Top10大肠杆菌菌株使用说明

大肠杆菌克隆表达人类基因的注意事项大肠杆菌是常用的真核表达系统之一，具有优点如易于培养、遗传稳定和高表达水平等。

在进行大肠杆菌克隆表达人类基因的过程中，需要注意以下几个方面：1.选择合适的质粒载体：质粒载体是将目标基因插入宿主细胞中的工具。

选择具有致密复制位点和特定启动子的质粒，可以提高基因的稳定性和表达水平。

一般建议选择常用的表达载体，如pET系列、pGEX系列等。

2.制备合适的基因片段：将人类基因转入大肠杆菌前，需要利用PCR或其他方法从人类细胞中扩增得到基因片段。

合理设计引物，包含适当的启动子和终止子序列，避免产生GC丰富的片段，以免影响大肠杆菌的转化和表达效率。

3.优化启动子和终止子：为了提高目标基因的表达水平，可以选择合适的启动子和终止子来调控基因的转录和翻译。

常用的启动子包括T7、lac、trp等，终止子一般选择T7终止子。

4.确定正确的大肠杆菌菌株：大肠杆菌有多个常用的表达菌株，如BL21(DE3)、XL1-Blue、TOP10等。

根据实验要求选择合适的菌株，包括产蛋白质的溶解度、转化和表达效率、内毒素含量等因素。

5.优化诱导条件：为了获得最佳的基因表达效果，需要优化诱导条件。

常用的诱导剂有IPTG、Lactose等。

优化诱导时间、温度和诱导剂浓度等条件，可根据目标蛋白的特性进行调整。

6.加入相关辅助单元：在大肠杆菌中表达人类基因时，可能需要加入辅助单元，如信号肽序列、标签序列、分泌酶等。

信号肽序列可以帮助蛋白质定位和转运，标签序列如His-tag、GST-tag可以辅助蛋白质纯化和检测。

7.注意避免内毒素产生：大肠杆菌属于革兰氏阴性菌，其细胞壁含有内毒素。

内毒素可引起细胞毒性和炎症反应，影响目标蛋白的纯化和性质。

因此，在表达人类基因时，需要注意控制内毒素的产生，如选择低内毒素菌株、减少诱导剂的使用量等。

8.合理的蛋白质纯化策略：在成功表达目标蛋白后，需要进行蛋白质的纯化。

根据蛋白质的性质，选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

TOP 10 感受态细胞制备SOB培养基成分每升成分∙0.5% (w/v) 酵母提取物∙2% (w/v) 胰蛋白胨∙10 mM NaCl∙ 2.5 mM KCl∙20 mM MgSO4∙ 5 g酵母提取物∙20 g胰蛋白胨∙0.584 g NaCl ∙0.186 g KCl∙ 2.4 g MgSO4备注：可以用10 mM MgCl2and 10 mM MgSO4代替20 mM MgSO4。

高压前调pH至7.5。

放入4℃待用。

CCMB80 buffer 每升成分∙10 mM KOAc pH 7.0 (10 ml of a 1M stock/L) 0.98g∙80 mM CaCl2.2H2O (11.8 g/L) 11.8g∙20 mM MnCl2.4H2O (4.0 g/L) 4.0g∙10 mM MgCl2.6H2O (2.0 g/L) 2.0g∙10% 甘油(100 ml/L) 100ml备注：用0.1N HCl调pH至6.4（pH过高会使锰离子变成二氧化锰沉淀）。

无菌过滤后在4℃保存待用。

轻微的深色沉淀不影响其使用效果。

步骤：1.把TOP 10菌种接种至固体LB培养基中37℃过夜培养12 h。

2.挑取大小适当菌落至含10ml LB液体培养基的50 ml玻璃瓶中，置于37 ℃恒温摇床中过夜培养（摇床速度不可过慢，应让菌与空气、营养充分结合，以190左右为宜）。

12 h后观察培养液情况，可适当加长培养时间，但不可过久，因为感受态细菌传代越年轻越好。

3.吸取50μl菌液至于250 ml 配置好的SOB培养基中，至于37℃恒温摇床中培养。

开始时每30 min观察一次，以后每10 min观察一次。

当OD600值为0.3时（轻轻摇荡锥形瓶可见轻微云雾状混浊）立即取出把整个液体置于冰盒的冰面以下冷却待用。

4.将要使用的离心管、buffer在使用前均需置于冰上中降温待用。

无菌操作台、移液枪等在实用前均需用紫外消毒、酒精擦拭干净。

全国免费电话：400-818-1148TOP10 感受态细胞Cat. No. JH0102-3保存：-80℃组分说明产品简介本产品是大肠杆菌 TOP10 菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于 DNA 的热击转化。

TOP10 是一种常用于质粒克隆的菌株，其 φ80lacZΔM15 基因产物可与载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。

使用 pUC19质粒检测，转化效率可达 108，适用于高效的质粒 DNA 克隆并能保证高拷贝质粒的稳定复制。

注意事项1.转化所有步骤均在无菌条件下操作。

2.感受态细胞应在-80℃下保存，不可多次冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞的转化效率。

3.包装中有0.1 ng/μl 的pUC19DNA ，供对照试验使用。

操作步骤1.取感受态细胞置于冰浴中。

一次转化感受态细胞的建议用量为50-100 μl ，可以根据实际情况分装使用。

以下实验以100 μl 感受态细胞为例。

2.待感受态细胞融化后，向感受态细胞悬液中加入目的DNA （根据实际情况加入适量的DNA ，通常100 μl 感受态细胞能够被1 ng 超螺旋质粒DNA 所饱和），用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30分钟。

3.42℃热击90秒，迅速将离心管转移到冰浴中，冰上静置2-3分钟。

4.向每个离心管中加入900 μl 无菌的SOC 或LB 培养基（不含抗生素），混匀后置于37℃摇床，150 rpm 振荡培养45分钟使菌体复苏。

5.取100 μl 已转化的感受态细胞，加到含相应抗生素的SOC 或LB 固体琼脂培养基上，用无菌的涂布棒将细胞均匀涂开，直至干燥，倒置平板，37℃培养12-16小时。

注意：1） 涂布用量可根据具体实验调整。

若转化的DNA 总量较多，可取少量转化产物涂布平板；若转化的DNA 总量较少，可取200-300 μl 转化产物涂布平板。

若预计的克隆数较少，可通过离心（4,000 rpm ，2分钟）后吸除部分培养液，悬浮菌体后将其涂布于平板中。

常用大肠杆菌基础信息及使用说明常用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道菌群中的细菌，是一种革兰氏阴性菌，属于革兰氏阴性杆菌属中的大肠杆菌（Escherichia）属。

大肠杆菌长约2微米，呈棒状，通常是无运动的。

它是一种兼性厌氧菌，能够以不同的环境条件生存。

大肠杆菌广泛存在于自然界中，特别是动物的肠道中。

在人类肠道中，大肠杆菌具有重要的生理功能，保护肠道免受其他有害菌的侵袭，并参与食物消化和维持肠道的健康。

同时，大肠杆菌还对环境具有重要的指示作用，可作为一种指示性微生物来监测水质和食品的卫生状况。

大肠杆菌常用于实验室中的分子生物学研究和基因工程技术中。

它具有以下特点和优势：1.遗传稳定性：大肠杆菌具有较高的遗传稳定性和可操作性，其基因组较小、结构简单，易于研究和改造。

3.快速生长：大肠杆菌具有较快的生长速度，培养时间相对较短，便于实验操作和快速筛选。

4.易于培养和保存：大肠杆菌在实验室中培养相对简单，可通过液体培养和固体培养来获得足够的菌量。

同时，大肠杆菌具有较强的抗冷冻和抗干燥能力，便于保存和共享。

然而，使用大肠杆菌也存在一些注意事项和使用技巧：1.选择合适的菌株：根据实验需求选择不同的大肠杆菌菌株，如常见的DH5α、BL21等。

不同菌株具有不同的特性和表达系统，需根据实验目的进行选择。

2.处理菌株的遗传背景：大肠杆菌具有多样的遗传背景，可能会影响实验结果。

在进行基因表达、突变和克隆等实验时，需注意背景的一致性和对结果的可能影响。

3.增殖条件的优化：大肠杆菌对培养条件较为敏感。

在进行实验前，需对培养基、温度、pH值等条件进行优化，以获得最佳的菌落增殖情况。

4.严格控制污染：大肠杆菌在实验过程中容易受到其他菌株的污染，需进行严格的无菌操作，避免影响实验结果。

5.安全操作：大肠杆菌是一种被认为是相对安全的微生物，但仍需要注意避免直接暴露和接触，使用时应佩戴手套和实验室级别的防护措施。

常用大肠杆菌基础信息及使用说明菌株目录BL21 (2)BL21(DE3) (4)BL21(DE3)pLysS (6)BL21 Star(DE3) (8)BL21(AI) (10)OverExpress C43(DE3) (13)M15(pREP4) (15)CopyCutter EPI400 (16)Rosetta(DE3) (18)XL10 (20)Mach1-T1 (22)DH5a (23)TOP10 (24)BL21基因型F- dcm omp T hsd S(r B- m B-) gal产品说明作为E.coli B宿主菌，主要用来进行蛋白表达，细胞内缺少lon蛋白酶和ompT外膜蛋白酶，能够有效避免目的蛋白的降解；当使用CE6噬菌体启动子时，BL21感受态细胞对目的蛋白在未诱导情况下的蛋白表达严密控制；用于非T7启动子驱动的基因表达，表达水平极高。

操作方法1.BL21感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。

2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。

3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基(2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。

4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的2YT或LB培养基上。

5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。

Sample Induction Protocol (for reference only)1. Inoculate a single colony from a freshly streaked plate into 5 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic for the plasmid and host strain.2. Incubate with shaking at 200 rpm at 37℃overnight.3. Inoculate 50 ml of LB medium containing the appropriate antibiotic with 0.5 ml of the overnight culture prepared in step 2(use the 500 ml triangular flask as the container would be better).4. Incubate with shaking at 150 rpm at 37℃until the OD 600 reaches 0.5-0.8.5. (Optional)Pipet 1ml of the cultures into clean microcentrifuge tubes and place the tubes on ice until needed for gel analysis or storage at -20℃. These will serve as the non-inducedcontrol samples.6. Add IPTG to a final concentration of 1 mM. Optimal time for induction of the target protein may vary from 2-16 hours, depending on the protein.7. Incubate with shaking at 120 rpm at 37℃for 3-4 hours. To determine the optimal time for induction of the target protein, it is recommended that a time course experiment be performed varying the induction from 2-16 hours.8. Place the culture on ice for 10 minutes. Harvest cells by centrifugation at 5,000×g for 10 min at 4℃.9. Remove the supernatant and store the cell pellet at -20℃(storage at lower temperatures is also acceptabl e).IPTGPrepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) bydissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.BL21(DE3)基因型F- omp T hsd S B(r B- m B- ) gal dcm(DE3)产品说明BL21(DE3)菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体(如pET系列)的基因。

用氯化钙法制备大肠杆菌的感受态细胞，方法如下：①从野生Top10平板上挑取单菌落，接种于3ml LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；②以1%的接种量转接于20-40ml的LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD值为0.3-0.4时，将菌液置于冰浴中至少30分钟（目的：抑制大肠杆菌生长）③于4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，沉淀重悬于20ml预冷的0.1mol/L中，冰浴放置40分钟；CaCl2④4℃，4000rpm离心10分钟，弃去上清，加入2ml预冷的0.1mol/L CaCl（含210%甘油）重悬细胞，以每管100-200µl分装备用。

不及时使用的各管于-80℃保存。

注：细胞重悬时动作要尽量轻柔，切忌用枪吹打。

新鲜感受态不立即使用-80度冻几小时后再用效果可能会更好（2）热激转化感受态取感受态细胞，加入外源连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟混合物放入42C循环水浴中，90秒-2分钟立刻转到冰浴，冷却2分钟加入900UL培养基，37温育45-60分钟10000rmp离心半分钟，弃上清，留100-200ul混匀后均匀涂在含相应抗生素的琼脂平板上，倒置平皿，37培养过夜，菌落长出。

注：转质粒加入质粒1-2ul即可，且无须加800ul培养基孵育,热击冷却后直接涂板。

原理：其原理是：细菌处于0℃氯化钙低渗溶液中，细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基鸟磷酸复合物粘附于细胞表面；经42℃短时间热休克处理，促进细胞吸收DNA复合物。

在丰富的培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。

被转化的细菌中，重组的基因得到表达，在选择性培养基平板上可筛选出所需的转化因子。

CRISPR核酸酶载体试剂盒说明书目录内容和保存介绍产品信息方法实验轮廓设计单链DNA寡核苷酸产生双链寡核苷酸连接反应转化感受态E.coli细胞分析转化子转染哺乳细胞系附录ACRISPR核酸酶载体试剂盒的图谱和特点附属产品技术支持参考附录BCRISPR核酸酶表达细胞的富集内容和含量1.1 双链（ds）对照寡核苷酸序列ds 克隆对照的寡核苷酸的序列如下所列。

ds 克隆对照的寡核苷酸来自退火的，并在试剂盒中提供的50μM的双链寡核苷酸。

ds 克隆对照的寡核苷酸在应用于连接反应之前需要进行再退火和稀释。

5’ CATTTCTCAGTGCTATAGAGTTTT 3’3’GTGGCGTAAAGAGTCACGATATCT 5’1.2感受态细胞转化效率≥1×109 cfu/微克质粒DNA1.3 TOP10细胞的基因型F-MCRAΔ（MRR-hsdRMS-mcrBC）φ80lacZΔM15ΔlacX74recA1 araD139Δ（ARA-LEU）7697Galu galKpsL（STRR）endA1 nupG2 介绍2.1 产品信息2.1.1 介绍GENEART®CRISPR核酸载体试剂盒便于产生表达CRISPR RNA和tracrRNA的非编码RNA以及在哺乳动物细胞中Cas9核酸酶介导的靶基因的裂解或基因编辑的结构体。

该Cas9核酸酶是基于从细菌化脓性链球菌II型CRISPR/ Cas系统，并经过精心设计的基因组编辑在哺乳动物系统（Jinek等人，2012;。

Mali1等人，2013;。

cong等人，2013）。

带有OFP的GENEART®CRISPR核酸载体允许Cas9和CRISPR RNA的基于流式细胞仪表达的细胞群的分选，而带有CD4的GENEART®CRISPR核酸载体使Cas9与CRISPR RNA为基础的表达细胞的富集。

线性GENEART®CRISPR核酸载体提供快速和有效的方式来克隆编码所需CRISPR RNA靶到表达盒，允许Cas9核酸序列中的特定的方式靶向的双链寡核苷酸。

大肠杆菌克隆菌株TOP10和DH5α的比较大肠杆菌克隆菌株是一种经过基因工程改造的细菌，可以用于转化和扩增外源DNA，如质粒、文库或表达载体。

不同的克隆菌株具有不同的特性，如转化效率、抗性、突变、表达水平等。

本文将比较两种常见的大肠杆菌克隆菌株：TOP10和DH5α，分析它们的优缺点和价格。

TOP10的优缺点TOP10是一种来源于大肠杆菌K12的菌株，具有mcr/mrr突变，可以克隆甲基化的DNA，如真核基因组DNA。

它的基因型如下：•Top10：F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupGTOP10的优点主要有以下几个方面：•高转化效率：TOP10具有高达10^9 cfu/µg DNA的转化效率，这意味着它可以获得更多的重组菌株，提高克隆的成功率。

•低突变率：TOP10具有recA1突变，可以抑制同源重组，保持质粒的序列完整性。

•高稳定性：TOP10具有endA1突变，可以阻断内切核酸酶的表达，减少质粒DNA的降解。

它还可以在不含抗生素的培养基中维持质粒的复制。

•广泛的耐药性：TOP10具有多种抗性基因，如rpsL (StrR)、nupG等，可以使用多种抗生素进行筛选。

•高数据一致性：TOP10具有高度的基因组稳定性和质粒保留性，可以保证实验的可重复性和可靠性。

TOP10的缺点主要有以下几个方面：•高成本：TOP10的价格相对较高，可能超出一些实验室的预算。

•低表达水平：TOP10不适合用于蛋白表达，因为它缺乏一些必要的表达因子，如DE3溶原菌、T7 RNA聚合酶等。

•低兼容性：TOP10不适合用于一些特殊的载体，如含有重复序列的慢病毒载体和其它逆转录病毒载体，因为它可能会发生质粒的重组或缺失。

DH5α的优缺点DH5α是一种由Messing在1975年从大肠杆菌K12菌株中构建而成的菌株，具有mcr/mrr突变，可以克隆甲基化的DNA，如真核基因组DNA。

1：DH5a菌株DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。

E.coli DH5a在使用pUC系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补。

可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。

基因型：F-，φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，recA1，endA1，hsdR17(rk-，mk+)，phoA，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA12：BL21(DE3) 菌株该菌株用于高效表达克隆于含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因。

T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。

该菌适合表达非毒性蛋白。

基因型：F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）3：BL21(DE3) pLysS菌株该菌株含有质粒pLysS，因此具有氯霉素抗性。

PLysS含有表达T7溶菌酶的基因，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰目的蛋白的表达。

该菌适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。

基因型：F-，ompThsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3，pLysS，Camr4：JM109菌株该菌株在使用pUC系列质粒载体进行DNA转化或用M13 phage载体进行转染时，由于载体DNA产生的LacZa多肽和JM09编码的LacZΔM15进行α－互补，从而显示β－半乳糖苷酶活性，由此很容易鉴别重组体菌株基因型：recA1，endA1，gyrA96，thi－1，hsdR17，supE44，relA1，Δ（lac－proAB）/F’[traD36，proAB+，lacIq，lacZΔM15]5：TOP10菌株该菌株适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。

基因型：F- ，m crAΔ(mrr-hsd RMS-mcrBC)，φ80 ，lacZΔM15，△lacⅩ74，recA1 ，araΔ139Δ(ara-leu)7697，galU，galK，rps，(Strr) endA1，nupG6：HB101菌株该菌株遗传性能稳定，使用方便，适用于各种基因重组实验基因型：supE44，hsdS20（rB-mB－），recA13，ara－14，proA2，lacY1，galK2，rpsL20，xyl-5，mtl-1，leuB6，thi-17：M110或SCS110大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5位置上引入甲基。

几种常用的感受态细胞
DH5α
具有α-互补性，便于鉴别重组体菌株。

该菌株可用于制作基因库、进行亚克隆等，由于该菌株同时具有deoR 变异，可以作为较大质粒的宿主菌使用。

Stbl3
常规质粒制备的宿主菌，可进行蓝白斑筛选。

该菌株是复制慢病毒载体系统推荐使用的菌株，对慢病毒载体等较大的质粒转化的效果好，有效减低错误重组的可能性。

Top10
一种用于培养质粒平板和粘粒平板的大肠杆菌菌株，可用于蓝白斑筛选。

该菌株适用于DNA 克隆和质粒扩增，能保证高拷贝质粒的稳定遗传。

2T1
具有四环素抗性基因（TetR）；自身的ton A基因型能够阻止噬菌体T1和T5的感染；形成菌落时间较其他菌株快（约12小时），适合构建高质量的基因组文库。

BL21（DE3）
经过特殊改造的专门用来表达T7启动子启动基因的表达用大肠杆菌菌株。