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焦磷酸测序技术的原理(2020年整理).pptx

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焦磷酸测序反应

焦磷酸测序反应
PyroMark Q24 Advanced CpG Reagents (4x24)
(Cat. No 970922 for CpG and long sequencing runs)
E-Mix (Enzyme Mix, lyophilized) S-Mix (Substrate Mix, lyophilized) dATPαS (1200µl) dGTP, dCTP, dTTP (660µl, 1 vial each) PyroMark Q24 Advanced Annealing Buffer* PyroMark Q24 Binding Buffer**
室温1400RPM振 摇5~10min
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
样品准备及上机运行
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
程序设计——Assay
引物设计
PCR
程序设计
样品准备
设计dNTP分配顺序： 点击工具栏 New Assay图标；文件夹右 键>New Assay；File> New Assay; AQ Assay: 等位基因 SNP Assay:核苷酸多态性 CpG Assay：甲基化 SEQ Assay：未知序列测序
上机运行
结果分析
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程
程序设计——Assay
引物设计
PCR
程序设计
AQ/SNP Assay设计：
Sequence to Analyze; Generate Dispensation Order; Dispensation Order
SEQ Assay 设计：
直接在Dispensation Order 输入
Pyro Q24 Adv 测序的工作流程

罗氏焦磷酸测序技术教育课件

罗氏焦磷酸测序技术教育课件
常用的分子生态学分析方法分为两大类：基于 DNA 指纹图谱的分 析方法和基于DNA 测序技术的分析方法。除此之外，可用于实时定量 的荧光定量 PCR（Real time quantitative PCR）和荧光原位杂交技术 （Fluorescence in situ hybridization, FISH）也是常用的分析手段。
肠道菌群的研究方法进展（分子生态学研究方法）
DNA 指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同，将代 表微生物群落中各物种的 DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离，使 代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置，最终得到的电泳图 谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、 直观，常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的 结构差异。最常用的 DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳 （Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）[10,11,12]和末端片段长 度多态性（Terminalrestriction fragment length polymorphism, T-RFLP） 等。
第二代测序技术-罗氏454焦磷酸测序技术
454测序法的步骤 （1）样品输出并片段化： GS系统支持各基因组DNA、PCR产物和细菌人工染 色体(BACs) 及cDNA、小分子RNA 的测序。先将基因组DNA 和BACs等通过物 理方法打断为300-800 bp 的片段,而对于短的小分子RNA 和PCR 用在DNA片段的 5′端加上磷酸基团,3′端变成平端,然后和两个44 bp 的衔接子( adaptor)A、B进行 平端连接。将样品5′端和3′端分别连接A和B衔接子。具有A B接头的单链DNA 片段组成了样品。罗氏454焦磷 酸测序技术

(医学PPT课件)pyrosequencing焦磷酸测序

(医学PPT课件)pyrosequencing焦磷酸测序

Fast
Simple
Dedicated Software
Accuracy
Sequence
Dedicated Reagent Kit
Flexibility
Efficient
Scalable
Multiplexing
Short Optimization Time
3’TAAGCCGAATG
16
Multiplexing
SNPs located on different fragments…... …..or on the same
17
Principle of multiplexing
Design of sequencing primers and dispensation order
Single nucleotide InDels (e.g. [C]) Multiple nucleotide InDels (e.g. [CGACGGT])
11
CYP2D6 - A2637del (Allele 3)
T/T
Sequence (reverse) : TCC[ T ]GTG
T/-
3
ref
ref
2,5
2
1,5
1
0,5
0 TA GCT G CA CG AT G
18
User creates a SNP/ mutation sequence database
Software calculates theoretical genotyping results
Each DNA fragment is assigned a color
-/-
12
Large deletion

焦磷酸测序技术的原理及应用

焦磷酸测序技术的原理及应用
维普资讯
ＳＯＩ ＯＥ ＆ ＴＥ ＥＮ ＣＨＮＯＬＯＯＹ ＮＦＯＲＭＡＴＩ Ｉ ＯＮ 术的原理及应用
葛剑徽
（ 东南大学生物科学和医学工程系 ２０９ ） １０６ 摘 要：焦磷酸测序技术是由４ 种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应 ，适于对已知的短序列的测序分析，其可重复 性和精确性能 与 Ｓ ｎ ｅ Ｎ ａ ｇｒＤ Ａ测序法相媲美 ，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技 术不需要凝胶 电泳 ，也不需要对 Ｄ Ａ样品进行 Ｎ 任何特殊形式的标记和染色，具备同时对大量样品进行测序分析的能力。在单核苷酸多态性、病原微生物快速鉴定、病因学和法医
—
长 度很短 （０—３ ｂ ２ ０ ｐ）的主要原因之一 。而 Ｇ ａ ｉａ ｅ ｈ ｒ ｄ ｈ等人对 ｚ 此进行了变革１， ７ 他们在反应体系中只加人 Ｓ — ＡＴ Ｉ ｐ ｄ Ｐ一 ０ 一Ｓ 【 ， 而 不加入无用的 Ｒｐ ｄ Ｔ — — ，提高了反应的效率 。 —ＡＰ Ｓ 大大降 低了ｄ Ｔ 一０一 降解产物的浓度 ， Ａ Ｐ 【Ｓ 使得 Ａ ｙａｅ ｐ ｒｓ酒性 能够维持
鉴定研究等方面有着越来越广泛 的应用。 美键词 ： 焦磷酸测序技术 单核苷酸 多态性 中圈分类号 ： Ｑｌ１ Ｔ ｌ 文献标识码 ： Ａ ＡＴ － 焦磷酸测 序技 术（ｙ ｏ ｑｅｃ ｇ是 由Ｎ ｒ 等人于 ｔ８年 有效地利用 ，也 能更有利于 阅读富含 Ｔ地区域。但 ｄ Ｐ ｑ— ｐ ｒｓ ｕｎｉ ） ｅ ｎ ｙｅ ｎ ７ ９ 发展起来的一种新 型的 酶联级联测序技 术［ 】 】 ，焦磷酸 测序法适 Ｓ是两种异构体 Ｓ － ＡＴ — — ｐ ｄ Ｐ Ｓ和 Ｒｐ Ａ — — －ｄ ＴＰ Ｓ的混合 ｐ ＡＴＰ — — Ｓ。为 了得到最佳反应效 于对 已知的短序列的测序分析 ， 其可重复性和精确性能与Ｓ ｎ ｅ 物 ，聚 合酶 只能利用 Ｓ －ｄ ａ ｇｒ Ｄ ＮＡ测序法相媲美 ，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产 品具备同时对大量样 品进行测序分析的 能力 ，为大通量 、低成 本 、适时 、快速 、直观地进行单核苷酸多态性 （ｉｇｅ ｎ ｃｅ ｓｎ ｌ ｕ ｌ— ｏｉｅ ｐ ｔｍｏｐ ｉ ，Ｓ ｓ 研究和临床检验提供 了非常理想 ｔ ｏｙ ｒ ｈｓ ｄ ｍｓ ＮＰ ） 的技术操 作平台 。 该技术进行改进后可 以满足上百个核苷酸序列 的测序工作 ， 这样该技术 又可 以满 足对重要微生物的 鉴定与分 型 ．特定 ＤＮＡ片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。 率 ，必需在 反应 体系中保持最佳浓度的 Ｓ － ＡＴ － ｐ ｄ Ｐ— Ｓ，与 此 同时 相应的 Ｒｐ ｄ Ｐ～ Ｃ — － ＡＴ ｔ Ｓ的浓度也在增加。而 ｄ ＡＴＰ － Ｓ Ａ ｙａｅ 被 ｐ ｒｓ降解后的产物是 Ａ ｙ ａｅ ｐ ｒｓ 的抑制剂 ， 随着反应 的进行 ，Ａｐ ｒ ｓ 的活性会越来越低 ，这是焦磷酸测序技术测序 ｙ ａｅ

焦磷酸测序甲基化检测

焦磷酸测序甲基化检测

焦磷酸测序甲基化检测焦磷酸测序甲基化检测是一种新兴的检测方法，通过测序技术和甲基化修饰的结合，能够对DNA中的甲基化状态进行准确的分析。

本文将为大家介绍焦磷酸测序甲基化检测的原理、应用及其在研究和临床实践中的指导意义。

首先，我们来了解一下焦磷酸测序甲基化检测的原理。

DNA甲基化是一种常见的基因组修饰方式，它能够影响基因的转录活性、表达模式和细胞分化。

而通过焦磷酸测序方法，我们可以将DNA样品进行测序，并同时检测DNA中的甲基化状态。

这种方法基于单分子测序技术，能够实现高通量测序和高分辨率的甲基化检测。

通过分析测序数据，我们可以了解基因组中不同区域的甲基化水平，从而深入研究甲基化与基因表达之间的关系。

接下来，我们来看一下焦磷酸测序甲基化检测的应用领域。

首先在科研方面，焦磷酸测序甲基化检测为我们提供了更多了解基因组甲基化修饰的机会。

通过研究特定基因区域或全基因组的甲基化状态，我们可以揭示基因调控和表达的分子机制，进而深入理解与疾病相关的遗传变异和表观遗传学的改变。

例如，我们可以通过甲基化检测，发现癌症细胞中的甲基化模式异常，从而加深我们对癌症发生机制的认识。

此外，焦磷酸测序甲基化检测在临床医学中也具有重要的应用意义。

它可以辅助诊断和预测疾病风险，为精准医学提供新的思路和方法。

例如，在肿瘤领域，甲基化检测可以帮助鉴定潜在的肿瘤标志物，从而为早期诊断和治疗提供有力的依据。

此外，甲基化检测还可以为癌症患者的个体化治疗提供指导，根据患者不同的甲基化修饰模式，制定个体化的治疗方案，提高治疗效果，减少副作用。

综上所述，焦磷酸测序甲基化检测作为一种新兴的检测技术，在基础研究和临床应用中具有广阔的前景和指导意义。

通过该技术，我们可以更深入地了解基因组甲基化修饰与基因表达之间的关系，为疾病发生机制的研究提供新的突破口。

同时，在临床上，焦磷酸测序甲基化检测可以为疾病的早期诊断、治疗策略的制定和患者个体化治疗提供重要依据，促进医学的进步与发展。

焦磷酸测序技术的原理

焦磷酸测序技术的原理

Pyrosequencing技术的原理Pyrosequencmg是一项全新的DNA测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。

其基木原理如下：第1步：1个特异性的测序引物和取链DNA模板结合，然后加入酹混合物（包括DXA Polymerase> ATP Sulfurylasex Luciferase 和Apyrase）和底物混合物（包括APS 111 Luciferin）。

第2步：向反应休系中加入】种dXTP,如果它刚好能和DNA模板的下一个碱基配对.则会在D冶聚合酶的作用下，添加到测序引物的3 '末端.同时释放出一个分子的焦磷酸（PPD。

第2步图示（图片來自互联网）第3步：在ATP硫酸化酹的作用下.生成的PPi可以和APS结合形成ATP;在荧光素曲的催化下.生成的ATP 又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。

通过CCD光学系统即可获得一个特界的检测峰，峰值的商低则和相匹配的碱基数成正比。

SulfurylO^^n-ucle^tide incorporation light-as 令pe-ak in the pyrogr^im第3步图示（图片來自互联网）第4步：反应体系中剩余的dNTP和残留的少虽ATP在Apyrase的作用下发生降解。

dNTp_Apyr«c_^dNDp *dNMP • phosphate員TP 金即"*■ ADP 十AMP 十phosphate第・1步图示（图片來自互联网）第5步：加入另一种dNTP,使第2-4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DXA序列信息。

Pyrosequecmg技术操作简也结果准确可靠，可应用于SXP位点检测、等位基伙I频率测定、细菌和病毒分型等领域。

一如果您认为木词条还有待完善.请编辑词条上一篇SXP（W核昔酸多态性）下一篇阅读质粒图谱具体事例【摘要】建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应（PCR）与焦磷酸测序技术结合的相对基因表达量测左法（简称“SRPP”）。

焦磷酸测序

焦磷酸测序

焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。

在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。

Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。

在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。

新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。

Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。

PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。

Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。

反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。

反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。

焦磷酸测序

焦磷酸测序

罗氏454测序系统中文名罗氏454测序系统测试原理基于焦磷酸测序法特点依靠生物发光对DNA序列进行检测测序流程支持各种不同来源的样品序列测定测试原理GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。

在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GSFLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。

通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。

此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。

测序流程1. 样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定，包括基因组DNA，PCR产物，BACs，cDNA及小分子RNA等，不同类型的样品测序都可在一台仪器上完成。

2. 样品DNA打断：样品如基因组DNA或BAC等被打断成300到800bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤并不需要。

短的PCR产物则可利用GS融合引物扩增后直接进行步骤4。

3. 加接头：借助一系列标准的分子生物学技术，将3′端和5′端有特异性的A和B接头连接到DNA片段上。

接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。

图中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段。

4. 一条DNA片段=一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响，从而实现了所有DNA片段进行平行扩增（emPCR）。

5. 一个磁珠=一条读长：经过emPCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。

经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到Pico Titer Plate板中供后继测序使用了。

6. 数据读取和分析工具：GS FLX系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用。

焦磷酸测序

焦磷酸测序

焦磷酸测序:DNA序列分析技术是现代生命科学研究的核心技术之一，而双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法)是目前使用最普遍的DNA序列分析技术。

在基于Sanger法的全自动DNA测序技术中，测序反应产生的DNA片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测。

Sanger法的优势在于可以分析未知DNA的序列，且单向反应的读序能力较长，目前的技术可以达到1000bp以上。

在实际工作中，很多情况需要对已知序列的DNA片段进行序列验证，而这种分析往往测几十bp就可以满足需要.在这种情况下，Sanger法未必是最合适的ＤＮＡ序列分析技术。

新发展的Pyrosequencing(焦磷酸测序)技术应该是目前最适合这些应用的ＤＮＡ序列分析技术。

Pyrosequencing技术是新一代DNA序列分析技术，该技术对DNA的序列分析无须进行电泳，DNA片段无须荧光标记，因此相应的仪器系统无须荧光分子的激发和检测装置.本文将就Pyrosequencing技术的原理和应用进行介绍和讨论．一、Pyrosequencing技术的原理首先通过PCR制备待测序的DNA模板，PCR的引物之一是用生物素标记的。

PCR产物和偶连avidin的Sepharose微珠孵育，DNA双链经碱变性分开；纯化得到含生物素标记引物的待测序单链，并和测序引物结合成杂交体。

Pyrosequencing技术是由四种酶催化的同一反应体系中的酶级连反应，四种酶是：DNA聚合酶（DNA polymerase）、硫酸化酶(ATP sulfurylase)、荧光素酶(luciferase)和双磷酸酶(apyrase).反应底物为adenosine 5′ phosphosulfate (APS)、荧光素(luciferin)。

反应体系还包括待测序DNA单链和测序引物。

反应体系配置好后就可以加入底物dNTP进行序列分析了。

甲基化 焦磷酸测序

甲基化 焦磷酸测序

甲基化焦磷酸测序1. 介绍甲基化焦磷酸测序（Methylated CpG island recovery assay，MIRA）是一种用于检测DNA甲基化的高通量测序技术。

DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰形式，它在基因组稳定性、细胞分化和发育等生物学过程中起着重要作用。

通过甲基化焦磷酸测序技术，我们可以更加全面地了解DNA甲基化的模式和变化，进而深入研究其在生物学过程中的功能和机制。

2. 原理甲基化焦磷酸测序技术主要分为以下几个步骤：2.1 DNA提取与消除非甲基化DNA首先，从待检测样品中提取总体DNA。

然后，通过特定的方法（如亚硫酸处理）将非甲基化的胞嘧啶（Cytosine）转变为尿嘧啶（Uracil），从而实现对非甲基化DNA的消除。

2.2 CpG岛富集与捕获接下来，利用特定的富集方法（如亚硫酸钠处理）对DNA中的CpG岛进行富集。

CpG岛是一种特定的DNA序列区域，其中含有高密度的CpG二核苷酸。

这些区域通常与基因启动子、转录因子结合位点等功能元件相关联。

2.3 DNA片段化将富集后的CpG岛DNA进行片段化，通常采用限制性内切酶或超声波破碎等方法。

片段化后的DNA可更好地适应高通量测序平台。

2.4 DNA甲基化检测与测序接下来，对片段化的DNA进行甲基化检测和测序。

目前常用的方法是利用亚硫酸处理后产生的尿嘧啶与胞嘧啶之间的差异，通过测序技术准确地检测出甲基化位点。

3. 应用领域甲基化焦磷酸测序技术在许多研究领域中得到了广泛应用：3.1 癌症研究癌症是一种由于基因组异常导致细胞失控增殖而形成的疾病。

DNA甲基化在癌症发生和发展中起着重要作用。

甲基化焦磷酸测序技术可以帮助我们深入了解癌症细胞中的甲基化模式，发现与肿瘤相关的甲基化标记物，并为癌症诊断、治疗和预后评估提供依据。

3.2 发育生物学DNA甲基化在胚胎发育和细胞分化中起着重要作用。

通过甲基化焦磷酸测序技术，我们可以了解不同发育阶段和组织类型中的DNA甲基化模式变化，揭示甲基化在发育过程中的调控机制。

焦磷酸测序

焦磷酸测序

Pyrosequencing是对短到中等长度的DNA序列样品进行高通量的、精确和重复性好的分析的技术。

第一步——测序引物和PCR扩增的、单链的DNA模板杂交，与酶—DNA聚合酶（DNA polymerase）、ATP硫酸化酶（ATP sulfurylase）、荧光素酶（luciferase）、三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）—和底物—adenosine 5´ phosphosulfate (APS)、荧光素（luciferin）孵育。

第二步——四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反应体系，如与模扳配对（A—T，C—G），此dNTP与引物的末端形成共价键，dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。

注意：反应时deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPS)是dATP的替代物，因为DNA聚合酶对dATPS的催化效率比对dATP的催化效率高，且dATPS不是荧光素酶的底物。

第三步——ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP，ATP驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素（oxyluciferin）的转化，氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。

ATP sulfurylasePPi+APS —————————> ATPLuciferase，ATPLuciferin —————————> oxyluciferin光信号由CCD摄像机检测并由软件pyrogram™反应为峰。

每个光信号的峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。

第四步——ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬灭光信号，并再生反应体系。

第五步——然后加入下一种dNTP。

在以上步骤循环进行中，互补DNA链合成，序列从pyrogram™的信号峰中决定。

利用PSQ96系统进行测序分析可期望得到20-30个碱基的读序长度，但是和任何测序技术一样，最大读序长度取决于模板的二级结构、碱基组成、PCR产物质量和其他参数。

焦磷酸测序反应

焦磷酸测序反应
主要内容 ❖ 一，焦磷酸测序简介
❖ 二，Pyro Q24 Adv 测序的工作流程 ❖ 三，仪器维护
焦磷酸测序简介
基于合成的测序（边合成边测序），对DNA 序列进行精确分析和定量分析。
焦磷酸测序反应 体系中有4 种酶
DNA-Polymerase（DNA聚合酶） ATP-Sulfurylase（ATP硫酸化酶） Luciferase（荧光素酶） Apyrase（三磷酸腺苷双磷酸酶） 每次只加一种dNTP（A，T，C，G）
C
A
G
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
G
T
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T
分配顺序:
C a/g T C T G C T
C
A
G
T
C
T
G
CT
焦磷酸测序简介
Example: Genotyping
要分析的片断: a/g C T G C C T 基因型为 A/G的杂合子
2个半倍峰高的峰
1倍峰高的参考峰
2倍峰高的参考峰
C
A
G
T
阴性对照
C
T
G
C vs 焦磷酸测序
传统的测序 整基因组测序 研究未知基因 对DNA大片段测序
*Ronaghi, M., Uhlén, M., Nyrén, P. (1998) Real-time pyrophosphate detection for DNA sequencing. Science 281:363.

甲基化 焦磷酸测序

甲基化 焦磷酸测序

甲基化焦磷酸测序什么是甲基化焦磷酸测序？甲基化焦磷酸测序（Methylated CpG island recovery assay sequencing，MIRA-seq）是一种用于检测DNA甲基化的高通量测序技术。

DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰形式，它在调控基因表达、细胞分化和发育、肿瘤发生等过程中起着重要的作用。

MIRA-seq技术通过将DNA中的甲基化位点与未甲基化位点区分开来，从而实现对DNA甲基化状态的检测和定量。

该技术结合了焦磷酸测序（sequencing by synthesis，SBS）和甲基化特异性结合蛋白质（methyl-CpG binding domain protein，MBD）的结合能力，能够高效地富集甲基化位点，并通过高通量测序得到其精确位置和数量信息。

MIRA-seq的原理MIRA-seq主要包括以下几个步骤：1.DNA提取：从待检样品中提取总DNA。

2.修剪：将提取得到的总DNA进行修剪处理，去除低质量碱基。

3.甲基化富集：使用甲基化特异性结合蛋白质（MBD）结合甲基化位点，将甲基化的DNA片段富集出来。

未甲基化的DNA片段则不会与MBD结合。

4.PCR扩增：对富集得到的甲基化DNA片段进行PCR扩增，以得到足够多的DNA样本用于测序。

5.测序：对PCR扩增得到的甲基化DNA样本进行高通量测序。

可以选择不同的测序平台，如Illumina、PacBio等。

6.数据分析：将测序得到的数据进行比对和分析，确定甲基化位点的位置和数量信息。

MIRA-seq与其他甲基化检测方法的比较与传统的甲基化检测方法相比，MIRA-seq具有以下优势：1.高通量：MIRA-seq利用高通量测序技术进行数据获取，能够同时检测大量的甲基化位点。

2.高灵敏度：MIRA-seq能够将目标片段从复杂的DNA混合物中富集出来，提高了目标位点的检测灵敏度。

3.高准确性：MIRA-seq采用了PCR扩增和高通量测序技术，可以获得高质量的测序数据，提高了甲基化位点的检测准确性。

e7-3焦磷酸测序与深度测序

e7-3焦磷酸测序与深度测序

e7-3 焦磷酸测序与深度测序1. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序需要在同一反应体系中发生由4种特异性酶催化的级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其参入到引物链的3′-端，并释放出等量的焦磷酸基团（PPi）。

PPi可转化为可见光信号，并最终转化为一个峰值。

每个峰值的高度与反应中参入的核苷酸数目成正比。

第一轮反应结束后，再加入下一种dNTP，继续下一轮DNA链的合成。

整个测序反应分为四步[图e7-3(1)]：图e7-3(1) 焦磷酸测序的原理（1）将单链DNA模板与其特异性的测序引物结合，然后加入四种酶的混合物，包括：DNA聚合酶、ATP硫酸化酶（A TP sulfurylase，APS）、荧光素酶（luciferase）和双磷酸酶（apyrase）。

反应底物有腺苷-5′-磷酸硫酸（adenosine-5′-phosphosulfate，APS)和荧光素（luciferin）。

（2）向反应体系中加入1种dNTP，如果它正好能和DNA模板的下一个碱基配对，就会在DNA 聚合酶的作用下，被添加到测序引物的3′-端，同时释放出1分子的PPi。

dA TP 由腺苷-α硫-三磷酸（deoxyadenosine alfa-thio triphosphate，dATPαS）替代，原因是DNA聚合酶对dATPαS的催化效率比对dA TP的催化效率高，且dATPαS不是荧光素酶的底物。

（3）在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和APS结合形成ATP；在荧光素酶的催化下，生成的ATP又可以和荧光素结合，形成氧化荧光素，同时产生可见光。

通过电荷耦合器（charge coupled device，CCD）光学系统，即可获得一个特异的检测峰，峰值的高低和相匹配的碱基数成正比。

（4）反应体系中剩余的dNTP和残留的少量A TP在双磷酸酶的作用下发生降解。

（5）加入另一种dNTP，按第2、3、4步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。

甲基化 焦磷酸测序

甲基化 焦磷酸测序

甲基化焦磷酸测序
甲基化是指DNA中的嘌呤和胸腺嘧啶在碳5位置上的甲基化修饰。

在DNA序列中，甲基化可以影响基因的表达和基因组稳定性。

焦磷酸测序（Bisulfite Sequencing）是一种常用的用于检测DNA甲基化的方法。

该方法利用二硫酸盐处理DNA样本，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，但甲基化的胞嘧啶不会被转化。

然后再通过测序分析 DNA样本中的胞嘧啶和尿嘧啶的比例，从而确定DNA序列中的甲基化位点。

甲基化和焦磷酸测序在研究中常用于探究基因组中的表观遗传修饰和调控以及基因的表达和调控机制。

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学海无涯
何基因的表达量差异分析;(4) 用磁性微球技术将PCR 产物制备成单链，根据来源特异性反 转录引物中来源标签序列进行焦磷酸测序。测序结果中，各来源特异性碱基的相对峰高即 代 表相对基因表达量差异。本方法称之为 SRPP 法(Sequence tagged reverse transcription PCR with pyrosequencing)。
3.2 焦磷酸测序的定量特性
在同一焦磷酸测序反应体系中，产生的荧光信号强度与 ATP 的量成正比，而 ATP 的量 与聚合的 dNTP 个数成正比，所以可以根据图谱中测得的信号强度推测出模板 DNA 相对含 量。为了验证焦磷酸测序的定量特性，人为设计了一条测序单链(5′ GG TT CC AA G T C A CCCCGCCCGC 3′ )和一条测序引物(5′ GCGGGCGGGG 3′)，使测序单链的 3′端与测序 引物单链的 5′端完全互补。两条单链退火后按 dTTP→dGTP→dATPαS→dCTP 的顺序循环 递加dNTP进行测序反应。结果显示，待测模板上测序引物的延伸序列为“T G A C TT GG AA CC”12 个碱基，其信号强度跟同质区的相同碱基个数成正比。这一结果表明，峰强度与被 引物延伸模板的量成正比，可通过测定各峰的峰高之比确定对应的模板的相对含量。本研 究 利用焦磷酸测序技术的定量特性，通过测序图谱中的峰高比值分析不同来源的基因相对 表达 量。
实验中用到的糖尿病、肥胖和正常小鼠的肝组织由南京师范大学生命科学学院提供。
2.2 RNA 的提取
用 Trizol 试剂盒抽提RNA，用紫外分光光度法测定RNA 浓度及纯度。
2.3 反转录合成 cDNA 第一链 取等量的不同来源的总 RNA，分别以来源特异性反转录引物反转录。即取总 RNA 0.05～2.0 μg 至 Nuclease free 的小管中，加 DEPC H2O 至 12 μL;65 ℃反应 5 min 后， 置冰上至少 1 min;在上述各小管中加入 10×第一链合成缓冲液 2 μL，0.5 mmol/L dNTP 混 合物，10 U RNase 抑制剂，200 U Omniscript Reverse Transcriptase，1 μmol/L 反转录 引物，加 DEPC H2O 至总体积为 20 μL。反转录条件为：37℃ 反应 1 h, 93 ℃反应 5 min， 然后中止反应。
具体测定过程如图 1 所示：(1) 用来源特异性反转录引物对不同来源的RNA 进行反转 录。引物由 4 部分组成：5′端为共用序列;位于引物中间的 4 个碱基为人为设计的来源特异 性标签，在图 1 中以深浅不同的 4 个小圆点表示;3′端为 oligo(dT)n 和用于固定 oligo(dT)n 位置的两个兼并碱基。来源特异性反转录引物的碱基组成和数目都相同，只是位于中间的来 源特异性碱基的排列位置有所差异;(2) 不同来源的 cDNA 稀释后等比例混合;(3) 用生物素 标记的基因特异性引物和共用引物扩增上述混合物，通过改变基因特异性引物就可以进行 任
(DNA)n+dNTPpolymerase(DNA)n+l+PPi(1)
PPi+APSATP sulfurylaseATP+SO2-4(2)
ATP+Luciferin+O2luciferaseAMP+PPi+Oxyluciferin+CO2+hv(3)
dNTPApyrasedNDP+PiApyrasedNMP+Pi(4)
1引 言 差异表达基因与疾病密切相关，深入研究可在基因水平揭示疾病的发病机制。目前，用 于检测基因表达水平的技术主要有SAGE 法[1]、实时荧光定量 PCR 法[2,3]和基因芯片法[4] 等。但这些方法存在仪器设备昂贵、定量性能差以及同时测定基因表达量的来源数目受限等 缺点。 焦磷酸测序技术是新近发展起来的一种基于酶催化化学反应的测序技术[5～8]，不需要 使用荧光标记，定量性能好。目前，焦磷酸测序技术多用于单核苷酸多态性(SNP)分析、微 生物分型和基因甲基化分析等。本研究将焦磷酸测序技术用于基因表达量差异的比较分析， 考察了其可行性和准确性，并将其应用于检测Egr1 基因在糖尿病、肥胖症和正常小鼠中的 差异表达。
ATPApyraseADP+PiApyraseAMP+Pi(5) 为了定量测定基因表达量差异，本研究将碱基序列标记法与焦磷酸测序解码技术相结 合，其关键点在于：在不同来源的同一基因中标记上区别样品来源的特异性标签;对标记序 列进行解码和定量测定。采用反转录引物将来源特异性碱基标记到各来源待测基因，然后 用 焦磷酸测序定量测定标记序列。
第 2 步图示(图片来自互联网) 第 3 步：在 ATP 硫酸化酶的作用下，生成的 PPi 可以和 APS 结合形成 ATP;在荧光素酶的催化下，生成 的 ATP 又可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光。通过 CCD 光学系统即可获得一个特异 的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比。
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Pyrosequencing 技术的原理 Pyrosequencing 是一项全新的 DNA 测序技术，可以快速、准确地测定一段较短的目标片段。其基本 原理如下： 第 1 步：1 个特异性的测序引物和单链 DNA 模板结合，然后加入酶混合物（包括 DNA Polymerase、 ATP Sulfurylase、Luciferase 和 Apyrase）和底物混合物（包括 APS 和 Luciferin）。 第 2 步：向反应体系中加入 1 种 dNTP,如果它刚好能和 DNA 模板的下一个碱基配对，则会在 DNA 聚 合酶的作用下，添加到测序引物的 3‘末端，同时释放出一个分子的焦磷酸（PPi）。
2.4 基因特异性PCR 不同来源的cDNA 等比例混合，以共用引物CP(5′ CCA TCT GTT CCC TCC CTG TC 3′)和生物素标记的基因特异性引物(GSP)进行扩增反应。PCR 体系为： cDNA 等比例 混 合液 1 μL， 0.3 μmol/L CP 和 GSP，1.5 mmol/L Mg2+， 0.2 mmol/L dNTP 混合物， 10×PCR 缓冲液 5 μL，5×Q 溶液 10 μL ， 1 U HotStar Taq DNA 聚合酶，并加入灭菌 蒸馏水至 50 μL。PCR 反应程序为： 94 ℃ 变性 15 min，热循环 35 次(94 ℃, 40 s; 60 ℃, 40 s; 72 ℃, 1 min )， 72 ℃延伸 10 min， 4 ℃保存。基因特异性引物的序列见表 1。表 1 实验用引物
2.5 焦磷酸测序固相单链模板的制备 取 5 μL 戴诺磁珠(Dynabeads)，用磁铁吸弃上清液。磁珠以 100 μL B&W Buffer(10 mmol/L Tris HCl, pH 7.5, 1 mmol/L EDTA, 2.0 mol/L NaCl)洗涤两遍，最终悬浮于 50 μL B&W 缓冲液中;加入 50 μL PCR 产物，37℃反应 30 min;用磁铁吸弃上清液，磁珠以 180 μL H2O 洗涤两遍，加入 0.1 mol/L NaOH 溶液 20 μL，混匀室温放置 5 min 使 PCR 产物变性; 磁铁吸弃上清液，磁珠以 100 μL B&W 缓冲液洗涤两遍，100 μL 1×退火缓冲液洗一遍，最
具体事例
【摘要】 建立了一种将序列标记反转录聚合酶链反应(PCR)与焦磷酸测序技术结合的相对 基因表达量测定法(简称“SRPP”)。先用来源特异性引物对不同来源的同一基因通过反转录 标记上特异性标签，PCR 后用焦磷酸测序法对扩增产物进行序列解码，使得测序结果中的 序列代表基因的来源，峰高代表基因在不同来源中的相对表达量。用实时荧光定量 PCR 法 对本方法的准确性进行了验证，结果表明，SRPP 可以同时准确测定同一基因在 3 个不同来 源中的表达量，并实际测定了Egr1 基因在糖尿病、肥胖和正常小鼠肝中的表达量差异。 【关键词】 序列标记反转录, 聚合物链反应，焦磷酸测序，基因表达
2 实验部分 2.1 仪器、试剂与材料 21R 型台式高速冷冻离心机(美国Beckman 公司);Gene SpeⅢ微量核酸蛋白测定仪(日 本 Naka InstrPCR 仪(美国 MJ
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Research 公司)。焦磷酸测序装置由本实验室自行组装[9,10]。此装置主要由焦磷酸测序反 应模块、荧光信号放大和数据采集 3 部分组成。反应模块由位于中间的反应池通过毛细管 与四周的 dNTP 储液池相连组成。通过注射器施压使 4 种 dNTP 循环加入反应池完成测序 反应。荧光信号通过R6335 光电倍增管(日本 Hamamatsu Photonics K.K.公司)放大后，经 BPCL 微弱发光测量仪(北京中国科学院生物物理研究所)采集数据。
第 3 步图示(图片来自互联网) 第 4 步：反应体系中剩余的 dNTP 和残留的少量 ATP 在 Apyrase 的作用下发生降解。
第 4 步图示(图片来自互联网) 第 5 步：加入另一种 dNTP,使第 2-4 步反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的 DNA 序列信 息。
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第 4 步图示(图片来自互联网) Pyrosequecing 技术操作简单，结果准确可靠，可应用于 SNP 位点检测、等位基因频率测定、细菌和 病毒分型等领域。 →如果您认为本词条还有待完善，请 上一篇下一篇
图 1 碱基序列标记法结合焦磷酸测序解码技术测定基因表达量差异的原理图
Fig.1 Principle of comparative gene expression analysis by coupling sequence tagged reverse transcription polymerase chain reaction(PCR) with pyrosequencing (SRPP)由于不同来源的同一基因在单管中只用一对引物进行 PCR，并且 扩增产物的碱基组成和含量完全一样，仅 4 个碱基的排列顺序不一样，具有相同的保留时 间。所以来源不同，表达量不同的同一基因在单管中能实现等比例扩增。SRPP 测定峰高比 值也即能代表起始基因的相对表达量。