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分子病理学技术进展及临床应用课件

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分子病理学课件

分子病理学课件

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主要组织学实验室
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冰冻切片实验室
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乳腺癌标本巨检
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病理和血液病理科
• 专项检查实验室
• 免疫细胞化学 • 细胞学 FISH (HER-2, UroVysion) • 图象分析 • 细胞遗传学 (FISH) • 分子病理诊断 • 流式细胞计数
DNA和RNA：PCR、Real－time PCR、 RT-PCR、ISH、DNA测序、 DNA微阵列
蛋白质： 蛋白组学、组织阵列、 免疫组化、流式细胞检查
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B. 分子诊断应用于疾病的全过程
疾病阶段
检查目的
危险度预测
高危家族及一般人群中
疾病相关基因突变的携
带者
早期疾病诊断
症前诊断
疾病分期分级
分子病理学
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1
绪论
第一节 病理学与分子病理学 的概念和性质
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2
一、病理学的概念和性质 • ①研究疾病的原因(病因学)
• ②探索疾病的发生机制
• ③描述疾病发生发展过程中可见 的形态学变化
• ④揭示各种疾病所引起的功能异 常
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器官病理学 细胞病理学 超微病理学 分子病理学
• 高温修复 • 修复液 • 酸碱度
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分子病理学常用研究技术原理及应用108页PPT

分子病理学常用研究技术原理及应用108页PPT
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
ห้องสมุดไป่ตู้
分子病理学常用研究技术原理及应用
61、辍学如磨刀之石，不见其损，日 有所亏 。 62、奇文共欣赞，疑义相与析。
63、暧暧远人村，依依墟里烟，狗吠 深巷中 ，鸡鸣 桑树颠 。 64、一生复能几，倏如流电惊。 65、少无适俗韵，性本爱丘山。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈

分子病理学常用研究方法 ppt课件

分子病理学常用研究方法 ppt课件

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随机引物法
5’ 3’ 5’ 3’
5’
3’
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3’
3’
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5’
3’ 分子病理学常用研究方法 ppt课件
3’
5’
3’ 5’
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1.于Eppendorf离心管中依次加入
15μl ddH2O
1μg DNA(10ng-3μg)
100℃ 10'(变性)
干冰聚冷30秒钟
2.加入10×六核苷酸混合物
3’
3’
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分子病理学常用研究方法 ppt课件
5’
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随机引物法：单/双链线状DNA标记，100-500bp亦可 DNA用量少(可少至10ng) 标记率高(1/20-25)
原理：以任意顺序的六核苷酸片段为引物与单链DNA 模板结合后，在DNA 聚合酶 I 的Klenow片段 (无5'-3'外切酶活性) 作用下合成带标记核苷酸 的互补DNA链(探针)
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标记方法
引入法：运用标记好的核苷酸合成探针 缺口翻译法 随机引物法 末端标记法 PCR扩增标记法 RNA体外合成法
化学修饰法：化学修饰已合成的探针
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缺口翻译/平移法：双链DNA标记，线环状均可 分子较大(>1KB)者效果好 DNA用量较多(>200ng) 标记率低
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2.探针的标记 标记物：同位素, 非同位素, 修饰物
同位素：敏感，定位较差，实验室要求高 探针使用周期短

分子病理学-课件

分子病理学-课件
关键措施 1.优化操作流程 2.优选放大系统
(2) 体外酶促核酸扩增技术演进
凝胶电泳 ELISA样实验 (酶联免疫吸附) FRET方法 (荧光共振能量交换)
Real-time PCR Assay
TaqMan Adjacent Probes Scorpion Molecular beacon
一管操作 定量功能
其次，致病基因和相关基因被大量发现，并将逐步 阐明其在疾病发病学中的意义
第三，肿瘤基因诊断和基因治疗将取得突破性进展
第四，人类基因组计划实施过程中创造发明的新技 术和新方法将在病理学中广泛应用，并导致出现更 加迅猛的知识增长趋势
天每
开个
放孩
；子
有的
的花
孩期
子不
是一
菊样
花，
，有
选的
择孩
在子
秋是
B. 分子诊断应用于疾病的全过程
疾病阶段 危险度预测
早期疾病诊断 疾病分期分级
疾病随诊及监督治疗
检查目的 高危家族及一般人群中 疾病相关基因突变的携
带者 症前诊断 预后、预测因素、协助
诊断及治疗 观察个体中治疗的反应并及
时调整
C.近年来的重大技术进步
(1)原位杂交：在保证高特异性的基础上提 高敏感性天牡Biblioteka 开丹放花；，
而选
有择
的在
孩春
➢ He who falls today may rise tomorrow.
子天
是开
梅放
花；
，有
选的
择孩
在子
冬是
天荷
开花
放，
选
择
在
夏
我们，还在路上……
分子病理学

分子生物学技术在病理学中的应用 ppt课件

分子生物学技术在病理学中的应用 ppt课件
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寡核苷酸探针
• 近年应用较多的寡核苷酸探针，常为2030个碱基，分子量小，有利于探针进入 细胞内，无须采取提高细胞通透性的措施。 • 非克隆性DNA探针，在无cDNA的情况下， 可根据已知文献发表的共同序列由DNA 合成仪依照所需杂交的靶核苷酸序列人工 合成。
• 包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的 漂洗。 • RNA探针杂交时产生的背景染色特别高， 但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染 色，获得较好的反差效果。在杂交后漂洗 中的RNA酶液洗涤能将组织切片中非碱基 配对RNA除去。 • 一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到 低而温度由低到高。 • 切勿使切片干燥。干燥的切片即使大量的 溶液漂洗也很难减少非特异性结合，从而 增强了背景染色。 26 ppt课件
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CISH
• 显色原位杂交法（Chromogenic in situ
hybridization，CISH）
• 2000年Tanner首次报道了采用CISH 法检测HER2基因扩增的可行性,研究显 示CISH与FISH具有极强的一致性。 • 高度特异性的地高辛标记探针进行原 位杂交，传统的过氧化物酶显色反应 染片过程，在普通光学显微镜下定量 检测基因的扩增，操作简单，价格远 较FISH低廉，且信号稳定，组织切片 储藏方便，并可做组织学评价。 31 ppt课件
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寡核苷酸探针
• 制造方便，价格低廉，也可进行放 射性与非放射性标记
• 特异性不如克隆性探针强，亦不如 其杂交信号高
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成套ISH试剂盒
• 病毒系列(EBV、HBV、HCV、HPV 等) • 癌基因系列（bcl-2、cyclinD1、 nm23、P16、P21等） • 细胞因子系列(EGF、bEGF )

分子病理学技术 ppt课件

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分子病理学技术 ppt课件
5
病理学的进步是病理技术的进步
器官病理学 细胞病理学 超微病理学 免疫病理学 分子病理学 远程病理学
大体 细胞 超微结构 分子基因
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病理学技术包括： 传统病理学技术 人体病理学技术
和 现代新技术 和 实验病理学技术
分子病理学技术 ppt课件
（４）神经微丝（Neurofilaments,ＮＦ）神经细胞、嗜铬细胞、 副节细胞、ＡＰＵＤ瘤；
（５）嗜铬素Ａ（Chromogranin Ａ）：神经内分泌肿瘤。 （６）其它：ＡＣＴＨ、Calcitotin、Gastrin、Glucagon、hGH、
Insulin 、Serotonin等。
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(１)LCA（Leucocyte Common Antigen，白细胞共同抗原）； (２)CD19，CD25，CD20－－标记Ｂ淋巴细胞； (３)CD4，CD8，CD3－－标记Ｔ淋巴细胞； (４)ＭＡＣ３８７、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ－－标记组织细胞； (５)ＣＤ１５、ＣＤ３０（Ki-antigen）－－标记Ｒ－Ｓ细胞； (６)CD11，CD14－－标记单核细胞、粒细胞。
分子病理学技术 ppt课件
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2．间叶组织（软组织）及其肿瘤标记物： （１）间叶源性肿瘤：波形蛋白（Vimentin）； （２）纤维组织源性肿瘤：纤维瘤、肉瘤，恶纤组。 ① 抗胰蛋白酶（α1—ＡＴ，ＡＡＴ）； ② 抗胰糜蛋白酶（α—ＡＣＴ，ＡＣＴ）； ③ 溶菌酶（Lysozyme）。
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三．常用免疫组织化学染色方法
（一）直接法
将荧光素(免疫荧光法)或酶直接标记在第一 抗体上，以检查相应的抗原。直接法具有 特异性强的优点，但敏感性差，耗费抗体 多。

分子病理学技术在临床中应用

分子病理学技术在临床中应用

• 军事医学科学院307医院消化肿瘤内科主任徐 建明教授：“K-RAS基因检测则是了解结直肠 癌患者癌基因状况最直接、最有效的方法。只 有KRAS基因未发生突变的患者才适合使用 EGFR靶向药物治疗。因此，K-RAS基因检测 可以筛选出EGFR受体靶向药物治疗有效的 CRC癌患者，实现患者的个体化治疗，从而获 得良好的预后，延长患者的生命。
有了更加全面的认识。个体化治疗
已经成为肿瘤临床治疗的发展方向 和最有效的手段。
• 但是，如何识别具有相同肿瘤发 生部位、相同病理类型及病期的不同 患者之间存在的差异成为实施个体化 治疗的主要障碍。大量的临床研究和 试验结果表明：特异肿瘤分子标志物 （靶标）是识别患者个体差异的重要 依据，实现对这些靶标的检测是实施 肿瘤个体化治疗的前提和基础。
基因诊断的定义
基因诊断是通过直接探查基因的存 在状态或缺陷对疾病作出诊断的方法。基 因诊断的探测目的物是DNA或RNA。
DNA----反映了基因的存在状态 RNA----反映了基因的表达状态
探查基因的分类
• 内源基因----机体自身的基因 用于诊断基因有无病变
• 外源基因-----如病毒，细菌等 用于诊断有无病原体感染
检测也从以前的单一靶标发展为多靶标
联合进行。通过针对不同癌种的系统靶
标检测，筛选适合患者个体的药物，提 高治疗的针对性和有效率。
分子病理学用于基因诊断 的常用手段
原位杂交： CISH(显色原为杂交)； FISH（包括单色和多色）； SISH（双标，银染色）。
DNA序列分析：DNA-SEQUENCING; PCR-RFLP; PCR-SSCP; D-HPLC;
分子病理学的发展
分子病理学的发展由始即以拥有大量 实验、技术逐日进步为特征，并彼此相辅 相成。分子生物学家不熟悉疾病，临床学 家忙于临床防治疾病，使分子生物学当代 理论和实验及时的引进、提炼并为临床诊 断、认识疾病服务，这一历史任务，落在 病理学工作者的肩上。

分子病理学教学课件ppt

分子病理学教学课件ppt

蛋白质纯化
通过色谱、电泳等技术将目的蛋 白质从混合物中分离出来。
蛋白质分析
利用质谱、光谱等技术对蛋白质的 结构、功能和相互作用进行分析。
细胞培养与转染
细胞培养
将细胞在体外进行培养，以观 察其生长和分化过程。
转染方法
利用物理、化学等方法将外源 DNA导入宿主细胞。
转染效率评估
通过分子生物学技术检测外源 DNA在细胞中的转染效率。
转录后修饰的类型
转录是基因表达的第一步，由RNA聚 合酶催化，生成RNA分子。
转录后修饰包括5'端帽子修饰、3'端 尾巴修饰及RNA剪接修饰等，这些修 饰对于RNA分子的稳定性和翻译效率 具有重要影响。
要点三
转录调控元件与疾病
转录调控元件是调节基因表达的关键 部位，其变异可导致多种疾病，如癌 症等。
THANKS
谢谢您的观看
详细描述
生物信息学方法可以用于处理和分析大规模的生物数据，如基因组学、转录组学和蛋白质组学数据等。这些方 法可以用于寻找基因变异、基因表达谱分析、蛋白质相互作用等，有助于揭示疾病的分子机制和寻找新的治疗 靶点。同时，这些方法还可以用于评估疾病的风险和预后，为临床决策提供依据。
基于干细胞与免疫细胞的分子病理学研究
自身免疫性疾病的分子病理学研究
自身免疫性疾病的病因
系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病与免疫细 胞功能异常、自身抗体产生等分子机制密切相关。
自身免疫性疾病的诊断
通过检测自身抗体、炎症因子等生物标志物，有助于早期诊断自 身免疫性疾病。
自身免疫性疾病的治疗
针对免疫细胞功能异常和自身抗体产生的分子机制，开发出免疫 抑制剂、生物制剂等新型治疗策略。

病理学研究中常用的分子生物学基本技术及其应用 ppt课件

病理学研究中常用的分子生物学基本技术及其应用 ppt课件
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• 2. 液相杂交 （solution hybridization ）
• • • • • • • • • 所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中 (1)吸附杂交方法 HAP（羟基磷灰石）吸附杂交方法(DNA:DNA) 亲和吸附杂交方法 (DNA:RNA) 生物素标记DNA探针 酰化亲和素包被固相支持物 用特异性抗DNA-RNA杂交物的酶标单克隆抗 体与固相支持物上的杂交物反应 酶显色
基因扩增或在转录水平上研究基因表达
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• 原位杂交的探针 单链DNA • 双链DNA • RNA 探针
• 基本方法 (RNA 杂交为例) • A.杂交前准备
• 固定 尽快予以冷冻/固定 • 培养细胞、新鲜组织、石蜡包埋组织均可进行原位杂交 • 通常石蜡包埋信号低于冰冻切片
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• 玻片处理 • 增强组织通透性和探针穿透性 • 稀释的酸去垢剂（detergent）或清洗剂Triton X 100 • 某些消化酶 • 应掌握其用量及孵育时间
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• 应用
• • • • 临床应用 应用非常广泛 研究应用 肿瘤中染色体异常 基因图谱绘制 确定基因在染色体上的顺序
• (6)其它杂交方法 • A. 差异杂交（differential hybridization ）
• B. cDNA 微 点 阵 杂 交 （ cDNA microarray hybridization ） • C. 寡核苷酸微点阵杂交 （oligonucleotide microarray hybridization ） •
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•
• 同一物质在不同时期的形态变化 •
• (4) 蛋白质

分子流行病学的研究进展及临床应用 ppt课件

分子流行病学的研究进展及临床应用 ppt课件

它的等位基因谱 ，也即是这株菌的序列型（ sequence
type,ST ）。这样得到的每个 ST 均代表一组单独的核苷酸 序列信息 。
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序列型（ST)

序列型（ Sequence-typying, STs ）等同于MLEE
得出的电泳型(Electrophoretic type, ET） 通过比较ST可以发现菌株的相关性,即密切相关菌 株具有相同的ST或仅有极个别基因位点不同的ST, 而不相关菌株的 ST 至少有3 个或3 个以上基因位点

聚类分析
计算机输入SPSS，做树状图
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案例一

2006年 7月，本市某医院外科重症监护病房（ ICU ） 8例患 者下呼吸道感染多重耐药鲍曼不动杆菌
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目标性检测

对该ICU的环境、医疗用品、医务人员手及鼻咽拭子进行 细菌学监测，共采样107 份，其中23份检出鲍曼不动杆菌， 阳性率 21.3% 。主要分布在医务人员手、咽部及床头柜、 输液泵、监护仪、治疗车、地面、病人用物等环境和医疗 用品。

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谢谢
qadchh@
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研究对象选择 集体损害
个体易感性 观察的终点
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分子流行病学与医院感染控制 -细菌同源性分析研究在感控中的应用

手术伤口感染！ 导管相关性血流感染！ 呼吸机相关性肺炎！
院内感染？
证据
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医院感染
医院感染是当前医疗卫生的重大问题之一，由于院内感 染密切关系到医疗服务质量，关系到病人的预后、病死率、 住院时间、床位周转率以及病人和国家的巨额经济损失等。
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B cell differentiation with anatom ical sites of various stages
Could you recognize cellular elements as follows in lymph node?
T-zone
Germinal center Mantle zone Marginal zone
Even more, the molecules in the related cells are the key, especially involved in the development and differentiation of lymphoid & hematopoietic cells
B cleaved cell
B non-cleaved cell
T lymphocyte
T lmmunocyte
Memory cell Plasma cell
Paradigm of Lymphocyte transform
by morphology and immunotyping considering molecular events
Thymus-depending zone
Capsular and afferent lymphatics
Reticulum supporting lymphatic tissue
Cortex
Subcapsular sinus
Cortbeculae Medullary cords
分子病理学技术进展及临床应用
内容:
一、临床分子病理学方法1 二、当前分子病理学技术在临床的实际应用 三、分子病理学临床应用存在的问题及对策思考
来自临床的问题
Contemporary Understanding of Carcinogenesis by molecular biology
as our introduction
Understanding of B cell differentiation until 2005 by H Stein
Bone Marrow
T cell-rich zone
Germinal Center
Precursor B Lymphoblast
Somatic Hypermutation/ Affinity Maturation
Centrocyte T cell Macrophage FDC
Proliferation zone
Selected for apoptosis
On-going mutation
Update to B-lymphocyte development model in 2000’s
B cell differentiation by immuno-markers
V(D)J recombination
Naive B cell
Intact BCR
Antigen
BCL2 ↓ BCL6 ↑
B B
B
B DC
BT
Increased Affinity
B
Decreased Affinity
Class Switching IGM → IgG, IgA
DC
T
B
B
BCL6 ↓ BCL2 ↑ IRF4 ↑ B
Hilus
Medullary sinuses Efferent lymphatic vessels
Could you recognize the following cellular elements in lymph node?
T-zone
Germinal center Mantle zone Marginal zone
Lennert’s Presumption based on 80’s of last Century
Mantle zone
Germinal center Dark zone Light zone
Mantle zone Marginal zone
Centroblast Blast Immuoblast Macrophage FDC
More than 100 years ago (1830), British physician Thomas Hodgkin discovered a type of Lymphoma with his naked eyes.
In the time, obviously Thomas Hodgkin did never know R-S cells in his cases before the microscope available in clinic.
Understanding based on 70’s of last Century
Only by morphology
Lymphocyte transform in center of Follicle Interfollicle zone
FDC B lymphocyte
B lmmunocyte
That is the beginning of our story today.
Understanding of Lymphocyte Development
1950s-2010
1. structure and function of lymphoid tissue
Germenal Center(GC)：structure，function，transformation
While at present time, for us, what can be down with our naked eyes rather then with microscope or modern molecular techniques?
The cellular elements in lymphoid & hematopoietic tumors are the key to understand and diagnose their diseases.
Apoptosis
No BCR