医院实验室网织红细胞显微镜计数法操作规程

网织红细胞计数（Ret）【定义】网织红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟红细胞间的过渡细胞，属于尚未完全成熟的红细胞，其胞质中残存嗜碱性物质核糖核酸（RNA），经活体染色后，嗜碱性物质凝聚成蓝黑色颗粒，颗粒与颗粒连缀成线，线连接成网，故而得名。

【分型】根据网织红细胞发育阶段分为4型，分别是：Ⅰ型（丝球型）：红细胞充满网状物，见于骨髓。

Ⅱ型（网型）：红细胞网状物结构松散，见于骨髓。

Ⅲ型（破网型）：红细胞网状物结构稀少，呈不规则枝点状排列，见于外周血。

Ⅳ型（点粒型）：红细胞内为分散的细颗粒、短丝状网状物，见于外周血。

【检测原理】1.普通光学显微镜法2.网织细胞计数仪法和血液分析仪法【操作方法】1.显微镜试管法操作（1）加染液：于试管中加入10g/L煌焦油蓝生理盐水溶液2滴，再加新鲜血2滴，立即混匀，置37℃下15～20min。

（2）制片：取1小滴制成薄血涂片，自然干燥。

（3）观察：在低倍镜下选择红细胞分布均匀的部位进行观察。

（4）计数：在油镜下计数至少1000个红细胞中网织红细胞数。

（5）计算：网织红细胞分数=（计数的网织红细胞数）/1O00，网织红细胞绝对值（×109/L）=红细胞数×1012/L×网织红细胞分数。

2.显微镜法注意事项（1）网织红细胞必须活体染色，WH0推荐使用新亚甲蓝染液，其染色力强且稳定。

煌焦油蓝染液操作简单、费用低廉，但易产生沉淀、工作效率不高、精度差。

染液与血液比例以1:1为宜，严重贫血时，可适量增加血量。

（2）为提高网织红细胞计数精度和速度，ICSH推荐使用Miller窥盘，方法是将Miller 窥盘置于目镜内，选择红细胞散在且分布均匀的部位（3）用小方格（A）计数红细胞，大方格（B）计数网织红细胞，按下式计算：（4）注意鉴别网织红细胞与HbH包涵体。

Ret为蓝绿色网状或点粒状物质，分布不均，HbH包涵体为蓝绿色圆形小体，均匀散布于整个红细胞内。

网织红细胞计数操作规程目的：本实验旨在规范网织红细胞计数的标准操作，以确保实验数据的准确性。

原理：网织红细胞是未完全成熟的红细胞，其包体较一般红细胞稍大，胞浆中尚有嗜碱性残留物质，可被煌焦油蓝等染成蓝色颗粒状、线状及网状结构物。

网织红细胞的数量可用百分率或每立方毫米血液中的绝对值数来表示。

材料：煌焦油蓝（灿烂甲酚蓝）、枸橼酸钠、生理盐水、香柏油、载物片（玻璃片）、推片（磨去边的玻璃片）、试管（2ml）、毛细吸管或枪头（200微升）、光学显微镜。

操作规程：染色液配制：将煌焦油蓝0.4g和3.5%枸橼酸钠20ml研磨溶解后加入生理盐水至100ml，过滤备用。

室温下可保存6个月。

血膜片制备：1.染色：取试管一支，用毛细管或枪头于其中加入染液2～5滴，然后再加入新鲜血液1滴轻摇混合，染色10～15min。

2.制片：取载物片一片，用毛细管或枪头吸取血液染色液1小滴于载物片上，并用推片约45度角推制成舌型血膜片，自然干燥备用。

3.观察：用显微镜观察，取血膜片滴入香柏油1滴，将血膜片置于显微镜载物台，用油镜观察网织红细胞。

4.计数：取计数器在油镜下检查计数红细胞，即计数红细胞中网织红细胞的数量，检查计数1000个红细胞中网织红细胞的数量，并得出千分率再除以10即为百分率。

计算公式：百分率=1000个红细胞中网织红细胞的数量/1000注意事项：1.载物片使用前必须经过酸或碱液浸泡脱脂处理后方可使用。

2.血膜片制备需要反复练推片，熟练推制血膜片的技巧。

3.血膜片的厚薄要适中，过厚或过薄均无法进行观察。

4.室温过低时，血液染色时间要适当延长，以确保细胞着色更充分。

5.血膜片需在3天内检查计数，否则其网状结构会褪色，不易观察清晰。

网织红细胞计数法的流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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实验中网织红细胞检查方法-显微镜目测法网织红细胞的检测方法有显微镜目测法、网织红细胞计数仪、流式细胞仪、多参数血细胞分析仪四种方法。

1. 显微镜目测法：人工计数1000～2000个红细胞，网织红细胞所占百分数。

受主观因素影响较大，结果与染色部位、染色时间、燃料与血液的比例有关，准确性较差。

2. 网织红细胞计数仪：网织红细胞计数仪是专门进行网织红细胞测定的仪器，可自动染色、自动分析、自动打印各阶段网织红细胞分布图，结果准确，但仪器昂贵且单一难以广泛应用。

3. 流式细胞仪：流式细胞仪将红细胞染色后将含有RNA的网织红细胞计数，但它不能分析其成熟程度。

4. 多参数血细胞分析仪：为网织红细胞计数提供了先进的测量手段，这类仪器采用荧光染色和激光测量的原理，不但能客观准确计数、测量网织红细胞，而且还能根椐其RNA含量，估计网织红细胞的成熟程度，其最大的优势是对网织红细胞分群，客观地将网织红细胞分成高荧光强度网织红（HFR：属早期网织红），中荧光强度网织红（MFR：属中期网织红），低荧光强度网织红（LFR：属晚期网织红），同时还能提供网织红细胞中的血红蛋白含量（CH-r）等参数，这些指标对临床及科研颇有价值。

受仪器局限性，下面重点介绍显微镜目测法。

5 所需器材及耗材5.1 器材：显微镜、小试管（0.6×8.0 cm）、载玻片、推片、专用玻棒、计数器。

5.2 耗材：0.4%新美兰溶液、镜油、二甲苯、擦镜纸、试管塞。

6 染色6.1 往小试管中加2～3滴新美兰溶液。

6.2 采待检动物静脉血2～3滴，立即加入试管中，摇匀、盖上试管塞。

6.3 将试管静置15～20 min。

7 涂片7.1 拿一张干净的载玻片，取一小滴血和美兰的混合液（约大米粒大）置于载玻片的一端。

7.2 用一干净的推片一端放在血滴前方，逐渐后移接触血滴，血液可立即沿推片边缘散开。

7.3 将推片与载玻片保持30～45°角，平稳的向前推动至载片的另一端，使载片上留下一层薄血膜。

网织红细胞计数标准操作程序1 方法试管染色法。

2 原理网织红细胞是尚未完全成熟的红细胞，其胞浆内尚存在有嗜碱性的RNA物质，经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染色后呈浅蓝色或深蓝色的网状结构。

网织颗粒越多，表示红细胞越未成熟。

3 试剂网织红细胞染色液：3.1品牌：珠海贝索生物技术有限公司（BASO diagnostic, Inc）3.2包装规格：2瓶×100ml3.3主要成份：新亚甲蓝3.4储存条件：室温（15℃～30℃），相对湿度不大于80%，无腐蚀性气体和痛风良好的室内保存。

3.5使用期限：2年（开瓶后效期为6个月）。

3.6注意事项：避免高、低温环境及阳光直射。

4 实验器材显微镜、滴管、载玻片、推片、香柏油、擦镜纸、乳胶手套、试管架、移液器等。

5 标本要求5.1标本必须为末梢血或EDTA-K2抗凝的静脉血。

静脉采血后立即与抗凝剂混匀，放置室温立即送检。

5.2 标本在室温下最多保留4小时。

不能在4小时内检测的标本，放置于冷藏冰箱（2℃~8℃）中保存，8小时内标本有效，使用前从冰箱中取出回复室温后检测。

6 操作步骤6.1于0.5ml 试管内加入20μl网织红细胞染色液。

6.2取血液20μl，加入试管内，混匀，盖紧盖子，并标记相应标本号。

6.3静置20分钟或更久。

6.4推成薄片2张，待干。

6.5在油镜下选择红细胞分布均匀，染色较好部位，每张片子检查1000个红细胞中网织红细胞数，算出百分率，以均值报告。

7 计算网织红细胞数（%）= 1000个红细胞中网织红细胞的数目×1001000如：玻片1：油镜下计数1000个红细胞时见10个网织红细胞，则网织红细胞的相对比值为：网织红细胞数1（%）=10×100=1.0 % 1000玻片2：油镜下计数1000个红细胞时见12个网织红细胞，则网织红细胞的相对比值为：网织红细胞数2（%）=12×100=1.2 % 1000最终，网织红细胞数（%）= 1.0% + 1.2%×100=1.0 % 28 参考范围0.5% -1.5%9 临床意义网织红细胞的多少可反映骨髓造血功能的情况。

网织红细胞计数标准操作程序
网织红细胞计数标准操作程序
一.目的：规范网织红细胞计数标准操作
二.适用范围：适用于镜检法网织红细胞计数
三.支持性文件：全国临床检验操作规程第三版
四.原理：煌焦油蓝染色法。

五.仪器：OLYMPUS CX21光学显微镜
六.试剂煌焦油蓝液
七.样本要求：新鲜全血。

八.操作步骤：
1．取小试管一支，滴加40ul网织红细胞染色液。

2．加入末梢血40ul于上述试管中，混匀。

3．静置15～20min后，取用l滴制成薄片。

4．油镜下检查1000个红细胞中网织红细胞数，以百分率或绝对值报告。

5.计算网织红细胞百分率=所数网织红细胞数*100%/1000
九.参考范围：
成人：0.005-0.015(0.5%-1.5%)
新生儿:0.03-0.06(3%-6%)
十.注意事项：
1．最好制片2张，每张计数500个红细胞，避免分布不均引起的误差。

涂片要薄而均匀，不使红细胞重叠。

2．为计数方便，可于目镜中放一中间有孔之硬纸片，缩小视野，便于计数。

3．试剂应定期重配，以免变质沉淀。

4．因操作误差大，不宜用玻片直接染色法。

红细胞计数显微镜法的详细步骤
1准备工作
要进行红细胞计数显微镜法的测定，首先要准备的是，一种含有稀释剂的液体，一张安装有凹片的显微板，和一台能实现显微镜放大的显微镜。

2稀释血液
先使用专业独立实验室管理中的封闭式试剂盒灌装安全运输血液，并将其添加至特定的稀释剂中，并在盒内放置事先确定的稀释剂，打开试剂盒，将血样加入稀释剂中，用搅拌器搅拌，当它们混合在一起，使红细胞在每毫升中达到相应的浓度时，即可稀释至处理所需的浓度。

3涂取稀释血液
将准备好的显微板安装在显微镜上，将步骤2中稀释后的血液涂取于板上，使得红细胞集中形成凝团，形成视野，然后放大显微镜，清晰观察红细胞。

4计数红细胞
调整显微镜焦距，使眼视野面积内观察出红细胞的凝团，每计算20个凝团，将它们的位置标记在安装在显微镜的计数网上，再重新调整焦距，将新的凝团搜索出来，测算血液中的红细胞数量，根据测计的数量，了解此患者血液中的红细胞分布和状况。

5记录结果
将测量的结果记录在实验簿上，注明该实验例的序号，记录结果，包括日期，体温，血液浓度，从而实现观察和分析红细胞数量的变化，同时，利用实验法观察出的现象，并与医学理论结合起来，诊断出患者的疾病，有利于对相关治疗进行科学判断和把握。

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