大肠杆菌的转化、扩增及一些基础的实验前准备

实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的1.了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点;2.质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法.二、实验原理外源DNA只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增，而大肠杆菌转化实验的技术关键就是制备感受态细胞，即应用一些特殊方法（如点击法，CaCl2处理）处理后，使细菌细胞膜通透性发生暂时的改变，处于能允许外源DNA分子进入的状态，即为感受态细胞。

CaCl2转化法的基本原理是细菌在低温，低渗（0℃0.1mol/LCaCl2）的溶液中，菌体细胞膨胀成球形，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，外来的DNA可形成抗DNase的羟基--钙磷酸复合物黏附于细胞表面，经42℃短暂热冲击处理，促使DNA复合物进入细胞，从而实现外源基因的转化。

三、实验材料（一）样品1.连接了目的基因的重组体分子2.细菌——大肠杆菌DH5α菌株：R （限制酶缺陷型），M（甲基化修饰缺陷型），Amp。

（二）试剂1.LB固体和液体培养基（营养培养基）和含Amp的LB固体培养基（选择培养基）；2.氯化钙溶液（1）0.01mol/Lcacl2溶液：称取0.56g无水cacl2（分析纯），溶于50ml水中，定容至100ml，高压灭菌后备用。

（2）保存液（含15%甘油的0.01mol/Lcacl2）：称取0.56g无水cacl2（分析纯），溶于50ml 水中，加入15ml甘油，定容至100ml，高压灭菌后备用。

3.氨苄青霉素（Amp）母液配成100mg/ml水溶液，-20℃保存备用。

（三）仪器及器材①超净工作台；②恒温摇床；③离心机；④V-1100分光光度计；⑤水浴锅；⑥微量移液器。

四、实验步骤（一）操作步骤1.感受态细胞的制备和保存感受态细胞的制备试验步骤步骤操作（1）细菌小量培养从LB平板上挑取新活化的E.coliDH5α单菌落，接种于3-5mlLB液体培养基中，37℃180r/min震荡培养过夜（2）扩大培养取细菌悬液1ml，以1:100的比例接种于100mlLB液体培养基中，37℃震荡培养1-2h至A600=0.5左右（3）收集菌体将培养液转入离心管中，冰上放置10min，然后4℃5000r/min离心10min，弃上清（4）cacl2处理菌体加入1/10体积（10ml）0-4℃预冷的无菌cacl2（0.01mol/L）溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置10min后，4℃5000r/min离心10min，弃上清（5）感受态细胞的手机与分装加入2000ul预冷的无菌cacl2e(0.01mol/L)重新悬浮细胞，分装成100ul备用（6）长期保存加入1600ul预冷的无菌cacl2(0.01mol/L)和400ul无菌的70%甘油轻轻悬浮细胞或直接加保存液200ml，冰上放置几分钟后，分装成100ul小份，液氮速冻10min后，-70℃保存备用2.转化DNA转化实验步骤步骤操作（1）冰浴取100ul感受态细胞悬液，在冰浴中加入10ul连接产物（或质粒DNA）（含量不超过50mg，体积不超过10ul），轻轻混匀，冰上静置30min（2）热击转化产物在42℃水浴中热击90s（勿摇动，勿超时），之后迅速置于冰上冷却2min（3）复苏向管中加入1mlLB液体培养基，37℃，100-180r/min震荡培养45min至菌液肉眼观察到轻微浑浊（4）涂板，培养取上述菌液100ul涂板，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，37℃倒置培养12-16h（二）注意事项1.细胞的生长状态和密度。

科隆生物医学有限公司·保密大肠杆菌基因电转化(1)(制剂范围可以放大或缩小）感应态菌制备培养液和制剂：-无任何抗生素及含有氨苄青霉素/ carbnicillin或其他适当抗生素的LB平板-2×LB或YT培养基500毫升-SOC培养基-冰冷的高压灭菌去离子水：1000毫升-冰冷的高压灭菌10 ％甘油（500毫升）-预冷却的50ml离心管，离心管和电转移杯。

方法：1．从一个新鲜的琼脂平板上接种单个大肠杆菌单菌落到含有5ml的2 ×YT培养基的烧瓶中。

孵育培养5小时或过夜，于37℃和250rpm旋转振荡器培养。

2 。

用5ml过夜的细菌培养物接种到在2升烧瓶中500毫升预热的2 ×YT培养基中。

于37℃搅拌下（250转的旋转振荡器）。

一个小时以后，每20分钟测定OD600值。

3 。

当培养物的OD 600达到0.2.5-0.3 ，迅速将烧瓶转移到冰水浴中15-30分钟。

偶尔转动培养瓶以确保冷均匀。

4 。

转移培养物至50ml冰冷的离心瓶。

在4500rpm和在2 ℃下离心10分钟，收获细胞倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水并在2 ℃下孵育3分钟。

5 。

通过在2 ℃下离心10分钟收获细胞（4500rpm）, 倒出上清液和重悬细胞沉淀在50毫升冰冷的纯水中并孵育3分钟。

6 。

通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬细胞沉淀在25毫升冰冷的10％甘油中。

7 。

通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），倒出上清液和重悬沉淀在10毫升冰冷的10 ％甘油。

8 。

通过在2 ℃下离心15分钟收获细胞（4500rpm），小心地倒出上清液，并使用巴斯德吸管残余水滴。

合并和重悬沉淀于1毫升冰冷的10 ％甘油。

9 。

测量1:100稀释的细胞悬浮液的OD600值：用冰冷的10％甘油稀释细胞悬液，然后测定。

浓度应是2× 1011到3× 1010个细胞/ ml 〜OD = 800 -120 （1.0 OD 600 =约2.5× 108细胞/ ml）。

大肠杆菌感受态制备及转化大肠杆菌（Escherichia coli）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，常见于土壤、水体、人和动物的肠道等地方。

由于其易于培养和操作，成为生物学研究中常用的实验材料。

本文将介绍大肠杆菌的感受态制备及转化的过程。

感受态制备是指将大肠杆菌细胞从冻存状态恢复到活跃状态的过程。

为了保证感受态制备的成功，首先需要准备培养基和细菌菌种。

常用的培养基有LB培养基和SOC培养基，其中LB培养基适用于大肠杆菌的一般培养，SOC培养基则适用于感受态制备和转化实验。

培养基的配制需按照实验要求进行，注意消毒措施，避免污染。

感受态制备的过程一般包括以下几个步骤。

首先，将冻存的大肠杆菌菌种转移到预先加热的LB培养基中，进行孵育培养。

培养温度和时间根据实验需要进行调整，通常为37摄氏度下培养12-16小时。

其次，将培养物进行稀释，使其浓度适合后续实验操作。

最后，将稀释后的细菌液进行离心，去除上清液，沉淀后的菌体即为感受态大肠杆菌。

感受态大肠杆菌的转化是指将外源DNA导入到大肠杆菌细胞中的过程。

转化的前提是大肠杆菌细胞处于感受态，即细胞膜对外源DNA具有较高的通透性。

转化的关键是选择合适的质粒载体和转化方法。

常用的质粒载体有pUC19、pGEM-T等，这些载体具有含有抗生素抗性基因的特点，可以通过抗生素的选择来筛选转化成功的细菌。

质粒载体通常通过限制酶切与外源DNA进行连接，形成重组质粒。

将重组质粒与感受态大肠杆菌进行转化后，通过培养在含有抗生素的培养基上筛选，即可得到含有目标基因的转化菌落。

转化的方法有热激法、电穿孔法和化学法等。

热激法是将感受态大肠杆菌与重组质粒混合后，在高温条件下进行短暂的热冲击，使细菌细胞膜通透性增加，促进外源DNA的摄入。

电穿孔法是利用电场作用使细菌细胞膜产生孔隙，使外源DNA通过孔隙进入细胞。

化学法则是利用化学试剂改变细菌细胞膜的性质，增加其对外源DNA的吸收能力。

转化后的菌落需要进行筛选，常用的方法是通过抗生素选择。

wp_240768786基因在大肠杆菌中的过表达实验的实验内容基因在大肠杆菌中的过表达实验是一种常用的实验方法，通过引入外源表达载体，将感兴趣的基因在大肠杆菌中过量表达，从而研究该基因在生物体中的功能、调控机制和相互作用等方面的问题。

本文将介绍基因在大肠杆菌中过表达实验的实验内容。

一、实验前的准备工作1.选择合适的表达载体：通常采用静态表达载体，如pUC19，pBluescript等，或动态表达载体，如pET系列，pGEX系列等。

2.克隆目标基因：使用PCR或其他克隆方法从原始样本中扩增出目标基因，并通过酶切与载体连接。

3.转化大肠杆菌：利用热激转化、电穿孔转化等方法将重组载体转化到大肠杆菌中。

二、基因克隆与构建表达载体1.通过PCR扩增基因：设计引物，利用PCR技术从模板DNA中扩增目标基因。

2.准备载体：选择适当的表达载体，并通过限制性内切酶酶切开，以便与PCR扩增的基因片段连接。

3.构建重组载体：将PCR扩增的目标基因片段与线性化的载体连接，利用连接酶如T4 DNA连接酶处理，并通过热激转化等方法将重组载体转化到大肠杆菌中。

三、大肠杆菌中的基因过表达1.筛选阳性克隆：将转化后的大肠杆菌克隆在含有适当抗生素的培养基上培养，选择阳性克隆并进行验证。

2.静态表达或动态表达：根据需要选择适当的表达载体和表达系统。

四、鉴定表达产物1.确定表达水平：通过聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质质谱、Western blot、酶联免疫吸附实验（ELISA）等方法，检测表达基因的存在和表达水平。

2.验证表达产物功能：通过下游分析，如活性酶测定、免疫组化、免疫印迹等方法，评估过表达产物的功能和活性。

五、研究过表达基因的功能和调控机制1.功能研究：通过过表达基因后的表型观察，如细胞生长、代谢物产量、酶活性增加等，评估基因表达对细胞生理过程的影响。

2.亚细胞定位：通过融合表达产物与荧光标记或标示剂相结合等方法，观察基因表达产物在细胞中的定位，从而推测其功能和组织定位。

大肠杆菌培养步骤方法大肠杆菌是一种重要的细菌，它在实验室中被广泛用于分子生物学研究和基因工程。

下面是大肠杆菌的培养步骤方法，共50条，并展开详细描述：1. 准备所需的培养基及试剂，包括琼脂、培养基粉、蔗糖、牛肉膏、酵母提取物、氯化钠、磷酸二氢钾等。

2. 将琼脂及培养基粉加入适量蒸馏水中，搅拌均匀后加热至沸腾，然后灭菌。

3. 将灭菌后的琼脂培养基倒入培养皿中，使其凝固成固体琼脂。

4. 取出实验室保存的大肠杆菌菌种，用无菌吸管从存储容器中取出适量菌液。

5. 将菌液均匀地涂布在琼脂培养皿表面，待其吸收后轻轻晃动培养皿使其均匀分布。

6. 将涂布好的培养皿倒置放入孵化箱中，以37℃恒温孵育。

7. 每隔一段时间观察培养皿上的菌落形成情况，选择合适的菌落进行分离和培养。

8. 在培养过程中，注意观察是否有任何异常，如细菌变异、污染等情况。

9. 定期检查培养基的PH值和温度，保持在适宜的范围内。

10. 当需要保存大肠杆菌菌株时，可以将单一菌落悬浮在无菌离心管中，并添加10%甘油保藏在-80℃低温库中。

11. 每次操作前要做好无菌操作，以避免外源菌的污染。

12. 大肠杆菌培养时，应严格控制氧气供应，可以选择静态培养或者摇瓶培养。

13. 在摇瓶培养中，要保持培养液的充分通气，防止细菌缺氧而死亡。

14. 对于含氧厌恶的大肠杆菌菌株，可以选择在含葡萄糖并定期通氮气的缺氧箱中进行培养。

15. 大肠杆菌培养皿观察时，可使用显微镜进行观察，观察菌落形态、大小和颜色等特征。

16. 对于选择性培养基的应用，可以根据需要添加抗生素或者其他选择性物质来筛选感兴趣的菌株。

17. 在进行大肠杆菌培养时，要注意控制培养基的含盐量和碳源，以及其他微量元素的添加。

18. 可以通过PCR或者其他分子生物学方法快速鉴定大肠杆菌的种属和亚种属。

19. 在大肠杆菌的培养中，要注意排放生物危害废弃物，并采取相应的安全防护措施。

20. 大肠杆菌培养时，要做好相关记录，包括菌种信息、培养条件、观察结果等。

大肠杆菌扩大培养操作规程一、实验目的本操作规程旨在指导实验人员进行大肠杆菌的扩大培养，以获取足够量的菌液用于后续实验。

二、实验材料和设备1.大肠杆菌菌株（可从实验室或商店购买）2.LB培养基（Luria-Bertani）3.营养琼脂（可从实验室或商店购买）4.实验室培养皿（含有适当孔径的培养皿）5.离心管（容量应能满足培养菌液的要求）6.培养箱7.培养炉8.离心机9.移液器和吸头三、实验步骤1.准备工作a.准备好所需的培养基（LB培养基），并按照说明配制。

b.准备好所需的培养皿，确保培养皿的洁净无菌。

2.菌种接种a.将大肠杆菌菌株从保存的冰冻物中取出，解冻后立即进行接种操作。

b.取一小部分菌落，用移液器吸取，并迅速加入培养基中。

3.培养菌液a.将接种好的培养基转移到离心管中，每支离心管装满约1.5ml培养基。

b.离心管盖紧，轻轻倒置数次，使菌液均匀分布。

c.将离心管放入培养箱中，设定适当的温度和时间进行培养。

4.培养基上菌液的涂布a.准备好干净的培养皿，并倒入约20ml的营养琼脂。

b.等菌液培养时间结束后，将培养液转移到干净的离心管中。

c.打开离心管盖，将菌液均匀涂布在培养皿上，用酒精灯或酒精棉球消毒铁环，按图案转移到培养皿上。

d.将培养皿盖紧，倒置放置，避免细菌污染。

5.培养皿的培养a.将培养皿放入培养炉中，设定适当温度进行培养。

b.培养温度一般为37°C，培养时间根据实验需要而定，一般为16-24小时。

6.菌落计数a.培养时间结束后，从培养箱中取出培养皿。

b.用目镜观察培养皿上的菌落，记录菌落的数量和特征。

c.如需进一步使用扩大菌液，可将菌落转移到离心管中进行保存。

四、注意事项1.操作过程需保持洁净无菌，避免细菌污染。

2.温度和时间的选择应根据实验需要和大肠杆菌的培养特性来确定。

3.使用离心机时要注意转速和离心时间的设置，避免菌液的氧化破坏。

4.涂布菌液时注意均匀和无气泡的涂布，以获得准确的菌落计数结果。

大肠杆菌化转流程大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的革兰氏阴性细菌，在生物学研究、基因工程和生物技术等领域有着广泛的应用。

其中，大肠杆菌的化学转化（Chemical Transformation）是将外源 DNA 导入大肠杆菌细胞的重要方法之一。

下面将详细介绍大肠杆菌化转的流程。

一、实验准备1、菌株与质粒选择适合化学转化的大肠杆菌菌株，如DH5α、TOP10 等。

准备待转化的质粒 DNA，确保其质量和纯度。

2、试剂与器材氯化钙（CaCl₂）：用于制备感受态细胞。

培养基：如 LB 培养基。

离心管、移液器、冰盒、恒温水浴锅、离心机等。

二、感受态细胞的制备1、从新鲜的 LB 平板上挑取单菌落，接种于 3 5 mL LB 液体培养基中，37℃，200 250 rpm 振荡培养过夜。

2、按 1:100 的比例将过夜培养物转接至新鲜的 LB 液体培养基中，继续培养至 OD₆₀₀约为 03 05。

3、将菌液转移至预冷的离心管中，冰浴 10 15 分钟。

4、 4℃，4000 rpm 离心 10 分钟，弃上清。

5、加入预冷的 01 M CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰浴 30 分钟。

6、 4℃，4000 rpm 离心 10 分钟，弃上清。

7、加入适量预冷的 01 M CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，制成感受态细胞悬液。

8、将感受态细胞分装至预冷的无菌离心管中，置于冰上备用。

三、DNA 与感受态细胞的混合1、取适量的质粒 DNA（通常为1 10 μL，不超过感受态细胞体积的 1/10），加入到预冷的感受态细胞中。

2、轻轻弹动离心管，使 DNA 与感受态细胞充分混合，冰浴 30 分钟。

四、热激处理1、将离心管迅速转移至 42℃水浴中，热激 90 秒。

2、迅速将离心管转移至冰浴中，冷却 2 3 分钟。

五、复苏培养1、向离心管中加入适量的 LB 液体培养基（不超过离心管体积的1/10）。

2、 37℃，150 200 rpm 振荡培养 45 60 分钟，使细胞复苏并表达抗性基因。

实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲实验目的1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。

2.进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。

3.说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。

实验材料1.配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。

2.配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。

实验步骤1.培养基灭菌。

在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。

既可以通气，又不使细菌进入。

)。

将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。

同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。

2.倒平板，倒斜面。

灭菌后。

待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。

超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风和白炽灯。

将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。

待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约10～20mL倒入1 个培养皿中。

倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。

倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。

试管斜靠在平放的铅笔上，冷却凝固。

3.液体培养基用于大肠杆菌的扩大培养。

实验1,大肠杆菌的培养和分离篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲实验目的1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。

2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。

3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。

实验材料1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。

2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。

实验步骤1. 培养基灭菌。

在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB 固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。

既可以通气，又不使细菌进入。

)。

将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。

同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。

2. 倒平板，倒斜面。

灭菌后。

待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。

超净工作台操作：打超净工作台的紫外灯（注意：打开紫外灯后人必须离开），持续30min，关闭紫外灯，打开过滤风和白炽灯。

将有培养基的三角瓶和培养皿放在灭菌后的超净工作台上后，点燃酒精灯，用镊子夹出酒精棉球擦拭桌面，并用酒精棉球擦手。

待固体培养基冷却到60℃时（手放上还有些热的时候），在酒精灯火焰旁，以右手无名指及小指夹持含有固体培养基的三角瓶的封口膜，右手其他三个手指拿着三角瓶；左手拿着培养皿，并打开上盖的一边，将三角瓶的培养基约10～20mL倒入1 个培养皿中。

倒入后立即置于水平位置上，轻轻摇晃，使培养基铺满培养皿底，待凝，使之形成平面。

倒斜面（试管内空白斜面），用玻璃漏斗倒入试管内，每试管2mL。

大肠杆菌的自诱导转化实验操作流程一、实验前的准备。

咱做这个实验之前呢，得把东西都准备好。

实验材料那可不能少，大肠杆菌菌株是必须的啦，就像我们做菜得有食材一样，这大肠杆菌就是咱们这个实验的主角食材呢。

还有载体DNA，这也是关键的东西，没有它就像炒菜没放盐，没味道。

各种培养基也得备齐，像LB培养基，这可是大肠杆菌的小食堂，能让它们茁壮成长。

实验仪器也很重要哦。

比如说咱们得有个超净工作台，这就像一个超级干净的小房子，能让咱们在没有太多杂菌捣乱的环境下做实验。

还有离心机，这可是个大力士，能把不同的东西按照重量分开。

微量移液器也不能忘，这就像个小小的魔法棒，能精准地吸取我们需要的液体量，从几微升到几毫升都能搞定呢。

二、大肠杆菌的培养。

接下来就是培养大肠杆菌啦。

咱们把保存的大肠杆菌菌株从冰箱里拿出来，就像把小宝贝从小屋里请出来一样。

然后用接种环挑取一点点，轻轻地接种到含有合适抗生素的LB液体培养基中。

这里的抗生素就像个小保安，防止其他杂菌来抢地盘。

把接种好的培养基放到摇床里，设置好温度和转速，一般37度，转速大概150 - 250转每分钟就很合适啦。

这时候大肠杆菌就在里面欢快地游泳、吃东西、繁殖啦，就像一群小生物在开派对一样。

三、载体DNA的准备。

在大肠杆菌欢快生长的时候呢，咱们也不能闲着，得把载体DNA处理好。

这个载体DNA啊，要是从公司买回来的，一般是冻干的，咱们得按照说明书，用合适的缓冲液把它溶解。

溶解的时候要小心哦，就像对待一个很脆弱的小物件一样。

要是自己构建的载体DNA，那之前还得经过好多复杂的步骤，像酶切啊、连接啊这些，这里就先不细说了。

四、转化过程。

等大肠杆菌长到合适的浓度，也就是OD600达到0.4 - 0.6左右的时候，就像它们长到了青春期一样，咱们就可以进行转化啦。

先把培养好的大肠杆菌取出来，放到冰上冷静一下，就像让它们休息休息，调整一下状态。

然后把一定量的载体DNA加入到大肠杆菌中，轻轻混匀，这就像把新的任务交给它们一样。

实验八实验九大肠杆菌感受态细胞制备与转化一、实验目的1. 学习大肠杆菌感受态细胞的制备方法；2. 掌握大肠杆菌感受态细胞的质粒转化实验。

二、实验原理在大肠杆菌的分泌途径中，感受态细胞用于感知环境信号，并调控下游基因表达。

大肠杆菌感受态细胞通过感受胞外分子信号，使得胞内信号通路被触发，从而改变基因表达水平。

感受态细胞的制备需要温和条件和合适培养基的选择。

2. 大肠杆菌质粒转化大肠杆菌质粒转化技术是基因工程中应用广泛的技术。

将目的DNA（一般为质粒）转化到大肠杆菌中，目的DNA在大肠杆菌中能够被稳定复制并且表达。

常用的转化方法有化学转化法和电转化法。

三、实验步骤①在LB培养基中培养感受态细胞至对数生长期，收集细胞；②用感受态诱导液对收集的细胞进行感受态诱导；③收集诱导后的感受态细胞，用80%甘油置于-80℃冰盒中保存。

①在LB平板上分别涂抹野生型大肠杆菌菌落和转化素质粒（如pUC18）大肠杆菌菌落；②接种待转化的细胞于10ml LB培养液（含抗生素），在37℃振荡培养至OD600=0.4±0.1；③收集菌落，用LB缓冲液洗涤；④将菌落再悬于25mM CaCl2，转化素质粒；在微量水平下，用蒸馏水稀释菌落以便于操作；⑤恒流电极制备，用电解质转换液将转化后的菌落转移到LB培养基固体培养基上，加入抗生素；⑥在37℃下培养16~20小时。

可以制成固体培养基快速筛选。

四、实验注意事项1.在大肠杆菌感受态细胞制备过程中，需要注意细胞生长的温度和培养基的种类；2.大肠杆菌质粒转化时，需要注意细胞的生长状态和转化电压的设置；3.操作过程中应注意无菌操作，避免受到细菌感染。

五、实验结果分析检测感受态细胞能够感知胞外分子信号，并且响应相应基因表达水平的变化。

通过筛选获得含有目的质粒的大肠杆菌细胞，检测目的基因能否被稳定表达。

实验九：大肠杆菌质粒转化1. 了解大肠杆菌质粒转化技术的基本原理；2. 熟悉大肠杆菌质粒转化实验的操作步骤。

A．大肠杆菌的转化（热击法）1. 从-80℃超低温冰柜中取出一管感受态大肠菌（BL21），立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10 min。

从冰箱中拿出含目标基因片段的质粒一管，也插入冰中，冰浴5~10 min，待融化。

2. 往上述大肠菌中加入5 μl(一般大肠菌50ul,质粒5ul)连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100 ng），轻轻震荡后放置冰上20 min。

同时，将恒温水浴的温度调到42℃。

顺便把质粒管放回原处。

(移液器枪头可能要用贴有白色标的那种).(有时大肠菌为10UL，质粒1~2UL。

比例在10:1左右)3. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置5~10 min。

这样质粒就被导入了。

4. 在超净工作台中向上述引入质粒的大肠杆菌管中加入500 μl LB培养液（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床弹簧架上37℃震荡0.5h。

5. 同时将含合适抗菌素（AMP）的固体LB平板培养皿，放入烘箱37℃下烘0.5h。

这样可以防止大肠菌因为较大温差而死亡。

6. 在超净工作台中取上述转化混合液（即导入质粒的大肠菌）150 μl，滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过（防止杂菌）的玻璃涂布棒涂布均匀，注意涂布棒不可烧后直接涂，要降温。

将多余的转化混合液倒入废液缸，管子投入指定地点。

7. 倒置培养基，在培养皿上做上标记，放置在37℃恒温培养箱中培养箱过夜（约12-15小时）。

9. 在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，整理。

B．大肠杆菌扩增用的“营养肉汤培养液”的配制酵母提取物，蛋白胨，氯化钠，NaOH溶液等按照实验室写的来，加1L超净水。

配好的培养基灭菌时需要在摇瓶上加透气的塞子，然后120度20分钟灭菌。

写上标签。

有些需要灭菌的器材都可以在此时灭菌。

C1．大肠杆菌扩增（在2*TY培养基上）1.实验前先对双手消毒。

实验时也要注意对器材在火上烧一下如镊子，移液器，试管口，试管盖，使用前后的竹签。

大肠杆菌扩大培养操作规程大肠杆菌是一种常见的肠道菌，被广泛应用于分子生物学和生物工程领域。

扩大培养是培养大肠杆菌以获得足够量的细菌供实验使用的过程。

以下是大肠杆菌扩大培养的一般操作规程。

1. 需准备的试剂和设备：- LB培养基- 大肠杆菌菌株- 震荡器- 培养瓶- 离心机- 恒温培养箱- 输液器、移液器等实验室常用器材- 高压蒸汽灭菌器2. 扩菌前的准备工作：- 将所需实验器材清洗干净，并用高压蒸汽灭菌器处理消毒。

同时准备好所需的培养基和菌株。

- 根据实验需要准备相应数量的培养瓶。

3. 扩菌操作步骤：- 取一支冷冻菌株或已有菌液，用移液器取适量菌株滴入一瓶LB培养基中。

- 使用移液器或输液器将培养物均匀混合。

- 将带有培养物的培养瓶放入震荡器中，设置合适的震荡速度和时间，一般为200rpm，37摄氏度，16小时。

- 将震荡培养的培养瓶移至离心机中，以12000rpm 离心5-10分钟，使得菌体沉淀到培养瓶底部。

- 弃去上清液，用移液器将上清液吸走，尽量不吸走菌体沉淀。

- 加入适量的无菌PBS缓冲液，使用移液器进行充分悬浮，使得沉淀的菌体均匀分散在PBS中。

- 取适量的悬浮液进行菌液的浓度测定，一般使用菌液光密度测定法（OD600）。

4. 菌液保存：- 如果需要长期保存，将菌液分装到无菌冻存管中，添加10%的甘油保护菌株，竖立冻存管放入-80摄氏度冷冻保存。

- 如果需要短期保存，菌液可存放于4摄氏度冷藏保存。

5. 培养基和器材处理：- 培养瓶清洗后进行高压蒸汽灭菌处理。

- 培养基处理：将未使用完的培养基加热至沸腾，然后冷却后放置冷藏保存，以备下次使用。

总结：通过以上操作规程进行大肠杆菌的扩大培养，可以得到足够量的细菌供后续实验使用。

在操作过程中要注意无菌操作、掌握培养基的配制和菌液的保存，保证实验的可靠性和重复性。

大肠杆菌感受态细胞的制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备的原理：大肠杆菌自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。

在转化实验中，通常先采用人工的方法制备感受态细胞，代表性的方法之一是Ca2+诱导法。

感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。

细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。

Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化：①在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。

②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。

当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。

一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。

将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-80℃可保存半年。

大肠杆菌感受态过程中的注意事项：1、细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。

实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。

研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。

大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。

细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。

用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。

CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。

若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。

从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。

本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。

将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。

转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。

二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。

2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。

3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。

大肠杆菌转化
1.准备冰，照超净台。

2.感受态放冰上融化，取2ul质粒加到100ul感受态中，混匀。

【如果是转构建
好的载体，取5ul载体到25ul买的感受态中】
3.冰浴30min,此时打开水浴锅
4.42℃水浴热激45s 。

(勿振动)
5.冰浴1min 。

(勿振动)
6.加800ul液体SOC，轻轻混匀。

37℃摇床（斜放），200rpm,1h
7.重悬（用枪轻轻吹打混匀），吸取200ul加入已加相应抗生素的平板中，玻璃
珠涂板。

8.37℃倒置培养14h—16h
注：如果是转化构建好的载体，第二步取5ul的质粒加到25ul买的感受态中。

第六步加200ul液体SOC。

第七步将所有菌液涂到平板上。

其他步骤同上。

挑菌
1.液体LB培养基中加抗生素，每个三角瓶/试管中加10ml培养基。

2.用灭菌牙签或枪头挑取单菌落，放入三角瓶/试管中。

3.封口,37℃摇床，200rpm过夜。

大肠杆菌的摇瓶扩大培养实验报告
大肠杆菌是一种常见的细菌,在许多实验室和医院都有应用。

摇瓶扩大培养是一种常见的培养方法,可以在较短时间内扩大细菌数量。

以下是一份大肠杆菌的摇瓶扩大培养实验报告的基本框架：
实验目的：
通过摇瓶扩大培养方法快速扩大大肠杆菌数量,为后续实验提供足够的细菌数量。

实验方法：
1. 准备摇瓶培养基及大肠杆菌培养液。

2. 在无菌条件下,将大肠杆菌培养液转移到摇瓶中,使细菌数量初步增加。

3. 将摇瓶放入恒温摇床中,固定摇动速度为200rpm,温度设定为37℃,并保持连续培养24小时。

4. 培养结束后,取出摇瓶,用一次性塑料吸管或移液器移取所需细菌数量,并进行后续实验。

实验结果：
经过24小时的摇瓶扩大培养后,大肠杆菌数量得到了有效增加,并呈现出均匀的分布状态。

在摇瓶培养基中,大肠杆菌呈现出灰白色的圆形或不规则菌落状,无明显的异味或变色现象。

移取细菌后,可进行进一步的实验操作。

结论：
通过摇瓶扩大培养方法,可以快速扩大大肠杆菌数量,为后续实验提供充足的细菌来源。

要注意无菌操作,保证实验结果的准确性和可靠性。

实验一大肠杆菌转化实验实验原理质粒DNA或重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。

一、实验材料准备1. 器材旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5 ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。

2. 试剂培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。

3. 材料处理无菌ddH2O，1.5 ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。

二、操作步骤1. 事先将恒温水浴的温度调到42℃。

2. 从-70℃超低温冰柜中取出一管（100 μl）感受态菌，立即插入冰上，冰浴5~10 min。

3. 待感受态菌融解后，加入5 μl 连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100 ng），轻轻震荡后放置冰上30 min。

4. 轻轻摇匀后插入42℃水浴中1 min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5 min。

5. 在超净工作台中向上述各管中分别加入500 μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1 h。

6. 将培养好的离心管中的菌12000g离心1min，去上清（大概剩余100μl后用枪打均匀）。

在超净工作台中取上述转化混合液100μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB平板培养皿中，用灭过菌的玻璃涂布棒涂布均匀。

7. 如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40 μl 2% X-gal，8 μl 20% IPTG，用灭过菌的玻璃涂布棒涂布均匀。

8. 在涂好的培养皿上做上标记，并用封口膜封好。

大肠杆菌的感受态制备溶液的准备：①TB（transformation buffer）500ml制备方法： PIPES 1.5gCaCl2·2H2O 1.1gKCl 9.3g加水调制475ml后用1mol/L的KOH调PH至6.7（约用6-7ml）然后加入MnCl2·4H2O5.45g,将总量调到500ml，用0.22um的滤膜过滤，4℃保存。

②SOB培养基Trptone(peptone) 20gYeast Extrat 5g5M NaCl 2ml2KLl 1.25ml加水到990ml,atuo clone 然后加10ml 2M Mg2+ sol 储存。

2M Mg2+ sol的制备方法：MgSO4·7H2O 12.324gMgCl2·6H2O 10.165g加水到50ml混匀。

每100mlSOB溶液中加入1ml的2M 葡萄糖溶液就可以制备成SOC溶液在4℃保存。

感受态的制备：①涂板，在培养基上粗画线，培养大肠杆菌DH5α37℃过夜②挑取5-7个菌落③将挑取的菌落加入到250ml的SOB （应将菌放在2L的三角瓶中保证菌有足够的空气）④17℃到18℃震荡50小时直到其OD值在0.4-0.8之间，一般0.6最适合。

OD值越小菌较年轻效果较好。

⑤到了预定的OD值后置于冰上10分钟。

⑥用50ml的Falon tube 分装⑦4℃3000prm离心10分钟倒去上清⑧加1/3的冰冷TB buffer 约17ml⑨让菌呈悬浮状态混匀使其复苏⑩置于冰上10分钟⑪4℃3000rpm离心10分钟后去上清⑫加4mlTB（0℃）使菌复苏后⑬加0.3mlDMSO（相当于7%）然后置于冰上10分钟⑭分装到0.3ml的tube中-80℃保存。

大肠杆菌感受态细胞制备与质粒DNA的转化一、实验目的1）掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。

2）学习和掌握质粒DNA的转化和筛选方法及操作步骤。

二、实验原理本实验以E.coli DH 5α菌株为受体细胞，并用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与pBS质粒共保温实现转化。

由于所用pBS质粒带有长那霉素抗性基因。

因此可以通过长那霉素抗性来筛选转化子。

如果受体细胞没有转入pBS，则在含长那霉素的培养基上不能生长。

能在长那霉素培养基上生长的受体细胞肯定已经导入了pBS。

转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳酶切等进一步鉴定。

三、仪器及试剂仪器：恒温摇床、CO2细胞培养箱、台式高速冷冻离心机、超净工作台、低温冰箱、恒温水浴锅、制冰机、分光光度计、移液枪、Eppendrof管。

试剂：LB培养基(在950mL水中加入10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl、用1mol/L NaOH调制pH=7.2.加入至1L，121℃高压灭菌20min)长那霉素储存液：100mg/mL含长那霉素的LB固体培养基：(1L LB液体培养基中加入20g琼脂粉，将配好的LB固体培养基高压灭菌后，冷却至60℃左右，加入长那霉素储存液，使其终浓度为50μg/mL。

摇匀后铺板，每皿倒15mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净)1mol/L CaCl2储存液质粒DNA10ng/Μl四、实验步骤1 感受态细胞的制备1）从LB平板上挑选新活化的E.coli DH 5α单菌株，接种于3~5mL LB液体培养基中，37℃下震荡过夜培养，12h左右，直至对数生长后期。

2）将该菌悬浮液以1:50的比例接种于5mL LB液体培养基中，37℃振荡培养2~3h至OD600为0.5左右。

3）将5mL培养液转入4个1.5mL离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下，5000rpm离心5min。

4）弃去上清液，用预冷的1mL 0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15~20min后，40℃下5000rpm离心5min。