，以宜昌夷陵区白僵菌菌种为材料，对白僵菌液体发酵罐发酵培养的培养基、菌种生长形态、生长环境的pH值进行试验研究，从而确定转罐时间等液体发酵罐发酵技术参数。