针刺调节MAPK_ERK通路对脑缺血模型大鼠的干预作用

2010年1月第27卷第1期J anu ary 2010,Vo.l 27,No .1收稿日期:2009-05-12作者简介:杨忠华(1976-),男,博士研究生通讯作者:许能贵(1964-),男,研究员,博士生导师,E -m ai:l ngxu @t o m co m 基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30572420);国家教育部新世纪优秀人才支持计划(编号:NCET -04-0831)针刺调节MAPK /ERK 通路对脑缺血模型大鼠的干预作用杨忠华1, 许能贵1, 易 玮1, 于 涛2, 董正妮3(1 广州中医药大学,广东广州 510405;2 广州中医药大学第二附属医院,广东广州 510120;3 天津中医学院第一附属医院,天津 300193)摘要: 目的 观察电针调节丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(M APK /ERK )通路对脑缺血模型大鼠的干预作用。

方法 选用S D 大鼠,随机分为假手术组、模型组和电针组,每组又分为2h 、1d 、3d 3个亚组,后2组采用热凝闭大脑中动脉法复制局灶性脑缺血模型。

电针组针刺百会、大椎穴,每天1次,分别治疗2h 、1d 、3d 。

每组均进行神经行为学评分及Y 迷宫测试,并采用免疫组化法检测脑组织CA1区、C A 3区磷酸化EPK (p EPK )阳性细胞表达的积分光密度值总和(D su m )。

结果 模型组大鼠神经行为学评分显著升高、Y 迷宫测试时间显著延长(均P <0 01),电针1d 、3d 组可显著降低神经行为学评分,缩短Y 迷宫测试时间,与模型组及电针2h 组比较差异均有显著性意义(P <0 05或P <0 01)。

假手术组无p EPK 阳性细胞表达,模型组CA1区和CA3区D sum 显著升高(均P <0 01),电针各组CA 1区、CA3区D sum 均较模型组显著降低(P <0 05或P <0 01),而电针1d 、3d 组D sum 降低幅度显著大于电针2h 组(均P <0 05)。

结论 电针可以通过调节MA PK /ERK 通路,降低p ERK 在脑缺血早期的表达,从而改善脑缺血模型大鼠的脑组织损伤。

关键词:脑缺血/针灸疗法; 脑/病理学; 疾病模型,动物; 大鼠; 穴,百会; 穴,大椎中图分类号:R 245 31 文献标志码:A 文章编号:1007-3213(2010)01-0023-05细胞外信号调节激酶(ex trace ll u l a r si g na l regu l a ted k i n ase ,ERK )是丝裂原活化蛋白激酶(m itogen acti v ated protein kinases ,MAPK)的一种,是非常保守的信号系统,它们存在于从酵母到哺乳动物的各种细胞中[1]。

ERK 调节着细胞的增殖、分化和存活,一方面可通过接受大量来自生长因子、丝裂原、环境刺激等的信号,另一方面通过ERK 信号级联反应作用于核转录因子,调控基因表达[2-4]。

目前,已开始寻找针对ERK 途径中各个环节的调控机制,用以调控信号转导的途径,而ERK 传导通路在局灶性脑缺血后被激活,并在缺血性组织损伤中发挥重要作用,针对ERK 的变化规律进行有效干预可望为急性缺血性脑卒中提供一个新的路径。

本研究观察了针刺调节MAPK /ERK 通路对脑缺血模型大鼠的影响,现报道如下。

1 材料与方法1 1 动物 SPF 级雄性Sprague Da w ley 大鼠90只,体质量180~240g ,用抽签法随机分为假手术组、模型组和电针组,每组又分为2h 、1d 、3d 3个时间段组,共9个亚组,每亚组各10只。

手术后模型1d 组死亡2只,模型3d 组死亡1只,针刺2h 组死亡1只,死亡鼠均予剔除。

1 2 主要仪器及试剂 1寸毫针,直径0 3mm !25mm,由苏州医疗用品厂生产,华佗牌电子针疗仪由苏州医疗用品厂有限公司提供,Y 迷宫由上海仕元科学器械有限公司提供,932型电热凝器由上海医疗器械八厂生产。

磷酸化p44/42MAP K i n ase 一抗由武汉博士德公司提供,免疫组化染色试剂盒(即用型S ABC )由武汉博士德公司提供。

1 3 模型复制 采用热凝闭大脑中动脉法复制局灶性脑缺血模型[5]。

假手术组只暴露大鼠大脑中动脉,不予凝闭。

治疗组造模后立即给予电针治疗。

1 4 治疗方法 治疗组选取督脉经穴百会、大椎两穴[6],以毫针斜刺百会0 3寸,直刺大椎0 3寸,用疏密波,5~10次/s ,强度以大鼠安静耐受为度,约3~5V,时间30m i n ,每天1次。

分别连续治疗2h 、1d 和3d 。

23广州中医药大学学报Jou rnal ofGu angzhou Un i versity ofT rad itional Ch i nes e M ed i ci n e2010年第27卷1 5 动物神经运动功能体征的观察 采用Bederson评分标准。

假手术组、模型组和电针组3组大鼠于造模后2h、1d和3d不同时间段每组随机抽取8只大鼠分别进行神经功能行为评分。

1 6 Y迷宫实验 Y型电迷宫3条臂的尽头均有1灯,底部是电网,其中只有1条臂尽头的灯发出亮光,此时该臂底部电网无电流通过,即为安全区。

另两臂的灯不亮,底部电网通电(约50V),为非安全区。

安全区与非安全区随机改变。

实验开始时,将动物放入迷宫中任一臂中适应2~3m i n。

然后将其他任一臂的信号灯打开作为条件刺激,经1s延迟后,灯不亮的两臂通电(非条件刺激)。

当动物逃避电击至安全区后,灯亮持续15s,然后熄灯休息45s,即完成1次操作并记录所用时间。

然后再开始下一次操作。

1 6 1 筛选 将大鼠放入Y迷宫箱中适应3~5 m in,给予适当电击,至其对3臂均探索进入为止,选择活跃,对电击反应较敏感的大鼠入组,淘汰反应过于迟钝或敏感的大鼠。

1 62 学习测试 对筛选后的大鼠,采用固定次数随机法[7],每天给予20次迷宫训练。

安全区以无规则次序变换,大鼠受电击逃到安全区后,灯光继续作用10~15s,熄灯后结束1次测试,大鼠所在支臂作为下一次测试的起点。

每只大鼠每天固定训练20次,连续训练4d。

以大鼠受信号刺激后跑向红灯安全区,在安全区躲避30s以上,不再跑回其他2臂为正确反应。

1 6 3 学会标准 以连续20次测试中的错误反应次数(error number,EN)∀2次作为学会标准。

从筛选后学习测试达标的各组大鼠中随机取5只,分别于手术后2h、1d和3d进行试验,观察各组大鼠受到电刺激后从非安全区跑至安全区所用时间作为在Y型迷宫的测试成绩。

1 7 磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p ERK1/2)表达检测 上述各组动物进行实验后在规定时间内腹腔内注射100m g/L水合氯醛(40m g/kg)麻醉动物。

开胸后剪开右心耳,从左心室插管至主动脉,先用150mL生理盐水(室温)快速灌注,随后用含40g/L多聚甲醛的0 1m o l/L磷酸钠盐缓冲液500mL(4#)灌注固定2h。

将脑取出后放入含300g/L蔗糖的0 1m ol/L磷酸钠盐缓冲液中,并置于4#冰箱内直到沉底。

冠状冰冻切片,厚度20 m。

p ERK的免疫组织化学染色均严格按说明书操作。

采用I PP6 0图像分析系统检测,测定C A1区、C A3区(10!20倍)视野中p ERK阳性细胞区域的积分光密度值总和(D su m),以评估p ERK的含量变化。

1 8 统计学方法 多组间比较采用单因素方差分析(one w ay ANOVA),各组间两两比较采用q检验(N e wm an Keu l法),所有统计均采用SPSS13 0统计软件进行分析。

2 结果2 1 各组大鼠脑缺血区不同时段神经功能行为评分 表1结果显示:模型组大鼠神经行为学评分显著升高(P<0 01)。

电针1d、3d组大鼠神经行为学评分显著降低,与模型组及电针2h组比较差异均有显著性意义(P<0 05或P<0 01)。

表1 各组大鼠脑缺血区不同时段神经功能行为评分比较(x∃s)Tab le1 Compa rison o f neu roe t ho log ica lsco re o f d ifferent group s in d iff e ren t tm i e s/分组别N t=2h t=1d t=3d假手术组240 00∃0 000 00∃0 000 00∃0 00模型组243 13∃0 64%2 88∃0 64%2 88∃0 64%电针组242 75∃0 432 13∃0 64&∋1 63∃0 74&( %P<0 01,与假手术组比较;&P<0 05,与模型组比较;∋P<0 05,(P<0 01,与电针2h组比较2 2 各组大鼠不同时段Y迷宫测试成绩 表2结果显示:模型组大鼠Y迷宫测试时间显著延长(P <0 01)。

电针1d、3d组可显著缩短大鼠Y迷宫测试时间,与模型组及电针2h组比较差异均有显著性意义(P<0 05或P<0 01)。

2 3 各组大鼠不同时段CA1区和CA3区p ERK 积分光密度值总和比较 表3、表4结果显示假手表2 各组大鼠不同时间段Y迷宫测试成绩比较(x∃s) Tab le2 Compa rison o f rats behavio rin Y m aze in d iff e ren t tm i e t/s 组别N t=2h t=1d t=3d假手术组154 76∃1 634 60∃2 484 70∃2 75模型组159 28∃1 80%8 75∃1 18%9 07∃1 25%电针组158 35∃0 706 80∃1 34&∋5 65∃1 13&( %P<0 01,与假手术组比较;&P<0 01,与模型组比较;∋P<0 05,(P<0 01,与电针2h组比较24广州中医药大学学报第1期术组无p ERK1/2阳性细胞表达。

模型组C A1区和CA3区D sum显著升高(均P<0 01),在2h时最高,之后逐渐降低。

电针各组CA1区和C A3区D su m均较模型组显著降低(P<0 05或P<0 01),而电针1d、3d组D su m降低幅度显著大于电针2h 组(均P<0 05)。

表3 各组大鼠CA3区p ERK1/2表达比较(x∃s) Tab le3 Compa rison o f p ERK1/2exp ressi o ni n CA3area o f d iff e ren t g roups Dsum组别N t=2h t=1d t=3d假手术组240∃00∃00∃0模型组24815 39∃10 45%540 63∃24 20%497 41∃25 36%电针组24642 77∃21 86∋474 35∃32 71&(408 56∃11 47&(%P<0 01,与假手术组比较;&与P<0 05,∋P<0 01,与模型组比较;(P<0 05,与电针2h组比较表4 各组CA1区p ERK1/2表达比较(x∃s)Tab le4 Compa rison o f p ERK1/2exp ressi o ni n CA1area o f d iff e ren t g roups Dsum组别N t=2h t=1d t=3d假手术组240∃00∃00∃0模型组24574 92∃51 22%420 61∃34 80%402 67∃35 37%电针组24490 89∃13 47∋384 50∃23 67&(345 36∃20 09&(%P<0 01,与假手术组比较;&与P<0 05,∋P<0 01,与模型组比较;(P<0 05,与电针2h组比较2 4 各组大鼠不同时段CA1区和C A3区p ERK 表达比较 图1~图6(彩图见第99~100页)显示:模型组与电针组p ERK1/2在2h至3d均有阳性表达,2h时可见棕黄染色的细胞密集,主要见于胞浆,只有少许胞核染色。