Qiagen midi-maxiprep

QIAGEN Plasmid Mini,Midi,and Maxi Kits（说明书中文翻译版）Plasmid Midi Kit(cat.Nos.12143and12145)The kit can be stored at room temperature(15~25℃)for up to2years.使用前的注意事项：（1）将Rnase A solution加入Buffer P1中，混匀，2~8℃储存。

（2）可选步骤：按1:1000的比例将LyseBlue试剂加入到Buffer P1中。

（3）使用前在4℃预冷Buffer P3，检查Buffer P2是否出现SDS沉淀。

（4）需准备好异丙醇和70%酒精。

（5）标志：圆形代表小提试剂盒；三角形代表中提试剂盒；正方形代表大提取试剂盒。

表1推荐LB培养物体积试剂盒高考倍质粒低拷贝质粒小提3mL不推荐中提25mL100mL大提100mL500mL具体操作步骤：1.收取过夜培养的细菌培养物，在4℃条件下6000×g离心15min。

2.（弃去上清液）使用4mL Buffer P1重悬菌体沉淀。

3.加入4mL Buffer P2，颠倒4~6次使彻底混匀，室温（15~25℃）孵育5min。

注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液会变蓝。

4.加入4mL预冷过的Buffer P3，颠倒4~6次使彻底混匀，冰上孵育15min。

注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液混匀后直至蓝色消失。

5.在4℃条件下≥20000×g（14000×g）离心30min。

6.平衡柱子QIAGEN-tip100：加入4mL Buffer QBT，通过重力流使液体过柱。

7.将第5步的上清液转移至QIAGEN-tip中，使其依靠重力流通过柱中的树脂。

8.使用10mL Buffer QC洗涤QIAGEN-tip，使Buffer QC依靠重力流通过柱中的树脂。

洗涤2次。

质粒大抽protocol(用QIAGEN Maxi Column)2003/4/28陈俊1. 从转染的细菌平板中挑取中等大小，饱满，而且没有和其他克隆接触的单克隆，接种到3ml选择性培养基，摇床培养14小时,225 rpm。

2. 从小量培养物中取1ml用作小量抽提，并且用小量抽提产物酶切鉴定，选取阳性克隆的培养物，以1：1000接种到100 ml选择性LB培养基中，摇床培养14小时,225 rpm。

3. 从大量培养物中取700微升菌液和300微升甘油（灭菌）加入冻存管，放入液氮中，过夜后，放入-70℃冰箱中。

并且在stocklist中加入菌种的详细信息(stocklist 贴在冻存管的上方)。

4. 把100ml的菌液倒进250ml离心管中，4℃离心，6000g离心15分钟（No41 rotor 8500rpm）。

5. 倒掉上清，并倒扣在吸水纸上片刻．然后加入4ml 4℃预冷的细胞重悬液buffer P1（确定是否加了RNase）,反复吹打沉淀至没有悬浮的菌块。

然后将悬浮液转到50ml的离心管中。

6. 加入4ml细胞裂解液 buffer P2，彻底而且轻柔地颠倒混匀4-6次，在室温下孵育不要超过5分钟（从开始加P2时计时，时间太长会使质粒DNA断裂）。

样品不要斡旋，buffer P2用毕也要及时盖好盖子，以免被空气中的CO2酸化。

7. 加入4ml 预冷的PH调节液buffer P3,及时地而且轻柔（避免局部十二烷基磺酸钾沉淀）地颠倒混匀4-6次，在冰上孵育15分钟。

后再一次混匀样品．20000g，4℃离心30分钟（N046 rotor 18000 rpm）.若上清不够清需再离心15min. 此步可对上清取样240ul （sample 1）以备检测分析8. 在层析柱的顶端加四层纱布，并且用buffer QBT润湿纱布。

用4ml的buffer QBT来平衡层析柱，让液体自由的流下（尽量将润湿面积减到最小）。

QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi KitCatalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。

在开始之前作如下准备1）按照说明把RNase A加到Buffer P1 中，混匀，放到2-8度储存。

选作：按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P12）pre-chill Buffer P3 4°C存放。

3）检查Buffer P2 是否有SDS沉淀物，可以放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。

4）准备异丙醇。

5）用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml的96-100%的酒精。

大量质粒提取过程在LB培养基中种植转化的E.coli菌。

使用100ml（高复制数的质粒）或者250ml（低复制数的质粒）过夜培养。

操作步骤如下1.收获LB培养过夜的细菌，在6000g，4℃条件下离心15min。

2.加入10ml Buffer P1（根据SBI要求加倍，用20ml）重悬细菌。

3. 加10ml Buffer P2（根据SBI要求加倍，用20ml），剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。

如果使用了LyseBlue试剂，溶液应该变成均匀蓝色。

4.在孵育期间，打开针口的密封盖.并把过滤器放到合适的架子上。

5.加入10ml冰浴的Buffer P3（根据SBI要求加倍，用20ml）到此溶菌产物中，剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。

如果加入了LyseBlue试剂，混匀试剂直到没有颜色。

6.将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。

打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。

7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。

8.将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液通过重力滴下排空。

9.将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。

qiagen pcr各个温度设定原理Qiagen PCR是一种常用的聚合酶链反应（PCR）试剂盒，适用于从DNA样本中扩增特定的DNA片段。

该试剂盒包括多个步骤，每个步骤的温度设定具有特定的原理和功能。

1. 热变性（Denaturation）：PCR反应的第一个步骤是热变性，其温度设定通常为94-98摄氏度。

这个温度可以将DNA的双链分离成两条单链，使其可供引物结合和扩增。

热变性的原理是利用高温破坏DNA的氢键结合，使DNA分子解开。

2. 退火（Annealing）：在热变性之后，PCR反应温度会降低到50-65摄氏度。

这个温度是引物与DNA模板的特异性结合的温度，使引物能够与目标DNA序列互补配对。

退火的原理是利用合适的温度使引物与目标序列杂交。

3. 延伸（Extension）：在退火之后，PCR反应温度会升高到72摄氏度。

这个温度下，DNA聚合酶会结合到引物上，并沿着DNA模板链合成新的DNA链。

延伸的原理是利用DNA聚合酶酶活性，加入碱基三磷酸核苷酸，合成新的DNA链。

以上是Qiagen PCR的基本温度设定原理，通过不同温度下的反应步骤，可以实现DNA的扩增。

在PCR反应中，温度的设定非常重要，因为不同的温度能够促进特定的反应步骤。

合理的温度设定可以提高PCR反应的效率和特异性，确保扩增得到准确的目标DNA片段。

除了基本的温度设定，Qiagen PCR还提供了其他辅助功能，例如热启动酶、引物设计和缓冲体系等。

这些功能可以进一步提高PCR反应的效果和灵敏度。

例如，热启动酶可以在PCR反应开始之前抑制非特异性扩增，提高目标DNA的特异性。

引物设计可以根据目标序列的特点选择适合的引物，确保PCR反应的特异性和效率。

缓冲体系可以提供适宜的酶活性和反应条件，保证PCR反应的顺利进行。

Qiagen PCR是一种可靠的PCR试剂盒，通过合理的温度设定和辅助功能，可以高效、准确地扩增特定的DNA片段。

熟悉其温度设定原理和辅助功能的使用方法，可以帮助科研人员在分子生物学实验中取得更好的实验结果。

质粒DNA中提方法（QIAfilter midi kit 25）适用于100 微克的高质粒或粘粒DNA，使用QIAfilter注射器样元件代替常规离心法以清除细菌裂解物。

低拷贝质粒，加入氯霉素放大后应视为高拷贝。

为质粒选择适当的培养体系。

在开始之前的注意事项■如果是低拷贝，最好增加裂解buffer的用量，以提高裂解效率，裂解缓冲卷，从而增加DNA 产量。

■可选：删除样品的步骤用符号表示☞为监测分析凝胶（见第34 页）的过程。

■加入buffer P3后，样品不再需要冰浴。

在开始之前做的东西■把提供的RNase A 添加到buffer P1 中。

一瓶RNase A (使用之前简要地离心）加入一瓶buffer P1 ，终浓度为100 ug/ml。

■检查buffer P2 是否由于低温存储产生SDS沉淀。

如有必要，37 ° C下使SDS溶解。

.■在4 °C预冷buffer P3。

■可选：使用前将提供的LyseBlue 试剂添加到buffer P1 混合。

每个buffer P1 瓶加入一小瓶LyseBlue （在使用之前简要离心），达到1: 1000 稀释。

LyseBlue 可以提供视觉识别从而防止常见处理错误，如细胞裂解导致效率低下和不完全沉淀的SDS、基因组DNA污染、细胞碎片等。

过程1.摇菌：新鲜划线的选择性平板（接种含有适当的选择性抗生素）挑一个单菌落放入2-5 ml LB 培养基中。

在37 ° C 摇菌约8 h （约300 rpm）。

使用4倍体系容积的试管或锥形瓶。

2.稀释选择性LB 培养基1/500 -1/1000。

若为高拷贝质粒，接种到25 毫升或● 100毫升的介质具有▲ 25—50 µ l 或● 100 – 200 µ l 起始培养液。

若为低拷贝质粒，接种▲ 50 — 100 毫升或● 250 毫升的介质具有▲ 100 – 200 µ l 或● 250-500 µ l 起始培养基。

qiagen的大量抽提试剂盒是公认效率最高，得率最高的产品。

我做的研究工作主要是基因治疗，抽提质粒是一件非常痛苦的事情。

因为要做动物的体内实验，每只动物每次需要将静脉注射50微克的质粒，重复注射三次，每只就是150微克，如果有60只就需要9mg。

如果需要大量抽提质粒的实验人员就清楚这9mg是需要多大的工作量。

并且需要提出的是静脉注射动物用的质粒是需要去内毒素的，目前去内毒素最好得率最高的非qiagen莫属。

该公司的endofree plasmid purification 是国外文献最常用的大量抽提质粒的产品。

其中以maxi,mega最为常见。

我就我自己最常用的mega使用的经验说一下。

在qiagen 公司的可以下载到非常详细handbook，/literature/handbooks/INT/plklit.aspx其中非常专业及丰富的质粒的知识，对于每一个初学者是必需通读一遍的，同样对于其他人员也是很有帮助的。

要有高产率高质量的质粒，以下几个关键点要注意：1. 准备好需要的器材，根据qiagen的mega 的protocol，是需要与tip相连的广口瓶，口径是45mm这是因为tip必需与这种瓶才能配套，对于操作抽真空过滤这一步可以方便快速，减少不必要的麻烦。

2. 质粒最好是高拷贝的，感受态细菌最好是极高拷贝的。

如top 10等，DH5-alfa 稍差一些。

感受态细菌最好是刚做不久的。

3. 每次培养的菌体量在600ml以下，LB注意水质一定要好，一定要PH值在7.2－7.4，摇床在250转/分钟，16小时以上，注意菌体的浓度一定要浓。

4. 操作过程一定要按照操作说明的时间，严格操作。

要注意一点加入酸中和后在tip的时间要短，因此需要快速抽真空，快速的转入下一步。

5.洗脱的时间很长，要有耐心，不要让下流的洗脱液停止。

6.异丙醇沉淀DNA后离心可在20000转/分，离心45分钟可以提高约20％产量。

Qiagen基因组提取试剂盒中文操作说明QIAamp DNA Blood Mini Kit简介：QIAGEN公司出品的QIAamp DNA Blood Mini Kit适用于使用微型离心机或真空处理从全血、血浆、血清、血沉、淋巴细胞以及体液样品中提取总(基因、线粒体和病毒)DNA。

该试剂盒可处理带有EDTA、柠檬酸盐和肝素等常规抗凝剂的新鲜或冷冻的全血样本，样品量可达200μl。

整套基因组的操作时间约为20–40分钟，一般可从200μl健康全血中获得4–12 μg DNA，洗脱体积可在50–200μl范围。

抽提原理：样品中的DNA可以特异性结合到QIAamp的硅胶膜上，通过两次洗涤可以将PCR抑制剂，如：二价阳离子和蛋白完全去除，最后结合在离心柱上的纯核酸可用水或试剂盒中的缓冲液进行洗脱收集。

开始前的注意事项：1. 所以的离心步骤需要在室温（15-25℃）进行2. 如果样品中含有的基因组当量少于10000，请添加载体DNA（carrier DNA）3. 200μl全血样品可以得到约3-12μgDNA开始前的准备工作：1. 将样品平衡到室温（15-25℃）2. 将水浴或是金属浴加热到56℃，以备第4步使用3. 将Buffer AE或蒸馏水平衡到室温，用于第11步的洗脱4. 确保Buffer AW1、AW2以及QIAGEN蛋白酶已经按照说明配置完毕5. 如果在Buffer AL中出现沉淀物，请在56℃孵育使其溶解操作步骤：1. 吸取20μl QIAGEN蛋白酶（或者蛋白酶K）至1.5ml离心管的底部。

2. 加入200μl待提取基因组的样品至离心管中。

可以加入不超过200μl的全血、血浆、血清、血沉棕黄层，或者溶于200μl PBS中不超过5*106的淋巴细胞。

如果样品体积不足200μl，请使用PBS补足。

前两步的顺序也可以调换，即将蛋白酶加入样品中，但此时需要注意充分混匀。

3. 加入200μl Buffer AL至样品中，涡旋振荡15s混匀。

随着荧光定量PCR仪的普及，荧光定量PCR也开始飞入寻常实验室了。

不过real-time PCR可不像终端PCR那么轻巧。

常规PCR只要扩出条带就算行，条带深点浅点偶尔有点副产物问题不太大，而实时定量PCR既然目标是定量，自然就要严谨得多。

稍有偏差都会被级数放大而严重影响结果。

由于涉及若干种荧光标记，定量PCR头一件麻烦事就是引物和探针的设计。

虽说科研是re-search的过程，但估计没人愿意在同一个实验上反反复复花上几个月的时间，天天搞troubleshooting，那么，我们就应该选择一些可信赖的产品。

QIAGEN不仅是核酸纯化方面的老大哥，在定量PCR上也有一手。

在上个月人禽流感频频出现的时候，QIAGEN的销售人员曾颇为自豪地告诉小编，现在疾控中心都在用他们的定量PCR试剂盒检测禽流感病毒，俨然国家标准。

既然这么有市场，QIAGEN的产品究竟好在哪里？简单快速SYBR Green的荧光定量PCR方法是很多人的青睐，一来价格比较实惠，二则不用设计探针。

但是，SYBR Green法绝非常规PCR+SYBR Green这么简单。

这种方法饱受诟病的地方就是少了探针，专一性没那么好。

其实只要引物设计得好，同样能得到高特异性的结果。

引物设计在SYBR Green的荧光定量PCR方法中尤显重要。

QIAGEN 就推出了专为SYBR Green荧光定量法而设计的QuantiTect引物对。

它是经生物信息学验证的，专一性强，灵敏度高，不形成引物二聚体，是基因表达分析的不二选择，例如RNAi和芯片的结果验证。

更重要的是，QuantiTect引物对和QuantiFast SYBR Green RT-PCR Kit配合使用，就完全不必担心实验没结果，可以天天高枕无忧了，因为QIAGEN 100%保证实验结果。

你可能觉得奇怪，QuantiTect引物对又不是全部经过实验室验证，为什么QIAGEN如此信心满满。

据QIAGEN的技术专家介绍，QuantiTect引物对在欧美很畅销，凡是用过的都是happy ending，从没有不成功的案例。

QIAGEN试剂盒提取RNA说明书中⽂翻译1:细菌的溶菌酶破碎2:细菌的溶菌酶破碎和机械破碎3:细菌的机械破碎4:细菌的溶菌酶裂解和蛋⽩酶K的消化5:细菌的溶菌酶裂解、蛋⽩酶K的消化及机械破碎6:固体培养基细菌的裂解7:使⽤RNeasy Mini Kit从细菌溶解物中提纯总RNA。

8:使⽤RNeasy Midi Kit从细菌溶解物中提纯总RNA。

章节说明该⼿册含有两种不同类型⽅案。

我们提供了多种⽅案，其中⽅案1-6是针对制备细菌溶解物，⽅案7-8是针对如何从细菌溶解物中提取全RNA。

你需要在⽅案1-6中选择⼀种操作，⽽后在⽅案7-8中任选其⼀。

制备细菌溶解物的各个⽅案都介绍了破碎细菌时如何固定RNA。

如何选择不同的实验⽅案由细菌细胞壁的稳定性所决定。

细菌细胞壁的稳定性受多个因素影响，包括细菌种类、⽣长阶段和培养基的成分。

细菌必须完全破碎以确保RNA的有效提取。

制备细菌溶解物的各个⽅案都包含了不⽌⼀步。

■酶消化：细菌细胞壁可以被溶菌酶进⾏消化（例如溶菌酶、溶葡球菌酶）。

我们认为溶菌酶的作⽤对于所有的⾰兰⽒阳性、阴性细菌均是有效的。

■蛋⽩酶K消化：在复杂培养基上⽣长的细菌⼤部分蛋⽩质可以被蛋⽩酶K消化以提⾼RNA 的纯化率。

我们认为蛋⽩酶K对于可在复合培养基中⽣长的细菌均是有效的。

蛋⽩酶K常常⽤于提⾼⾰兰⽒阳性细菌RNA。

另外，若从⼤量原材料中提取RNA，蛋⽩酶K可以有效提⾼RNA产率。

■机械破碎：细菌细胞壁的机械破碎可以使⽤组织研磨机和玻璃微珠。

机械破碎法对于绝⼤多数的细菌来说都是适⽤的。

机械破碎法与酶消化法相结合可以极⼤程度的提⾼RNA产率。

尽管本⼿册中的机械破碎⽅案均为使⽤组织研磨机，但采⽤其他的破碎⽅法是完全可⾏的。

考虑到细菌种类的多样性以及培养条件的多样性，细菌溶解物的制备⽅案（⽅案1-6）必须谨慎选择。

在第10页中介绍了制备细菌溶解物的不同⽅案，第11页（表格⼀）则提供了这些⽅案概况以便于参考选择。