琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制

实验2 琥珀酸脱氢酶的作用及竞争性抑制的观察（一）原理琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶，测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定三羧酸循环途径是否存在。

琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢，产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水。

在缺氧的情况下，若有适当的受氢体也可显示出脱氢酶的作用。

如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下，可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白。

这样，便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用。

琥珀酸+ 甲烯蓝琥珀酸脱氢酶延胡索酸+ 甲烯白无氧条件丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合。

若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种现象称为竞争性抑制。

如相对地增加琥珀酸的浓度，则可减轻丙二酸的抑制作用。

（二）试剂1．1.5%琥珀酸钠溶液：称取琥珀酸钠1.5g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。

如无琥珀酸钠可用琥珀酸配成水溶液后，以氢氧化钠溶液中和至pH7~8。

2．1%丙二酸钠溶液：称取丙二酸钠1g，用蒸馏水溶解并稀释至100ml。

3．0.02%甲烯蓝溶液。

4．1/15mol/LNa2HPO4溶液：取Na2HPO4 · 2H2O 11.8g，用蒸馏水溶解并稀释至1 000ml。

5．液体石蜡。

（三）操作1．猪心脏制备液：称取新鲜猪心1.5~2.0g放组织捣碎机中，加入等体积的石英砂及1/15mol/LNa2HPO4溶液3~4ml，捣碎成浆，再加入6~7ml1/15mol/LNa2HPO4溶液，放置1小时，不时摇动，离心取上清液备用。

2．取4支试管，编号并按下表操作：试管心脏制备液 1.5%琥珀酸钠溶液1%丙二酸钠溶液蒸馏水0.02%甲烯蓝溶液（滴）（滴）（滴）（滴）（滴）1 5 5 －10 22 5 5 －10 2（先煮沸）3 5 5 5 5 24 5 10 5 5 23．各管溶液混匀后，每管各加液体石蜡一薄层（约5~10滴）。

琥珀酸脱氢酶 15生物化学实验--琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用【目的】1 ．掌握琥珀酸脱氢酶作用及丙二酸抑制作用的实验技术与原理。

2 ．深化理解酶的竞争性抑制作用的特点。

【原理】肌肉组织含有的琥珀酸脱氢酶是一种结合蛋白酶，以FAD 为辅基。

它能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，FAD 接受氢生成FAD2H 。

体外实验以美蓝( 甲烯蓝) 为受氢体，使美蓝还原生成美白( 甲烯白) 。

其反应如下：琥珀酸脱氢酶活性越高，美蓝脱色所需的时间越短，由于美白易被空气中的氧氧化成美蓝。

故实验需在无氧条件下进行，可加一层液体石蜡以隔绝空气。

丙二酸与琥珀酸的化学结构很相似，能和琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酶结合，从而抑制琥珀酸的脱氢作用。

其抑制程度与抑制剂和底物二者的浓度有关。

本实验通过不同浓度的琥珀酸和丙二酸来观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用。

【器材】 1 ．研钵与剪刀 2 ．漏斗 3 ．纱布 4 ．恒温水浴【试剂】1 ．0.2mol/L 琥珀酸溶液2 ．0.02mol/L 琥珀酸溶液3 ．0.2mol/L 丙二酸溶液4 ．0.02mol/L 丙二酸溶液以上四种溶液均先用5mol/L NaOH 溶液调至pH7.0 ，再用0.01mol/L NaOH 溶液调至pH7.4 。

直接用琥珀酸钠或丙二酸钠配制亦可。

5 ．1/15mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4 ）1/15mol/L Na 2 HPO 4 80.8ml 与1/15mol/L KH 2 PO 4 19.2ml 混匀即可。

6 ．0.02% 美蓝溶液7 ．液体石蜡【操作】1 ．肌肉提取液的制备取用蒸馏水清洗过的新鲜动物肌肉组织约10g ，置于研钵（或匀浆器）中，研磨成糜状，然后每克肌肉组织加 4 倍体积的冰冷的pH7.4 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液，混匀，用双层纱布过滤，取滤液备用。

2 ．酶促反应取试管 5 支，编号，按下表操作。

实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
一实验目的
了解琥珀酸脱氢酶的作用及酶促反应中竞争抑制。

二实验原理
肌肉组织中含有琥珀酸脱氢酶，能催化琥珀酸脱氢氧化生成延胡索酸，脱下的一对氢原子由FAD接受，生成FADH2。

本实验在无氧条件下采用甲烯蓝为受氢体（蓝色），接受FADH2传递的氢原子，使甲烯蓝受氢还原成甲烯白（无色），以指示酶的活性。

丙二酸与琥珀酸的结构相似，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。

在该酶促反应中设置不同含量的底物，并加入等量的丙二酸，观察甲烯蓝颜色消退的速度，判断琥珀酸脱氢酶的活性及丙二酸对酶活性的抑制程度。

三药品器材试管、滴管、高速组织捣碎机、恒温水浴箱、组织等。

1.0.1mol/L磷酸盐缓冲液（Ph7.4）取0.1mol/L磷酸氢二钠溶液81ml和0.1mol/L
磷酸二氢钠19ml混合即成。

2. 1.5％琥珀酸钠溶液。

3.1％丙二酸钠溶液。

4.0.02％甲烯蓝溶液。

5.液体石蜡。

6.肌肉匀浆取新鲜的动物肌肉组织适量，用组织剪将其剪碎，加入pH
7.4磷酸盐
缓冲液，置于高速组织捣碎机中加工成约20％的肌匀浆。

四实验方法取四支试管，编号，按下表操作：
中保温，在15～20分钟内观察各管各管的颜色变化，做好记录。

五思考题
1结合本实验说明竞争性抑制的特点。

2结合实验原理说明各管颜色变化的原因。

实验三琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察一、基本原理脱氢酶的作用在于激活并脱下底物上的氢，使之通过一系列传递体最后传给氧而生成水。

在缺氧的条件下，适当的受氢体也可接受脱氢酶从底物上脱下的氢。

因此，选用适当的受氢体便可以观察到脱氢酶的作用。

琥珀酸脱氢酶能使琥珀酸脱氢生成延胡索酸，并将脱下的氢交给受氢体。

当在缺氧的条件下用甲烯蓝（美蓝，蓝色物质）作为受氢体时，甲烯蓝被氢还原生成甲烯白（美白，无色物质），其反应如下：CH2—COOH 琥珀酸脱氢酶HC—COOH| + MB ——————→‖+ MB·2HCH2—COOH 无氧条件HOOC—CH琥珀酸甲烯蓝(兰色)延胡索酸甲烯白(无色)根据这种蓝色转变为无色的变化过程，就可以判断出琥珀酸脱氢酶起了催化作用。

丙二酸的结构与琥珀酸相似，可与琥珀酸竞相结合琥珀酸脱氢酶的活性中心，从而抑制该酶的活性，是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。

这种抑制作用即属酶的竞争性抑制作用。

试剂及器材二、试剂及器材1．1.5% (w/v)琥珀酸钠溶液： 2．1% (w/v)丙二酸钠溶液：3. 0.02% (w/v)甲烯蓝溶液4. 1/15mol/L Na2HPO4溶液：5. 液体石蜡油6 手术剪,镊子7．研钵,净细砂8．恒温水浴锅, 酒精灯9．离心机及离心管10. 刻度吸管和滴管三、操作步骤1.猪心脏提取液的制备：(1)称取新鲜猪心脏1.5—2g放置研钵中剪碎；(2)加入等体积的净细砂1/15mol/LNa2HPO4溶液3—4 ml，然后将之研磨成匀浆；(3)再加入1/15mol/L Na2HPO4溶液6—7ml，放置30min，不时摇动；(4)于2000rpm离心10min，取上清备用。

2.取4支试管，按下表编号操作：2_52010421555103225_55(煮沸)2225_5510.02% 甲烯蓝（滴）蒸馏水（滴）1%丙二酸钠（滴）1.5%琥珀酸（滴）心脏提取液（滴）试管号3.加好试剂后混匀，然后立即在各试管中加入一层（约5－10滴）液体石蜡油。

琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制
一、实验原理
在化学结构上与底物类似的抑制剂，能与底物竞争酶分子的活性中心，从而抑制酶的活性。

抑制程度随抑制剂浓度的改变而改变。

如果底物浓度不变，酶活性的抑制程度随抑制剂浓度的增加而增加。

反之，如抑制剂浓度不变，则酶活性随底物浓度增加而逐渐回复，这种类型的抑制称竞争性抑制。

琥珀酸脱氢酶是一种含铁的黄酶，它可以催化琥珀酸脱氢酶，生成延胡索酸，在有氧的情况下，脱下的氢经呼吸链的传递，与氧化合成水。

肝中含有丰富的琥珀酸脱氢酶，体外实验在隔绝空气的情况下，琥珀酸脱下的氢可被人工受氢体一甲烯蓝接受还原成甲烯白。

因此我们可以用甲烯蓝被还原褪色的速度和程度，来了解不同底物浓度，不同抑制剂浓度时酶活性的改变。

二、实验步骤与结果
2.将上述各试管摇匀，于夜面上加液体石蜡10滴，放37℃水浴中保温，随时比较，观察
各试管颜色变化。

3.结果
经观察，各个试管的褪色时间顺序为：1>4>2>3
三、结论
底物浓度、抑制剂浓度影响了酶的竞争性。

琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制实验报告的心得体会
琥珀酸脱氢酶（SDH）是一种酶,参与生物体内的三羧酸循环。

SDH的主要功能是将琥珀酸氧化为富能的丙酮酸和二氧化碳,为细胞提供能量。

SDH的活性受到一些物质的影响,例如甲肝灵等药物就可以抑制SDH的活性。

竞争性抑制实验是在SDH的底物琥珀酸中加入不同浓度的抑制剂,观察SDH的活性变化。

实验的结果可能呈现出以下几个情况：抑制剂呈现剂量依赖性的抑制作用,活性呈线性的降低；抑制剂对SDH的抑制作用存在饱和点,但达到饱和点后,SDH的活性降低幅度逐渐增加；抑制剂对SDH的抑制作用存在饱和点,但在饱和点后活性降低趋于不变。

实验者可以通过这些结果,得到抑制剂的半数抑制浓度（IC50）,进而评价抑制剂的效果。

在实验中,我们观察到抑制剂呈现剂量依赖性的抑制作用,且具有饱和点。

这说明抑制剂与SDH结合的速度是有限的。

从实验结果中可以看出,IC50值比较低,这表明抑制剂的效果比较好。

实验结果为我们提供了有关SDH的一些基本信息,也有助于我们更好地理解如何控制相关疾病,比如心肌缺血。

在这个实验中,我深刻认识到了科学研究的重要性,同时也学会了如何进行实验和如何分析实验结果。

这些经验对于我的学习和未来的研究都有一定的启示作用。