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焦磷酸测序技术的流程英文回答：Sequencing technologies have revolutionized the fieldof genomics, allowing us to unravel the genetic code of organisms. One of the widely used sequencing techniques is the Sanger sequencing method, also known as the chain termination method or dideoxy sequencing. This technique relies on the incorporation of chain-terminating dideoxynucleotides (ddNTPs) during DNA synthesis.The process of Sanger sequencing involves several steps. First, the DNA sample of interest is isolated and purified. This can be done from various sources, such as blood, tissue, or cultured cells. Once the DNA is extracted, it is fragmented into smaller pieces to facilitate the sequencing process.Next, the DNA fragments are amplified using the polymerase chain reaction (PCR). PCR is a technique thatallows for the amplification of specific DNA sequences. It involves multiple cycles of DNA denaturation, primer annealing, and DNA synthesis. During PCR, primers specific to the target DNA sequence are used to initiate DNA synthesis.After PCR amplification, the sequencing reaction is set up. This involves mixing the amplified DNA fragments with a primer, DNA polymerase, and a mixture of normal deoxynucleotides (dNTPs) and small amounts of chain-terminating ddNTPs. The ddNTPs lack the 3'-OH group necessary for DNA chain elongation, resulting in the termination of DNA synthesis at specific positions.The sequencing reaction mixture is then subjected to capillary electrophoresis. In this step, the DNA fragments are separated based on their size and charge as they migrate through a gel-filled capillary under the influence of an electric field. The fragments are detected by a fluorescent dye attached to the ddNTPs, which emits a signal when excited by a laser.The data obtained from the capillary electrophoresisare processed and analyzed using specialized software. The software assigns a nucleotide base to each peak in the electropherogram, which represents the sequence of the DNA fragment. The sequence is determined by analyzing the order of the peaks corresponding to the different nucleotides.Once the sequence is obtained, it can be compared to known reference sequences or analyzed further for various purposes, such as identifying genetic variations orstudying gene expression patterns.中文回答：焦磷酸测序技术（Sanger测序）已经彻底改变了基因组学领域，使我们能够解读生物体的遗传密码。
焦磷酸测序原理焦磷酸测序是一种常用的测序技术，通过测序仪器对DNA序列进行快速而准确的测定。
它是一种基于合成DNA链延伸的原理，可以在短时间内测定DNA序列。
焦磷酸测序的原理是利用DNA合成过程中的焦磷酸（dideoxynucleotide）来终止链延伸的反应。
焦磷酸是一种具有缺少3'-羟基的核苷酸，它会被DNA多聚酶插入到正在合成的DNA链中，但一旦焦磷酸被插入，DNA链延伸就会停止。
这样，每次加入一个不同的焦磷酸，就可以得到具有不同长度的DNA片段。
焦磷酸测序的步骤如下：1. DNA模板制备：首先，需要从待测DNA样本中提取出目标DNA片段。
这可以通过PCR（聚合酶链反应）或其他方法来进行。
然后，将目标DNA片段加入到一个含有多聚酶和引物的反应混合物中。
2. DNA合成：在反应混合物中，加入四种不同的焦磷酸（ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），以及四种普通的核苷酸（dATP、dCTP、dGTP和dTTP）。
这样，当DNA链延伸到某个位置时，如果接下来要插入的是焦磷酸，链延伸就会终止。
3. 前序列扩增：在DNA合成过程中，每次加入的焦磷酸是不同的，因此会得到不同长度的DNA片段。
然后，将反应混合物分离成不同长度的DNA片段。
4. DNA片段分离：将反应混合物中的DNA片段进行电泳分离，根据片段大小的不同，可以得到一个DNA片段长度的分布图。
5. 数据分析：通过测序仪器对DNA片段进行测定，得到每个片段的长度信息。
根据这些信息，可以推导出DNA序列。
焦磷酸测序的优点是速度快、准确性高、适用于多种类型的样品。
它被广泛应用于基因组学、遗传学、生物医学研究等领域。
然而，焦磷酸测序也存在一些限制，例如不能测定长片段的DNA，且在测序过程中容易产生误差。
焦磷酸测序是一种基于合成DNA链延伸的原理，通过插入焦磷酸来终止链延伸的反应，从而快速而准确地测定DNA序列。
它在基因组学和生物医学研究中具有重要的应用价值，为我们深入了解DNA序列提供了有效的工具。
焦磷酸测序名词解释焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的原理是通过对 DNA 序列进行扩增，并对扩增产物进行测序，最终得到 DNA 序列信息。
焦磷酸测序主要应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域，可以用于基因表达谱分析、基因突变检测、基因调控机制研究等。
相比其他基因测序技术，焦磷酸测序具有很多优势，如测序成本低、速度快、精度高等。
但是，焦磷酸测序也存在一些缺陷，如测序长度有限、难以测序复杂基因结构等。
尽管焦磷酸测序技术已经发展了多年，但它仍在不断演进和改进。
未来，焦磷酸测序技术将继续发展，并在更多领域得到应用。
1. 什么是焦磷酸测序焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA 序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
具体来说，焦磷酸测序技术利用了聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的特性，可以通过检测 ATP 合成过程中的光谱变化来确定 DNA 序列。
焦磷酸测序技术最初由来自瑞典斯德哥尔摩大学的科学家们开发，并于 1998 年由瑞典Pyrosequencing AB 公司商业化。
自此，焦磷酸测序技术就成为了一种广泛应用于基因组学、遗传学、转录组学等领域的技术手段。
2. 焦磷酸测序的原理焦磷酸测序（Pyrosequencing）是一种基因测序技术，它可以快速、高效地测定 DNA序列。
焦磷酸测序的工作原理是通过扩增 DNA 序列，并对扩增产物进行测序，最终得到DNA 序列信息。
焦磷酸测序的工作流程如下：1. 先将 DNA 样本进行扩增，得到扩增产物。
2. 然后将扩增产物与一种叫做反转录酶的蛋白质混合，使其能够将 DNA 序列转录成RNA 序列。
3. 将转录后的 RNA 序列与一种叫做聚苯乙烯四氢呋喃（ATP）合成酶的蛋白质混合，使其能够将 RNA 序列通过合成 ATP 来反应出 DNA 序列信息。
焦磷酸测序技术流程英文回答：Phosphorylation sequencing, also known as pyrophosphate sequencing or pyrosequencing, is a DNA sequencing technique that utilizes the detection of pyrophosphate release during DNA synthesis. It is a highly sensitive and accurate method for sequencing DNA and has been widely used in various research fields, including genomics, transcriptomics, and epigenomics.The process of phosphorylation sequencing involves several steps. First, the DNA sample is fragmented into smaller pieces, typically ranging from 100 to 500 base pairs. These fragments are then mixed with specific primers that bind to the DNA template. The primers are designed to initiate DNA synthesis.Next, the DNA fragments are subjected to a series of enzymatic reactions. DNA polymerase, along with otherenzymes and reagents, is added to the reaction mixture. As DNA synthesis occurs, pyrophosphate molecules are released. These pyrophosphate molecules are then converted into ATP (adenosine triphosphate) by the enzyme ATP sulfurylase.The ATP produced in the reaction is further utilized by luciferase, an enzyme that catalyzes the conversion of ATP to light. The light emitted is proportional to the amount of ATP generated, which in turn reflects the number of pyrophosphate molecules released during DNA synthesis. This light signal is detected by a detector and recorded as a peak in the sequencing trace.Based on the peaks observed in the sequencing trace, the sequence of the DNA template can be determined. The intensity and timing of the peaks provide information about the order of nucleotides in the DNA sequence. By analyzing the sequencing trace, the sequence of the DNA template can be reconstructed.Phosphorylation sequencing offers several advantages over other sequencing methods. It is a relatively fast andcost-effective technique, making it suitable for high-throughput sequencing projects. Additionally, it does not require the use of labeled nucleotides, as the pyrophosphate release itself serves as the detection signal. This eliminates the need for complex labeling and detection procedures.中文回答：焦磷酸测序技术，也称为焦磷酸测序或火花测序，是一种利用DNA合成过程中焦磷酸释放的检测来进行DNA测序的技术。
简述焦磷酸测序技术的流程英文回答：The process of pyrophosphate sequencing, also known as pyrosequencing or 454 sequencing, involves several steps.It is a high-throughput DNA sequencing method that utilizes the detection of pyrophosphate released during DNA synthesis. Here is a brief overview of the pyrophosphate sequencing workflow:1. DNA Sample Preparation: The first step is to extract the DNA from the sample of interest. This can be done using various methods depending on the source of DNA. For example, if the DNA is from a blood sample, it can be extractedusing a commercial DNA extraction kit.2. DNA Fragmentation: The extracted DNA is then fragmented into smaller pieces. This can be achievedthrough mechanical shearing, enzymatic digestion, or sonication. The purpose of fragmentation is to obtainshorter DNA fragments that can be sequenced more easily.3. Adapter Ligation: Short DNA sequences called adapters are ligated to the fragmented DNA. Adapters contain specific sequences that allow for attachment to the sequencing platform and facilitate the amplification of DNA fragments.4. Emulsion PCR: The adapter-ligated DNA fragments are then amplified using emulsion polymerase chain reaction (PCR). This process involves the encapsulation ofindividual DNA fragments in water-in-oil emulsion droplets, each containing a single DNA fragment and the necessary reagents for PCR amplification.5. DNA Sequencing: The emulsion PCR droplets containing the amplified DNA fragments are then transferred to a sequencing plate or flow cell. The DNA fragments are immobilized on a solid support and subjected to DNA synthesis. During DNA synthesis, the addition of each nucleotide triggers the release of pyrophosphate if it is incorporated into the growing DNA chain.6. Pyrophosphate Detection: The released pyrophosphate molecules are converted into visible light signals through a series of enzymatic reactions. These light signals are captured by a detector and recorded as a sequence of peaks, representing the order of nucleotides incorporated during DNA synthesis.7. Data Analysis: The recorded sequence of peaks is then analyzed using bioinformatics tools and software. The sequence data is aligned to a reference genome or assembled de novo to generate a consensus sequence.8. Result Interpretation: The final step involves interpreting the sequence data to identify genetic variations, mutations, or other relevant information. This can be done by comparing the obtained sequence with known reference sequences or by searching for specific genetic markers.中文回答：焦磷酸测序技术的流程包括以下几个步骤。
甲基化检测之⾦标准焦磷酸测序技术中科普瑞作为中国⼗万⼈甲基化组计划的执⾏⽅，对甲基化检测的相关技术进⾏了优化升级，建⽴了专业的甲基化检测⼀站式服务平台。
今天⼩编为⼤家介绍甲基化检测的⾦标准—焦磷酸测序技术，后⾯陆续介绍其他甲基化检测技术，敬请期待哦！焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）作为⼀种新的序列分析技术，能够快速地检测甲基化的频率，对样品中的甲基化位点进⾏定性及定量检测，已成为甲基化检测的⾦标准。
焦磷酸测序技术原理焦磷酸测序技术是由4种酶（DNA 聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶）催化的同⼀反应体系中的酶级联化学发光反应。
具体过程如下：步骤1：扩增DNA⽚段并对焦磷酸模板链进⾏⽣物素化。
通过变性，分离⽣物素化的单链PCR 扩增⼦并使其与⼀条测序引物进⾏杂交。
步骤2：将杂交引物和单链模板与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶，以及底物腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）和荧光素共孵育。
步骤3：第⼀个脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）被引⼊反应。
DNA聚合酶催化dNTP，使其在互补模板链的情况下对测序引物进⾏延伸。
每个核苷酸的添加都对应着等摩尔数焦磷酸（PPi）的释放。
步骤4：ATP硫酸化酶在腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）存在的情况下将PPi转化为ATP。
⽣成的ATP为荧光素酶介导的荧光素氧化反应提供能量，并⽣成与ATP的数量成⽐例的可见光。
电荷耦合器（CCD）摄像头检测到荧光素酶催化反应所⽣成的光，并将其作为原始输出数据中的⼀个峰值（热解图Pyrogram）。
每个峰值（光信号）的⾼度与核苷酸结合的数⽬呈⽐例关系。
步骤5：腺苷三磷酸双磷酸酶是核苷酸的降解酶，持续地对未结合的核苷酸和ATP进⾏分解。
当分解完成时，便会引⼊另⼀个核苷酸。
步骤6：dNTP的添加反应在持续进⾏着。
应注意脱氧腺苷三磷酸α-硫代三磷酸（dATPαS）能够作者为天然脱氧腺苷三磷酸（dATP）的替代物，被DNA聚合酶有效利⽤，却并不会被荧光素酶所识别。
焦磷酸测序操作流程一、准备工作。
焦磷酸测序听起来就很厉害的样子呢，但其实只要我们做好准备工作，就没有那么难啦。
我们得先把实验室的环境准备好哦。
要确保实验室干净整洁，各种仪器摆放整齐，这样我们在操作的时候心情也会好很多呢。
然后就是仪器的检查啦。
就像我们出门前要检查钥匙有没有带一样，要看看测序仪是不是能正常工作。
检查它的电源连接是否稳固，各个部件有没有松动或者损坏的迹象。
要是仪器出问题了，那可就像做饭的时候炉灶坏了一样，啥都干不成啦。
试剂也是很重要的一部分哦。
焦磷酸测序需要用到很多种试剂呢，我们要把它们都找齐。
这些试剂就像做菜的调料一样，少了哪一种都不行。
要检查试剂的保质期，要是用了过期的试剂，那结果可就没准儿啦。
就像过期的牛奶喝了会拉肚子一样，过期的试剂肯定会让测序结果出岔子的。
二、样本准备。
样本可是我们测序的主角呢。
我们要小心翼翼地对待它们。
首先要采集到合适的样本，这个过程就像寻宝一样，要找对地方，用对方法。
如果是生物样本的话，要确保采集的样本具有代表性。
比如说从组织中采集样本，可不能只采到病变边缘或者完全正常的地方，得采到能反映真实情况的部分。
采集好样本之后，就要对样本进行处理啦。
这个处理过程就像是给样本做个“美容”，让它能更好地适应测序的过程。
可能需要提取DNA或者RNA之类的，这个过程要按照标准的操作规程来做。
要是手法太粗糙，就像给头发做造型的时候用力过猛，把头发扯断了一样，样本也可能被破坏掉呢。
处理好的样本要进行定量和质检。
这一步就像是给样本量身高称体重一样，看看它符不符合测序的要求。
如果样本的量太少或者质量不好，就像一个身体虚弱的运动员参加比赛，很难有好的表现的，测序结果可能就不准确啦。
三、测序反应。
把混合好的东西放到测序仪里面，就像把宝贝放进保险箱一样。
然后启动测序仪，这个时候就只能耐心等待啦。
测序仪在工作的时候，就像一个勤劳的小蜜蜂，在那里忙忙碌碌地进行着各种复杂的操作。
我们可不能去打扰它哦，不然它可能就会出错啦。
焦磷酸测序（Pyrosequencing）实验技术及方法先进的基于焦磷酸测序（Pyrosequencing）的PSQ96 MA技术平台，能提供基于序列测定的SNP检测、等位基因频率分析和甲基化检测服务。
另外，还提供短片段的测序服务（50-100 bp），适用于细菌和病毒分型等研究领域。
基于Pyrosequencing的SNP分析具有快速、高通量的特点，完成96个样品的SNP分析仅需10分钟。
整个实验过程（包括PCR扩增、单链分离、P yrosequencing测序和数据分析）也只需3-4 小时。
PSQ96 MA配备有功能强大的SNP分析软件，可支持SNP位点的复合检测（在一个反应体系中最多可同时检测3个不同位置的SNP位点）。
对于混合样品，则可准确测定特定SNP位点的基因型频率。
一．常规SNP检测样品要求用户须提供足够量的基因组DNA样品，一般需200ng/样品/位点。
二．基于Pyrosequencing技术的甲基化检测服务1．甲基化研究意义DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。
DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。
,真核生物中甲基化的主要形式是在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下，使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。
这种DNA修饰方式并没有改变基因序列，但是它参入了基因的表达调控。
DNA甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及肿瘤发生过程中起着极其重要的作用。
2．基本流程：通过亚硫酸氢盐处理基因组DNA，使其中未甲基化的C转变成T后，运用特异性引物扩增目的区段，然后用Pyrosequencing技术测定目标位点中 C/T的比率，以此判断目标位点的甲基化程度。
焦磷酸测序实验步骤
Control oligo稀释配置，需要二次稀释到0.04um：
第一次稀释：体积浓度
Control oligo 5ul 20um
1×Dilution buffer 45ul
第一次所得溶液50ul 2um
第二次稀释：
第一次所得溶液3ul 2um
1×Dilution buffer 147ul
第二次所得溶液 150ul 0.04um
1.微珠固定PCR产物
将生物素标记的PCR 产物固定到链霉亲和素包被的琼脂糖微珠（Streptavidin Sepharose High Performance，GE Healthcare）上。
1.1 轻摇包被链霉亲和素的琼脂糖微珠，直至获得均质溶液。
1.2 在一个试管中混合链霉亲和素包被的琼脂糖微珠总量（2 μl / 样品）（新的琼脂糖微珠浓度比原来的提高了一倍，只需加1ul）与结合缓冲液（40 μl / 样品）。
添加高纯度水至80 μl / 孔的总体积—包括第1.4 步中添加的PCR产物，纯水量取决于所用PCR 产物的量。
例如：如果使用15 μl PCR 产物、2 μl 微珠和40 μl 结合缓冲液，则必须添加23 μl 高纯度水。
1.3 将第1.2 步中制备的溶液添加至24 孔PCR 孔板或联排管中。
1.4 根据孔板设置，添加5–20 μl 优化好的生物素标记的PCR 产物至PCR 孔板（或联排管）的每个孔槽。
（注意：每个孔槽的总体积应当是80 μl。
）
1.5 使用孔板条盖密封PCR 孔板（或联排管）。
确保孔槽之间没有泄漏。
1.6 使用振荡混合器（1400 rpm）不断振荡PCR 孔板（或联排管）至少5–10 分钟。
（注意：微珠沉淀快速，因此停止震荡后必须在一分钟内立即使用，即立刻捕获琼脂糖微珠。
）
2. 真空工作站准备工作
2.1 准备以下试剂：（1）大约50ml乙醇（70%）；（2）大约40ml变性溶液；（3）大约50ml 1×洗涤缓冲液；（4）大约50ml超纯水；（5）大约70ml超纯水。
1×洗涤缓冲液稀释配置;
体积
wash buffer 5ml
高纯水 45ml
1×洗涤缓冲液 50ml
2.2 打开真空泵。
打开真空开关，进行测试试验，以确定过滤探针是否正常工作。
2.3 每次使用真空泵前要用超纯水检测过滤探针的通透性。
将事先准备好的装好超纯水的离心管插在PCR plant（PCR孔槽）上，将过滤探针降入超纯水中，超纯水如在20秒内被抽空则表明过滤探针正常，可以使用。
反之则需更换过滤探针。
2.4 取下1.6中振荡好的PCR孔板（注意：微珠极易沉淀。
如果离心管振荡后放置超过1分钟，则在捕获微珠之前再次振荡1分钟），将样品放入PCR plant，小心降下过滤探针至PCR孔板中，停留15秒；确保溶液全部被吸走，以捕获含有固定模板的微珠。
（确保所有离心管中的液体被吸出并且所有微珠都已被捕获到过滤探针的顶端。
）
2.5 将真空装置移至含有70%乙醇的试剂槽1，冲洗过滤探针5秒。
2.6 将真空装置移至含有变性溶液的试剂槽2，冲洗过滤探针5秒。
2.7 将真空装置移至含有洗脱缓冲液的试剂槽3，冲洗过滤探针10秒。
2.8 抬高真空装置超过90°垂线5秒，从过滤探针中排液。
2.9 握持真空装置到Q24 孔板上，关闭装置上的真空开关并悬空停留5秒，让负压散去。
2.10 通过左右轻摇真空装置，释放珠子至含测序引物的孔板中。
2.11 在真空装置关闭的情况下将真空装置转移至含有超纯水的试剂槽4，振荡10秒。
2.12 降下探针至含超纯水的第二个试剂槽5中并施加真空，清洗探针。
用70ml 超纯水冲洗过滤探针。
2.13 抬高真空装置超过90°垂线5秒，从过滤探针中排液。
2.14 关闭真空装置上的开关，并将其置于静止（P）位。
3. 分离DNA单链并将样本释放到PyroMark Q24孔板中
3.1将PyroMark Q24孔板放置在预热的孔板底座上80℃精确加热2分钟。
3.2 从孔板底座上取下孔板，使样本在室温（15-25℃）下至少冷却5分钟。
4. PyroMark Q24试剂的准备
4.1 打开PyroMark Q24试剂盒并取出含有酶和底物冻干粉的小瓶，以及含有核苷酸的试管。
4.2 按照试剂盒说明书用超纯水溶解并分装酶和底物（溶解后的酶和底物需在-20℃保存，最多可反复冻融3次，核苷酸只能在4℃保存。
），所有试剂需恢复室
温后再使用。
4.3 依照电脑程序计算出的体积，向试剂仓内加入酶、底物和核苷酸A、T、G、C （试剂仓最多使用30次，试剂仓在使用前必须是干燥的）
4.4
5. 在PyroMark Q24仪器上的运行
5.1 打开PyroMark Q24软件，点击new assay→new AQ assay→在sequence to
analyze中输入突变点序列，点击generat pupensation or ，点击保存；
5.2 点击new run→Instrument method→007，然后点击要测序的格子，点击保
存至U盘。
5.3 将含有运行文件的U盘插入仪器前面的USB端口中。
5.4 把加热好的孔板放到仪器上。
5.5 将试剂仓（酶、底物和核苷酸）的标签面面向自己放入仪器，打开孔板支座架放入孔板，关闭孔板支座架和仪器盖。
5.6 选择Run，并按OK。
5.7 在进入Run后，按select选择要运行的文件。
5.8 仪器运行结束并确认运行文件已保存至U盘后，按close。
取出U盘。
5.9 打开仪器，取出试剂仓，并对其进行反复清洗（清洗时一定要用高纯水洗涤，在满水的情况下用指腹按压各孔，检查加样孔是否通畅），废弃孔板。
5.10 当仪器不运行时，从主菜单郑徐泽shutdown（关机）并按OK
5.11 当It is now safe to turn off the instrument出现时，既可以关闭仪器，电源开关位于仪器后面。
6清洁试剂仓并确保其可用于分析
6.1 清除试剂仓中摄于的任何融合（试验完后，必须清洗试剂仓，不能过夜，以免堵塞）
6.2 采用高纯水冲洗试剂仓的隔室4次
6.3 使用高纯水喷洒针头外部
6.4 试剂仓用高纯水填满隔室淋洗针头，握持试剂仓在试剂槽或烧杯上方，同事用一根手指紧紧地按压在每一个隔室的顶部（必须佩带五分手套）
6.5 检查针头是否洁净，水束将直接凑够每个针头的顶端射出
6.6 检查水束是否直接从这头方向射出。
如果水束成角度流出，用高纯水填充隔
室并重复。
如果水仍然成角度流出，测废弃试剂仓
6.7 当所有针头都被淋洗和测试后，倒掉水，吧试剂仓侧过来放在无粉纸上晾干6.8 试剂仓晾干后，将其保存在无尘的地方。
