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流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。
Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。
Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、 IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。
由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。
目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。
因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。
目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。
流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。
我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。
由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。
目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。
淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。
由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。
抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。
Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T淋巴细胞。
因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。
材料与方法试剂PMA（Sigma）贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃保存。
工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1µg/ml。
流式细胞术中细胞培养和刺激的基本方法流式细胞术中细胞培养和刺激的基本方法作者：发布日期：(2009-07-21) 浏览次数：0次细胞活化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。
下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。
表1、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法需要使用蛋白转运抑制剂 (如3uM monensin，10mg/ml的BFA)。
方法1: 只使用转染细胞检测。
方法2: 人的PBMCs使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM) 刺激4-24 小时。
方法3: 人的PBMC 使用LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激24 小时。
方法4: 人的PBMCs或者纯化的CD4＋细胞在包被人CD3抗体的培养板中，使用含有10 ng/ml重组人的IL-2（peprotech，目录号200-02）和10 ng/ml 的IL-4（peprotech，目录号200-04）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人IL-2和IL-4的培养基中继续培养2天；最后收获细胞，使用PMA (10 ng/ml) 和Ionomycin (1 uM)刺激6小时。
方法5: CD4+ T 细胞使用PHA (10 ng/ml) 刺激4 天。
方法6: T 细胞使用抗CD3 的单抗、抗CD28的单抗和重组人的IL-1 (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)。
方法7: 使用PMA (50 ng/ml) 和Ionomycin (500 ng/ml)刺激。
方法8: PBMCs细胞使用10 ng/ml重组人IFN-γ(peprotech，目录号300-02) 刺激2 小时，然后使用IFN-γ(10 ng/ml) + LPS (1 ug/ml) 刺激22小时或者使用相同的方法刺激THP-1 细胞。
流式细胞术检验白血病的基本原理与流程Flow cytometry is a technique used to analyze the physical and chemical characteristics of particles in a fluid as it passes through at least one laser. 流式细胞术是一种用于分析液体中颗粒的物理和化学特征的技术，它通过至少一个激光来实现。
This technique is commonly used in the diagnosis of various medical conditions, including leukemia. 这种技术通常用于诊断多种疾病，包括白血病。
Flow cytometry is based on the principle that cells, when suspended in a fluid and passed through the path of a laser beam, scatter light in patterns that correlate with specific properties of the cells. 流式细胞术的基本原理是，当细胞悬浮在液体中，并通过激光束路径时，它们以与特定细胞特性相关的方式散射光线。
This allows for the identification and analysis of different types of cells, including cancerous cells. 这使得可以鉴定和分析不同类型的细胞，包括癌细胞。
In the context of leukemia, flow cytometry plays a crucial role in the diagnosis and classification of the disease. 在白血病的背景下，流式细胞术对于该疾病的诊断和分类起着至关重要的作用。
糖皮质激素受体α，GR-αELISA试剂盒技术原理96T/48T大鼠糖皮质激素受体α，GR-αELISA试剂盒技术原理英文名称：Ratglucocorticoidreceptor-α,GR-αELISAkit产品货号：fk-D1831规格：96T/48T保存：2-8℃保质期：6个月，所有试剂盒均提供最新批次。
试剂盒成分：酶标板，试剂，标准品等试剂盒成分：酶标板，试剂，标准品等本试剂仅供研究使用标本：全血试验原理：HLA- B27试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验，ELISA.已知HLA-B27浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行。
大鼠糖皮质激素受体α，GR-αELISA 试剂盒技术原理先将HLA- B27和生物素标记的抗体同时温育。
洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。
再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。
产生颜色。
颜色的深浅和样品中HLA-B27的浓度呈比例关系。
大鼠糖皮质激素受体α，GR-αELISA试剂盒技术原理Elisa试剂盒实验规则：1、要保证移液枪的准确性，误差不能超过2%。
可用水和电子天平进行确定。
但最好有专业人员进行矫正。
2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。
吸取不同的液体后，要更换枪头。
即使是吸取标准品时。
3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。
4、实验时，要使底物避光保存。
5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。
6、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。
7、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会自然流下去。
8、液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。
也可以用酶标仪的晃动功能。
9、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。
10、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。
流式细胞仪实验方法一、实验准备1．标本制备：2．最小化非特异性结合：二、凋亡1．凋亡的检测方法：和其它2．PI染色法3．Annexin V 法4．TUNNEL法三、细胞因子1．激活的细胞因子2．CBA四、血小板1．活化2．活化检测3．网织血小板五、红细胞1．网织红细胞2．PNH3．胎儿红细胞六、肿瘤学1．DNA 细胞周期2．蛋白3．多药耐药4．微小残留白血病第一部分标本处理一、流式细胞术常规检测时的样品制备(一)直接免疫荧光标记法取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。
孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。
本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。
虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。
(二)间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。
但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。
所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。
另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。
二、最小化非特异性结合的方法1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。
2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。
2022-2023年河北省唐山市全科医学（中级）专业知识预测试题(含答案) 学校:________ 班级:________ 姓名:________ 考号:________一、单选题(20题)1.丙型肝炎A.潜伏期平均为4周B.潜伏期平均为50天C.潜伏期平均为6周D.潜伏期平均为70天E.潜伏期平均为100天2.《生活饮用水卫生监督管理办法》是由A.国务院颁布B.卫生部和建设部颁布C.卫生部和国家环保总局颁布D.卫生部和质检总局颁布E.卫生部颁布3.免疫病理检查几乎所有SLE患者均可出现病变的脏器是A.心脏B.肾C.肺D.肝E.胰腺4.某黄疸患者，尿胆原试验阳性，尿胆红素试验阴性，酸溶血试验阳性，应考虑为A.自身免疫性溶血性贫血B.慢性活动性肝炎C.阵发性睡眠性血红蛋白尿D.急性黄疸型肝炎E.海洋性贫血5.骨折的治疗最正确的原则是A.骨与软组织井重复位B.一般要求解剖复位C.坚持固定与活动相结合D.复位、固定和功能锻炼E.局部与全身治疗兼顾6.诊断震颤麻痹最重要的依据是A.确切的病史及体征B.脑脊液检查C.头部CTD.头部MRIE.脑电地形图7.引起心悸的病理性因素是A.应用阿托品B.精神过度紧张C.饮酒和喝咖啡、浓茶后D.甲状腺功能亢进E.剧烈运动后8.男性，38岁，发热38～39.5℃，疲倦、盗汗伴咳嗽、少量痰半个月。
既往体健。
肺部体检：右上实变体征伴两下肺散在湿性啰音最合适的首选检查是A.A.血常规B.胸部CTC.血培养D.胸部X线摄片E.痰涂片革兰染色9.慢性贫血发生心力衰竭时属于哪项机制A.心肌缺血、心肌梗死B.心肌疾病C.心胍代谢障碍D.心脏后负荷过重E.心脏前负荷过重10.腹外疝最重要的发病原因是（）。
A.慢性咳嗽B.长期便秘C.排尿困难D.腹壁有薄弱点或腹部缺损E.经常从事导致腹腔内压增高的工作11.女性，60岁，外伤1天，左下肢短缩，足外旋的50°左髋部压痛无肿胀。
最可能的诊断为（）A.左髋臼骨折B.左股骨头骨折C.左股骨颈骨折D.左股骨转子间骨折E.左股骨干骨折12.对肾综合征出血热来说，错误的是哪项A.是自然疫源性传染病B.鼠类是主要传染源C.病原学是病毒D.高血容量综合征多发生于少尿期E.传播途径仅为呼吸道传播13.患者有轻度的性格改变和行为异常为A.肝性脑病前驱期B.肝性脑病昏迷前期C.肝性脑病昏睡期D.肝性脑病昏迷期E.亚临床肝性脑病14.关于COPD的全身表现下列哪项不常见A.可导致机体低氧血症B.可导致患者营养不良、消瘦、肌肉萎缩C.可导致患者冠心病D.酉导致患者焦虑E.可导致患者Ⅱ型呼吸衰竭15.慢性肾功能衰竭当血肌酐(Scr)浓度和内生肌酐清除率(Ccr)为提示肾功能不全失代偿期的是A.A.Scr＜176μmol/L，Ccr50～80ml/minB.Scr88～132μmol/L，Ccr80～100ml/minC.Scr＞707μmol/L，Ccr＜10ml/minD.Scr450～707μmol/L，Ccr10～25ml/minE.Scr177～442μmol/L，Ccr20～50ml/min16.某患者因房颤5年服用地戈辛0.25mg/ d，近1周喘息加重伴双下肢水肿，改用地戈辛0.25mg、速尿20mg，每日2次。
流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。
GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。
以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。
用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、离心弃上清液。
5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。
离心，弃上清。
4、 PBS 1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
流式测actin操作方法
流式测actin操作方法涉及以下步骤：
1. 细胞的制备：首先，细胞需要经过适当的处理来保持其形状和完整性。
这包括使用缓冲液洗涤和悬浮细胞，将细胞固定以保持其结构，并使用渗透剂使细胞透明。
2. 标记actin：现在，将使用荧光标记将actin可视化。
这通常涉及使用荧光标记的抗体来识别actin，并通过与这些抗体结合的二抗来传递荧光信号。
3. 流式细胞术：准备好的细胞悬液将通过流式细胞仪进行分析。
这涉及将细胞单个传送到流式细胞仪中的流体流中。
流体流使细胞一个接一个通过检测器通过。
4. 激光束照射：通过使用激光束与细胞交互，可以激发荧光标记的actin并产生荧光信号。
具体要求仪器配置和激光设置以获取最佳结果。
5. 数据采集和分析：由于流式细胞仪能够快速记录细胞中荧光信号的数量和强度，因此能够收集大量数据。
这些数据可以用于进一步的分析和解释actin的动态行为。
需要注意的是，流式测actin的具体操作方法可能因流式细胞仪型号和实验目的的不同而有所不同。
因此，在进行实验之前，建议参考相关的仪器操作手册和文
献以获取详细的操作步骤和建议。
