凝胶胶内酶解技术路线

蛋白质肽谱制备1．凝胶，用解剖刀将胶带切成1-2mm2大小的胶片放入小管中。

★凝胶染色分为：A:硝酸银染色 B:考马斯亮蓝染色 C:胶体蓝染色★胶粒分为：A:一维SDS-Page胶粒 B:二维双向电泳胶粒2．凝胶加入脱色液100ul浸泡，振荡20min，弃取溶液，重复1-2次直至蓝色褪尽,乙腈100ul,弃废液。

★如果为二维双向电泳胶粒，直接进行第3步骤。

★如果为一维SDS-Page胶粒，需要加两个步骤：①加入50uLDTT还原液,30min,56度,弃废液,加100ul乙腈脱水5-10min②加入50ul碘乙酰胺烷基化，于暗处30min（开冻干机）3．凝胶加100ul脱色液，洗5-10min，乙腈100ul,弃废液，冰冻干燥20min.4. 凝胶加入15-20ul酶液（0.01ug/ul），置于4度放置30min，待酶液完全被吸收，补充酶解缓冲液(25mMNH4HCO3)15-20ul，使胶完全浸没，37度保温15小时以上或过夜。

★如果一管中的胶粒很多，15-20ul酶液不足让所有胶粒都吸涨，可视情况多加酶液。

补同体积酶解缓冲液后，胶粒刚好被液体浸住。

（后边提取液I、提取液II也可相应多加，且提取时间也可相应增长。

）5．加提取液I(5%TFA)100ul,40度加热水浴1小时，每30min，超声一次，3min左右。

6．将提取液吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取II(50%乙腈，2.5%TFA)100ul,30度保温1小时，每30min，超声一次，3min左右。

7. 将提取液合并，氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。

（冻干的肽段放-20度冰箱保存）8．向冻干肽段加入2~10ul（根据未脱色以前胶粒的颜色深浅，判断样品的量多少）的0.1%TFA溶液混匀。

（如果不能及时上质谱检测，建议不要复溶冻干肽段。

）9. 取0.5ul~0.8ul样品点靶。

待干，再点0.5ul基质，上质谱。

溶液配制1．100mMNH4HCO3:称取1.975gNH4HCO3溶于250ml的去离子水中2．脱色液配方乙腈：50mMNH4HCO3=1:13. 10mmol/LDTT还原液：称取1.54mg溶于1ml100mMNH4HCO3中4．55mmol/L烷基化溶液：称取10.2mg碘乙酰胺溶于1mL100mMNH4HCO3中5．酶解贮液：Trypsin(Promega,V5111)制备为0.5ug/ul水溶液，分装1-3ug-20度保存(粉末+40ul水——>2~6ul分装。

一、试剂准备1．30mmol/L K3Fe(CN)6铁氰化钾9.9 mg K3Fe(CN)6溶于1mL Milli-Q水2．100mmol/L Na2S2O3硫代硫酸钠24.8 mg Na2S2O3溶于1mL Milli-Q水3．200mmol/L NH4HCO3碳酸氢铵0.079g NH4HCO3溶于5 mL Milli-Q水4. 覆盖液（酶解缓冲液）40mmol/L NH4HCO3, 10% ACN200ul 200mmol/L NH4HCO3, 100ul ACN, 700ul Milli-Q水5. 萃取液50％ACN，0.1% TFA6. 胰蛋白酶贮存液：胰蛋白酶溶于50mM醋酸溶液中（1mL Milli-Q水加入冰醋酸2.86 uL），浓度1ug/uL，即每管20ug，溶于20uL 50mM醋酸溶液中。

工作液：使用覆盖液稀释至10ng/uL7. 脱色液银染脱色液：30mmol/L K3Fe(CN)6与100mmol/L Na2S2O3 1:1混合考染脱色液：50％ACN, 40mmol/L NH4HCO3以上试剂单独存放在质谱准备室，不要使用其他来源的药品、试剂，其中脱色液需现用现配。

二、实验步骤1. 切胶用剪刀剪断Tip（进口Tip），将蛋白质斑点从凝胶上切下，置于0.5 mL EP管内（进口产品），每管加Milli-Q水400 uL振荡洗涤2min，吸出液体后重复一次，以保证酸液被洗净。

2. 脱色银染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，当胶粒由棕黑色变成亮黄色（与脱色液颜色相同时），迅速加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。

（3％H2O2/25mM NH4HCO3/H2O）考染样品：每管加入现配脱色液50-80uL（视胶粒大小而定），静置2min左右，待胶粒蓝色褪却时，加入400uL Milli-Q水终止反应，重新加入400uL Milli-Q水振荡洗涤一次，吸出多余的液体。

基因工程绪论1、克隆（clone）：作名词：含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。

作动词：基因的分离和重组的过程。

2、基因工程（gene engineering）：体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中，构成遗传物质的新组合，并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内，且能稳定的遗传。

供体、受体和载体是基因工程的三大要素。

3、基因工程诞生的基础三大理论基础：40年代发现了生物的遗传物质是DNA；50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理；60年代确定遗传信息的遗传方式。

以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。

三大技术基础：限制性内切酶的发现；DNA连接酶的发现；载体的发现3、基因工程的技术路线：切：DNA片段的获得；接：DNA片段与载体的连接；转：外源DNA片段进出受体细胞；选：选择基因；表达：目的基因的表达；基因工程的工具酶1、限制性内切酶（restriction enzymes）：主要是从原核生物中分离纯化出来的，是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链的核酸内切酶。

2、限制酶的命名：属名（斜体）+种名+株系+序数3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割4、同裂酶：来源不同，其识别位点与切割位点均相同的限制酶。

5、同尾酶：来源不同，识别的靶序列不同，但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。

6、限制性内切酶的活性：在适当反应条件下，1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物，所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。

7、星号活性：改变反应条件，导致限制酶的专一性和酶活力的改变。

8、DNA连接酶的特点：具有双链特异性，不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA，连接反应是吸能反应，最适反应温度是4至15度，最常用的是T4连接酶。

9、S1核酸酶：特异性降解单链DNA或RNA。

10、RNAH降解与DNA杂交的RNA，用于cDNA文库建立时除去RNA以进行第二链的合成。

1.2.2 蛋白质谱鉴定（1）胶内酶解斑点切取：用剪刀将200 μL枪头尖端剪掉约1-2cm，孔的直径约为2-3 mm，用修剪后的吸头从凝胶上戳取蛋白质点，再转入200μL离心管中（离心管灭菌后浸泡于75%乙醇，用时取出自然干燥）。

操作时注意减少污染，戴帽子手套操作，尽量减少所切取蛋白质点周围的凝胶体积，勿使样品干燥。

脱色、脱水：每管加入100 μL脱色液（50% 乙腈，25 mM 碳酸氢铵），室温放置30 分钟，吸去脱色液，重复以上步骤脱色至胶块无色透明。

加入60 μL 乙腈使凝胶脱水10 min，丢弃上清液。

酶解：每块凝胶加入约8 μL（浓度为12.5 ng/μL）溶于100 mmol/L 碳酸氢铵的胰蛋白酶，4℃ 吸胀1 h，吸出多余酶液，倒置于37℃温箱中保温12 h。

加入10 μL 5% 三氟乙酸，1 h后将溶液转移到新的Ep管内，重复2次将溶液合并。

加入10 μL 2.5% 三氟乙酸，1 h后将溶液与之前溶液合并，重复2次。

将肽段溶液在冻干机中真空低温冻干，以备用于质谱鉴定。

用0.2%三氟乙酸充分溶解肽段，立即进行质谱鉴定。

保存？？？（2）质谱鉴定①点靶：将冻干肽混合物中加入2μL 0.2% 三氟乙酸溶液，充分溶解肽段。

取每个样品0.6 μL手工点于MALDI靶板上，避光干燥。

再取0.6 μL饱和基质α-手工点于MALDI靶板上，避光干燥。

待溶剂挥发后，将MALDI靶置入MALDI-TOF-TOF质谱仪(4800 Proteomies Analyzer)。

②质谱鉴定：样品用4800串联飞行时间质谱仪4800 Proteomies Analyzer 进行质谱分析，采用反射模式，一级、二级质谱连续自动检测，采用自动获取数据的模式采集数据。

肽指纹图谱（PMF）质量扫描范围为800-4000Da，且一级质谱强度最大的 5 个峰进行串级质谱分析。

谱图用myoglobin酶解肽段进行外标校正。

基因工程生产人胰岛素的技术路线人胰岛素是一种重要的药物，用于治疗糖尿病等疾病。

传统的人胰岛素生产方法是从猪胰腺中提取，但存在感染风险和胰岛素结构与人体有差异等问题。

为了解决这些问题，科学家们利用基因工程将人胰岛素基因克隆到大肠杆菌等微生物中，通过基因表达、突变、筛选、纯化等步骤，生产出高质量的人胰岛素。

技术路线如下：1. 克隆人胰岛素基因：从人胰岛细胞中分离出mRNA，利用反转录酶将其转录成cDNA。

通过PCR扩增，将人胰岛素A、B链合成成一个完整的人胰岛素基因。

在该过程中，要注意选择合适的启动子、终止子、信使RNA起始和终止密码子等。

将该基因插入到载体中，如大肠杆菌质粒pBR322中的限制性内切酶位点，使其能够在大肠杆菌中表达。

2. 基因表达：将含有人胰岛素基因的重组质粒经过转化技术，导入到大肠杆菌中，利用细胞自身的代谢活性，让其经过转录、翻译等步骤，表达出人胰岛素前体蛋白(Proinsulin)。

Proinsulin蛋白由A、B两个多肽链组成。

其中A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。

A链和B链由两个酯键连接在一起，形成Proinsulin。

Proinsulin在细胞内被剪切成人胰岛素A、B链和C肽。

其中C肽并无生理作用，被细胞内酶降解分解。

3. 突变筛选：由于大肠杆菌系统中表达的人胰岛素前体蛋白形成的Proinsulin无法自行成熟转化为人胰岛素，因此必须人为帮助B链成熟多肽链的脱落。

突变技术可以改变Proinsulin分子内酶解的敏感性和特异性，使B链多肽链和C肽之间的酯键能够被限制酶特异性水解，得到纯度较高的人胰岛素。

4. 纯化：通过离心、层析、过滤等技术，将发酵液中的人胰岛素纯化提取。

常用的纯化方法包括离心、酸性沉淀、离子交换层析、有机溶剂沉淀、逆流层析、凝胶过滤等。

整个生产过程包括基因克隆、表达、突变、筛选、纯化，一般需要经过6-7天的培养过程。

通过基因工程生产人胰岛素，不仅能够解决传统人胰岛素来源的问题，而且能够生产高质量、高效率的人胰岛素。

卡拉胶降解酶的分离纯化1.前言卡拉胶是一种具有商业价值的亲水凝胶（属天然麒麟糖植物胶），主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中。

卡拉胶是由，1，3-β-D-吡喃半乳糖和1，4-α-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。

与琼胶相比，卡拉胶所有的β-连接和α（1-4）连接的残基都是D构型，但琼胶在α（1-4）连接半乳糖基上在中是L-构型。

对卡拉胶来说，它的结构在α（1-4）连接的半乳糖基上还形成了3，6-内醚，见图[1]卡拉胶可分为八种类型。

κ-卡拉胶，τ-卡拉胶，λ-卡拉胶，γ-卡拉胶，υ-卡拉胶，φ-卡拉胶，ξ-卡拉胶，ω-卡拉胶。

另一种分类方法是根据己确定的各种类型的理想的卡拉胶重复二糖的结构特征，以及1，3-连接的D-半乳糖上的硫酸基位置，可将各类型的卡拉胶分类为β-族卡拉胶、κ-族卡拉胶、λ-族卡拉胶。

卡拉胶是从红藻如角叉菜、杉藻、麒麟菜等中提取的一种水溶性多糖。

我国早期曾称其为咖啦胶、角叉莱胶、鹿角菜胶，后统一为卡拉胶。

有许多种红藻类都可以提取卡拉胶，目前世界上生产的卡拉胶有近一半是用麒麟菜作原料，此外还有角叉菜、海萝、杉藻、沙菜、银杏藻、叉红藻、育叶藻等均可提取卡拉胶，我国南方广东省用麒麟菜、北方辽宁省用角叉菜作原料生产卡拉胶[2]。

而卡拉胶酶主要有κ-卡拉胶酶，τ-卡拉胶酶，λ-卡拉胶酶等，其主要是依据所降卡拉胶降解酶的分离纯化解的底物命名的。

许多海洋微生物如Pseudoalteromonas carrageenovora,Pseudomonas carrageenovora[3,4]等都能产出卡拉胶酶，其他来源例如在海洋软体动物（Marine mollusks）体内也有[5]。

根据作用机制的不同卡拉胶降解酶可分为保持型和转换型两种。

1995年，Philippe Potin等人报道了交替单胞菌A.carrageenovora的cgkA基因所编码的κ-卡拉胶降解酶，预测其相对分子质量为44,212 Da，远远大于经SDS-PAGE测定的从发酵液纯化出的酶蛋白的相对分子质量35 kDa。

DNA限制性酶切及凝胶电泳实验原理及方法一、电泳前准备准备内容作用 1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净防止不必要的重复污染，减少外来的污染。

梳子干净晾干有利于梳孔的形成。

2.检查电泳槽，根据情况更换buffer 排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。

3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或者是过慢浪费时间。

4.计算agarose的用量和制胶 buffer的用量记录，胶实验记录备查最终越薄越好。

二、制胶步骤注意事项1.称量agarose和buffer Buffer不要用成H2O，称量相对准确2.融胶，加热到胶产生大量的气泡时，拿出摇匀，继非常热，小心烫手，另外注意不要加热过度使胶冲出续加热到完全溶解，拿出摇匀，再加热到沸腾。

瓶子。

因此注意选择起码为胶体积2倍以上的瓶子。

保证胶混匀和完全溶解，减少可能因此引起的胶中孔径不均匀影响分离效果。

3.倒胶，可用水浴的办法使胶冷却到60度左右，即手制胶的桌面相对水平。

倒胶时尽量减少气泡的产生。

可以握住瓶子的温度，沿着制胶板的一侧，缓缓地一EB如果在制胶时加入，在60度左右时加入，使终浓次性倒入。

梳子最好是预先放好并固定的，注意梳孔度为0.5ug/ml。

不宜过低，染色成像不明显；不宜过的体积能点的下所有的样。

用枪头赶掉气泡。

高，导致背景太深。

摇匀要沿着瓶壁摇动，尽量减少气泡产生的可能性。

高浓度胶例如2%以上的EB很难摇匀，而且凝的速度也相对快，强烈建议跑完胶之后再用EB染色。

4.室温凝胶30分钟过程中不要碰到梳子，尽量保持胶的位置不移动。

时间不宜过久，导致胶干燥变形；不宜过短，影响胶内部孔径形成。

5.拔梳子，放入电泳槽。

缓缓地将梳子垂直从梳孔拔出，尽可能使梳子是同时从各个胶孔拔出的。

暂时不用的胶最好放入电泳槽电泳液中浸泡。

电泳液要浸没胶1mm。

三、上样电泳步骤注意事项 1.样品中加入loading buffer使其终浓度为1 X，混匀Loading buffer浓度不宜过低，点样时样品不能很好的沉在胶孔里；不宜过高，电泳时容易形成带形的变形。

第四节:凝胶蛋白质点的酶解一.蛋白质点酶解准备工作：1．检查冻干机，调好水浴锅（37℃，56℃）2．检查各种试剂的量是否足够（DTT IAA NH4HCO3）3．检查酶解房卫生状况每一步注意事项：1．每一步加入的液体量视胶块大小定，一般是50uL/管2. 每次震荡后随手甩一下，以便把胶块和管壁上的液滴甩下来3. 每次打开EP管盖子前，确认胶块在管内，并将胶块甩至管底。

开盖子动作尽量轻巧，以免胶块弹出。

4．在冻干样品后，要确保样品在管底，以防样品与封口膜一起被去掉。

酶解前配制1）、100 mmol/L的NH4HCO3参考配制10mL 称79.06mg NH4HCO3 溶于10mL水中以后每一步25 mmol/L的NH4HCO3可用100 mmol/L的NH4HCO3稀释。

2）、1mol/L的DTT参考配制10ML 称1.55gDTT溶于10 mL水中，1mL分装，避光贮存（锡箔包），-20度永久保存酶解步骤: 调水浴锅到37℃以便做脱色用，此外，调水浴锅到57℃，以便做还原用。

1.冲洗胶块：用水洗衣胶块2次，2. 脱色：用含有25mmol/L的NH4HCO3的50%的乙腈37℃保温30min。

如第一次脱色不完全可再脱一次3.干燥：吸出液体后，先加50%乙腈，再加100%的乙腈。

4．还原：加入还原剂，封口，57℃水浴一小时，还原蛋白质。

还原剂：25mmol/L的NH4HCO3（含10mmol/L DTT）参考配制方法（4mL）：6.2mgDTT溶于4mL 25mmol/L的NH4HCO3中注意事项：1. 注意在水浴锅上写纸条标明使用者名字，水温和使用的时间段，方便实验之间的协调和发生停电等意外情况时别的同学帮助临时处理样品。

2．水浴锅用完后恢复到还原前的初始状态，以免后来的同学做实验时因为习惯或者经验忽略此处造成不必要的失误。

5．烷基化将样品从水浴锅中取出后，室温冷却，去掉液体，迅速加入同样体积的烷基化试剂室温暗处放置45min，使之碘乙酰胺化。