细菌检验的基本技术
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一. 细菌检验的基本技术
1.1 无菌技术
1.2 细菌形态学检查方法
1.3 培养基
1.4 消毒灭菌
二.日常检验工作涉及的项目
2.1菌落总数
2.2大肠菌群
2.3金黄色葡萄球菌
2.4沙门氏菌
2.5 大肠埃希氏菌
2.6志贺氏菌
三.生物安全基本知识
3.1生物安全柜的使用
3.2移液管和移液辅助器的使用
3.3废弃物处理
3.4感染性物质防护技术
3.5微生物实验室容器破碎及感染性物质溢出的应急处理
一. 细菌检验的基本技术
1.1 无菌技术
无菌：指物体上不存在活菌。
无菌操作：防止微生物进入机体或其他物品的操作技术。
微生物检验样品的全部过程必须保证无菌操作，必须严格执行无菌操作技术，防止污染和病原菌的扩散。在进行无菌操作时应注意以下要点：
1.1.1进行接种、倾注琼脂平板等均须在无菌室或超净工作台内进行。以防杂菌污染。
1.1.2无菌室在使用前，用紫外灯照射30min至1h或用5%石炭酸或5%来苏喷雾消毒。
1.1.3所用的物品均应在使用前严格进行灭菌，在使用过程中不得与未经灭菌的物品接触，如不慎碰着应立即更换无菌物品。
1.1.4 、所有的技术操作要按尽量减少气溶胶和微小液滴形成的方式来进行。
1.1.5 接种环（针）在每次使用前后，应在火焰上彻底烧灼灭菌。
1.1.6 应采用机械移液器。禁止用口移液，注射器不能用于吸取液体。
1.1.7从培养瓶或试管培养物中取标本或移种时，在打开瓶塞后及塞回前，管（瓶）口部应通过火焰1～2次，以杀死可能附着管口或瓶口的细菌。开塞后的管口或瓶口应尽量靠近火焰，试管及烧瓶应尽量平放，切忌口部向上和长时间暴露于空气中。 1.2细菌形态学检查方法
细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一。它可用于细菌的分类与鉴定，并为进一步作生化反应、血清学鉴定提供依据。
在我们检验中经常会遇到对所要鉴别的细菌进行染色。细菌染色的基本程序是：
涂片（干燥）→固定→染色（媒染）→（脱色）→（复染）
常用的细菌染色法：
单染色法
复染色法：
1．革兰染色法
是细菌学中最经典、最常用的染色法之一。
操作程序：细菌标本固定后，先用结晶紫初染，再加碘液媒染，然后用95%乙醇脱色，最后用沙黄（或复红）液复染。通过此染色法可将细菌分成两大类：不被乙醇脱色仍保留紫色的革兰氏阳性菌；被乙醇脱色后再被复染成红色的革兰阴性菌。
2．抗酸染色法 分枝杆菌属为抗酸性细菌须用抗酸染色法。
3．细胞壁染色法 本法是特殊染色法之一。
4．特殊结构染色法 对细菌的特殊结构，如芽孢、鞭毛、荚膜等，用普通的单染色法或上述的复染色法均不易着色，必须用相应的特殊染色法才能显示其结构。
5．负染色法 是指背景着色而细菌本身不着色。 1.3 培养基
1.3.1培养基的分类
按使用时的不同的形态，培养基可分为：液体培养基、流体培养基、半固体培养基、固体培养基四种。根据不同用途，培养基又可分为：基础培养基、增菌培养基、滋养培养基、选择性培养基、鉴别培养基、生化培养基、厌氧培养基。
1.3.2培养基的质量检测
每批培养基制备完后，应进行下面检查：
看容器有无破损，培养基色泽是否正常，特别对含指示剂的培养基色泽检查更为重要，液体培养基的澄清度，固体培养基有无沉淀物，pH是否正常，软硬度要适宜；将制好的培养基置36℃培养箱中过夜培养，看有无细菌生长，还应用已知的标准菌株或参考菌株对培养基进行性能测试。
1.4消毒和灭菌
消毒和灭菌的基本常识对于实验室生物安全是至关重要的。
1.4.1概念
消毒（disinfection）：杀死微生物的物理或化学手段，但不一定杀死其孢子。
灭菌（sterilization） ：杀死和／或去除所有微生物及其孢子的过程。
消毒处理不一定都能达到灭菌要求，而灭菌一定可以达到消毒目的。
1.4.2常用的热力灭菌法：分为干热灭菌法和湿热灭菌法两大类，在同一温度下，后者的效力比前者大。
干热灭菌法：烧灼 ：接种环、接种针、瓶口 试管口常在火焰上烧灼。
干烤： 在密闭干烤箱内加温至160～170℃维持2 h。对一般玻璃器皿、注射器、瓷器等的灭菌方法。
焚烧： 对实验动物尸体或废弃物品的灭菌。
湿热灭菌法：巴氏消毒法、煮沸法、间歇蒸汽灭菌法、
高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法是对实验材料进行灭菌的最有效和最可靠的方法。灭菌的温度取决于蒸汽的压力，在一个大气压下蒸汽的温度是100℃，在密闭的容器中随着压力升高蒸汽的温度也相应升高。在103.4kPa（15磅/英寸2）、121℃ 、15min-20 min 可以确保正确装载的高压灭菌器的灭菌效果。适用于普通培养基、生理盐水等。
1.4.3 紫外线消毒法
波长在240-300nm的紫外线具有杀菌作用，紫外线主要作用于DNA，干扰DNA 的复制与转录，导致细菌的变异或死亡。紫外线穿透力较弱，故一般用于空气或不耐热物品表面消毒。
二.日常检验工作涉及的项目
2.1菌落总数 菌落总数是指被检样品经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1 ml(g)检样中或单位表面积所含菌落的总数。
卫生学意义：菌落总数是用来判定检样被细菌污染程度及其卫生质量的指示菌。它反映食品在生产加工过程中是否符合卫生要求，从原料加工到成品包装受外界污染的情况，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供科学依据。
应该说明的是，菌落总数的测定，一般采用营养琼脂培养基，在37℃有氧条件下培养（空气中含氧约占20%），因此不能测出每克或每毫升检样中实际的总活菌数。因为厌氧菌、微需氧菌、嗜冷菌或嗜热菌以及有特殊营养要求的细菌，在此条件下或不能生长或不能很好地生长。因此用目前方法所获得的结果，只能包括需氧或兼性厌氧的、嗜中温的、能在普通营养琼脂上生长的一群细菌的菌落数，它必然低于实际存在的活菌数，也不能表明污染菌的种类。又由于检品中的细菌细胞可以是单个、成对、成链状、或成堆的形式存在，因此在琼脂平板上出现的菌落不一定都是单个菌细胞形成的菌落，也可能由非单个细胞形式分裂增殖堆积而成，所以不宜报告为细菌总数，而以报告单位重量、容积、表面积或体积内菌落形成单位数（colony
forming unit, cfu）更科学合理。
菌落计数所选择的稀释度，应保证平板菌落数在规定的范围内,
30～300 个（如 GB/T 4789.2 -2003 ）、 25～250 个 如〔SN 0168 -1992 、FDA《 细菌分析手册―需氧菌平板计数 》，或 15～300 个（如 ISO 4833 : 1991 《 微生物学 大肠杆菌菌落计数通用指南最大可能数技术》）等。
菌落计数前先观测菌落生长的情况，一般同一稀释度的平板上的菌落数应相近，不同稀释度平板上的菌落数则应与稀释倍数成反比。蔓延菌落的生长会抑制其他菌株的生长，或者会覆盖其他的小菌落，所以最好不要选择有蔓延菌落生长的平板作为计数平板，但如必须选择，应在记录中标记清楚。如片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘 2 以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界限），若只有一条链可视为一个菌落，如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。当每个稀释度制备了两块平板时，用所选择的平板的算术平均值来计算原始样品中的微生物的含量。样品的菌落数等于每克或每毫升的cfu值除以稀释度。
报告方式：
空白对照实验：
2.2大肠菌群
大肠菌群或称总大肠菌群是指一群能在37℃条件下发酵乳糖产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。符合这些条件的肠杆菌科细菌主要包括4个菌属：
埃希氏菌属，在此菌属中与人类生活密切相关的仅有一个种，即大肠杆菌； 其次有柠檬酸杆菌属，其代表种有弗劳地枸橼酸杆菌；
克雷伯氏菌属，代表种为肺炎克雷伯氏菌；
肠杆菌属，代表种有阴沟杆菌和产气杆菌。
大肠菌群卫生学意义：
大肠菌群主要来源于人、畜粪便。大肠菌群是反映食品中是否存在粪便污染的指示菌，食品中有粪便污染，则可推测该食品中存在着肠道致病菌污染的可能性，潜伏着食物中毒和流行病的威胁，同时也反映出被测食品对人体健康存在危害。大肠菌群检测已被广泛应用于食品卫生工作中。
检验的标准通常使用GB/T 4789.3-2003、SN 0168-92
检验中需了解和注意事项：
1. 挑选菌落
在实际工作中，为了提高大肠菌群的检出率，应当熟悉大肠菌群的菌落色泽和形态。在GB/T 4789.3-2003检验方法中规定伊红美蓝平板为分离培养基，在该平板上，大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽，检出率为最高；红色、粉色菌落检出率较低。
2. 发酵管的产气量
在日常工作中，有时在发酵倒管内有极微小的气泡（有时比小米粒还小），有时可遇到在初发酵时产酸未产气，但在液面及管壁却可以看到缓缓上浮的小气泡。这种情况大肠菌群的阳性检出率能达到30%-50%。所以不能忽视产气量少的，对未产气的乳糖发酵管如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。
3. 抑菌剂
大肠菌群检验中常用的抑菌剂有胆盐、十二烷基硫酸钠、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。抑菌剂可抑制样品中的—些杂菌，特别是G+的生长，而有利于大肠菌群的生长和挑选。
GB/T 4789.3-2003中乳糖胆盐发酵管利用胆盐作为抑菌剂，SN
0168-92中LST肉汤利用十二烷基硫酸钠（月桂基）作为抑菌剂，BGLB肉汤利用煌绿和胆盐作为抑菌剂。
2.3金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、土壤、水、饲料、食品、灰尘及人和动物的排泄物中都可以存在。因此，食品受污染的机会很多，是引起食品污染和细菌性食物中毒的一种重要细菌。由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒已成为世界性的卫生问题。
一. 生物学特性：
1. G+、需氧或兼性厌氧，通常在肉浸液肉汤及肉浸液琼脂或加入血液的培养基上生长良好。
2. 耐盐性强。10%-15%的氯化钠培养基中能生长。
3. 在血琼脂上，几乎所有的葡萄球菌可产生α、β、γ和δ溶血素（一种或一种以上）。多数致病菌株可产生透明溶血环，菌落呈金黄色，有时也为白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。
4. 葡萄球菌是无芽胞菌中抵抗力最强者，耐干燥可达数月，加
