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分 子 生 物 学 实 验 讲 义内蒙古科技大学数理与生物工程学院自治区基础生物实验示范中心基础生物教学部2009年10月目录实验一质粒DNA的小量提取实验二琼脂糖凝胶电泳实验三大肠杆菌感受态细胞的制备实验四大肠杆菌感受态细胞转化宿主细胞实验五聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片断实验六重组DNA分子的构建实验七质粒DNA的酶切和电泳鉴定实验八植物基因组DNA的提取实验九植物基因组总RNA的提取实验十与人类遗传病相关的核苷酸重复序列的克隆实验一 质粒DNA的小量提取一、目的要求1、掌握用碱变性法提取质粒DNA的技术2、掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法二、基本原理在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb 之间，是双链闭合环状的DNA分子。
在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。
碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA 的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。
当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、仪器、材料和试剂（一）仪器微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计（二）材料含有质粒的大肠杆菌DH5a（三）试剂及溶液LB培养基、葡萄糖1、用于碱法提取质粒DNA的溶液溶液1（GET）缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HClpH8.0，用前加溶菌酶4mg/Ml。
实验一植物基因组DNA的分离一、相关知识分离植物DNA是分子生物学实验的一个基本要求。
不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。
例如，在构建用于筛选植物基因或其他诸如RFLP这样的遗传标记基因组DNA文库时，需要使用高相对分子质量、高纯度的DNA；而在进行遗传分析时，对DNA的纯度要求就可以低一些。
一般而言，一个好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准：（1）所得DNA的纯度应满足下游操作的要求，用于RFLP分析的DNA，其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行Southern杂交；用于PCR分析的DNA则不应含干扰PCR反应的污染物；（2）所得DNA应当完整，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型；（3）所得的DNA应有足够的量。
如果对植物进行大规模筛选，还应当满足操作程序应当快速、简便、价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂这样的要求。
二、实验原理植物DNA的提取程序应包括以下几项：首先，必须粉碎（或消化）细胞壁以释放出细胞内溶物。
分离总基因组DNA常用的破壁方法是将植物组织胀水，然后研磨成细粉；或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉沫。
其次，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中，这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。
去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。
通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子——镁离子。
最后，一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。
剧烈振荡或Tip头小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。
分离高相对分子质量的DNA还只是工作的一部分。
因为在粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。
大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RNase除去。
但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，往往用一些DNA纯化试剂盒来进一步纯化DNA。
实验质粒DNA的碱裂解法提取与纯化一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA, 大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份, 通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态, 但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上, 随着染色体的复制而复制, 并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子, 重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取, 本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法, 其基本原理为: 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时, 蛋白质与DNA发生变性, 当加入中和液后, 质粒DNA分子能够迅速复性, 呈溶解状态, 离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状, 离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如, 氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法, 但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA, 经过苯酚、氯仿抽提, RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA, 所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求, 故在分子生物学实验室中常用。
二、实验试剂1.溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml, 0.5M EDTA（pH 8.0）10ml, 葡萄糖4.730g, 加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min , 贮存于4℃。
2.溶液Ⅱ: 0.2N NaOH, 1% SDS。
2N NaOH 1ml, 10%SDS 1ml, 加ddH2O至10ml。
实验安排实验一PCR引物设计PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。
因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。
对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
1.引物的特异性：引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。
2.避开产物的二级结构区：某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。
用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。
实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。
若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。
3.长度：寡核苷酸引物长度为15-30bp，一般为20-27bp。
引物的有效长度Ln 值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。
4.G+C含量:G+C含量一般为40%~60%。
其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。
若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。
5.碱基础随机分布:引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
6.引物自身:引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构影响引物本身复性。
这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于4bp。
7.引物之间:两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。
分子生物学实验课讲义第一讲实验室纪律、实验室安全及分子生物学基本操作1．所有必修及选修该实验课的学生必须按时进入实验室并按分组名单就座，不得擅自调整组号，有特殊原因不能来上课者须提供书面请假条及相关证明。
2．上课期间须关闭手机铃声，不得使用任何音乐播放器，禁止讨论与实验课无关的话题，禁止阅读与实验课无关的读物。
3．严格按照正确的操作规程使用仪器，用后须关闭电源，不要用手直接触摸有害试剂，废弃物品须丢在指定位置。
4．保持实验台面整洁，如有污染，须及时清理，实验室地面卫生由值日学生在实验结束后统一打扫。
5．分子生物学实验每个组常用器材包括一套取液器（20 μl、200 μl及1000 μl 共三把）、取液器吸头以及离心管等。
6．20 μl取液器的量程为1 μl ～20 μl，200 μl取液器量程为20 μl ～200 μl，1000 μl取液器量程为200 μl ～1000 μl，20 μl取液器和200 μl取液器配黄色吸头，1000 μl取液器配蓝色吸头。
7．吸取液体前，首先要选择合适的取液器（例如吸取400 μl液体就应该选择1000 μl取液器），然后将取液器调至所需刻度，插好吸头，按下取液器顶端按钮，将吸头尖端伸至液面下1～2 mm处，缓慢松开按钮，最后把所吸液体打入离心管或其它容器（打的时候可稍快）。
8．离心管最好在使用之前做上记号，以免不同样品之间产生混淆，离心管在离心机中必须平衡放置，并且离心管把要向外以便确定可能产生的沉淀的位置。
第二讲柱离心法小量提取质粒DNA实验原理：质粒是细菌中独立于染色体之外的较小的环状双链DNA，它通常携带某种药物（如氨苄青霉素，卡那霉素，链霉素，四环素等）的抗性基因，具有独立的复制原点，并且具有较高的拷贝数（从几个到几百个不等）。
柱离心法首先用碱使大肠杆菌裂解，并使其中的DNA（包括质粒及细菌的染色体DNA）全部变性，再用酸性缓冲液中和，质粒DNA由于分子较小，很快复性，而染色体DNA分子巨大，几乎不能复性，最后和细胞碎片及膜蛋白共沉淀被离心去除，上清液中含有复性的质粒DNA，蛋白质，RNA，并且盐浓度较高，在这种条件下，质粒DNA能够牢固地结合在离心柱中的吸附基质上，而大多数蛋白质和RNA在离心时被穿过，残留在吸附基质上的少量蛋白质和RNA可以用漂洗液洗去，最后，吸附在离心柱上的质粒DNA用低离子强度的溶液或水洗脱。
实验一人血液基因组DNA的提取1．吸取500μl 红细胞裂解液到一个1.5ml 离心管。
2．将抗凝全血（使用前回复到室温）颠倒混匀后，吸取100μl 加到上述装有红细胞裂解液离心管中，颠倒6-8 次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀。
3．室温放置10 分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。
4．12,000 rpm 离心20 秒，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团和大约10μl 的残留上清。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入900μl 红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3，4。
5. 涡旋振荡15 秒重悬白细胞团，充分分散白细胞团。
白细胞的重悬分散对下一步裂解非常重要，白细胞未打散就加入裂解液，会导致白细胞不能充分裂解，形成肉眼可见团块。
6．加入300μl 细胞核裂解液到重悬的白细胞，迅速有力吹打几次混匀以裂解白细胞，由于基因组DNA 立刻释放出来，这个时候混合物会马上变得十分粘稠，立刻停止吹打（以免剪切断基因组DNA），颠倒旋转离心管10 次保证裂解液和所有的白细胞接触并裂解。
这一步对是否获得满意的裂解效果和基因组完整性很关键。
吹打力量如果太小，不足以迅速将细胞团打散并和裂解液混匀，形成肉眼可见团块无法裂解完全（裂解液如果是和细胞团块而不是分散的细胞接触，立刻会和细胞团块表面作用后形成粘稠的屏障，不容易再渗透入团块内部）。
裂解液和细胞接触后基因组DNA立刻释放出来，这个时候吹打力量过大，又易造成基因组断裂。
正确做法，就是迅速有力的吹打几次，几秒钟后基因组释放出来（变粘稠）立刻停止吹打，或者改用大口径枪头（剪去枪头尖）轻柔吹打或者颠倒混匀。
如果还有肉眼可见团块，可在65℃温育30-60 分钟（不要超过一小时）至裂解完全。
7．可选步骤：在裂解物中加入RNase A（10mg/ml）至终浓度100μg/ml，颠倒25 次混匀，37℃温育15 分钟去除残留RNA.然后冷却回室温。
实验一自抗凝血中提取哺乳动物细胞基因组DNA一、实验目的1、了解核酸的基本特性。
2、掌握DNA提取和鉴定的方法。
二、实验原理核酸的分离与提取是分子生物学研究中很重要的基本技术，核酸样品的质量可能直接关系到后续实验的成败。
核酸包括DNA、RNA两种分子，在真核细胞中都是以与蛋白质相结合的状态存在（DNA与组蛋白形成核小体，再折叠缠绕成染色体），真核生物基因组DNA 为双链线性分子，存在于细胞核内。
基因组DNA的提取需经过DNA的释放（破膜）、DNA与蛋白质的分离，DNA的沉淀等过程。
分离纯化核酸的总原则：1、保证核酸一级结构的（核苷酸序列）的完整性，全部的遗传信息均储存在一级结构中。
2、排除其它分子的污染。
a)对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子。
b)生物大分子：蛋白质、多糖和脂质。
c)其它核酸分子：RNA.三、实验试剂1、TKM缓冲液10 mmol/L Tris-HCl pH 7.6 （Tris 三羟甲基氨基甲烷）10 mmol/L KCl2 mmol/L EDTA4 mmol/L MgCl22、TE缓冲液10 mmol/L Tris-HCl1 mmol/L EDTA pH 8.03、10％SDS4、饱和氯化钠四、实验步骤1、取0.5ml EDTA抗凝血于清洁的1.5ml Eppendorf离心管中。
2、加入0.5ml TKM缓冲液，13μl Triton X-100（终浓度为1.2％），颠倒混匀。
室温静置10min。
3、台式离心机离心，6,000rpm×5min。
（低渗破红细胞膜）。
4、弃上清，在离心管中加入1.0ml TKM缓冲液，混匀后离心，6,000rpm×5分钟，重复步骤3几次，直至沉淀呈黄白色。
（清洗）5、弃上清，于沉淀中加入200μl TKM缓冲液，15μl 10％SDS（终浓度为0.7％），3μl蛋白酶K，混匀后于55℃保温20分钟。
（破白细胞膜）6、于离心管中加入75μl 饱和（≈6mol/L）氯化钠溶液（终浓度为 1.2 mol/L），混匀。
13,000 rpm离心5分钟。
（沉淀蛋白质）7、小心吸取上清液约240μl转移至另一洁净的1.5ml Eppendorf离心管中。
加入750μl 95％的冷乙醇（终浓度为71％），－20℃放置10min。
1,3000 rpm 离心，10min，最好在4℃。
（沉淀DNA）8、弃上清，加入1 ml 75％的冷乙醇，洗涤沉淀，1,3000 rpm离心5min。
（脱盐）9、弃上清，置37℃温箱中干燥，以去除残余的乙醇。
10、将干燥后的DNA溶于50μl TE缓冲液中，置－20℃冰箱中备用；也可将干品置－20℃冰箱中备用，使用前用30μl重蒸水溶解。
11、OD260/OD280的测定。
五、注意事项为保证核酸分离的完整性和纯度，实验过程中应注意以下事宜：1、量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。
2、少化学因素对核酸的降解，避免过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏。
3、减少物理因素的核酸的降解，如机械剪切力（强力高速的震荡）、高温（破坏化学键，常规操作温度为0－4℃，可降低核酸酶的活性，减少核酸的生物降解）。
4、防止核酸的生物降解，核酸酶消化磷酸二酯键，破坏一级结构。
其中DNA酶，需要二价金属离子的激活（Mg2＋），使用二价金属离子鳌合剂EDTA，基本上可抑制DNA酶的活性。
实验二聚合酶链式反应及DNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的1、掌握PCR反应的原理，学习PCR的方法，熟悉PCR扩增仪的使用。
2、了解PCR反应条件的优化及引物设计。
3、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作方法。
二、实验原理聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）是Karry Mullis于1985年创立的一种通过体外酶促扩增获取大量特异DNA片段的方法。
PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应，模拟天然DNA的复制机制。
PCR 的特异性取决于引物和模板的特异性结合。
PCR的全过程是以变性、退火、延伸三步反应为一周期，通过若干轮的循环完成的，其中每一步的转换是通过改变反应温度来控制。
1、变性（denaturation）模板DNA在95℃左右的高温条件下双链间的氢键断裂，双链DNA解链成为单链DNA并游离于反应液中。
2、退火（annealing）热变性后将温度降低，人工合成的两个寡核苷酸引物分别与模板DNA扩增区域的两端准确配对结合，形成局部杂交链。
3、延伸（extension）在四种dNTP底物及Mg2＋存在的条件下，DNA聚合酶在最适作用温度下可将脱氧单核苷酸从引物3’端掺入，并沿着模板以新合成的DNA单链的5’→3’方向延伸合成新DNA，以上三个步骤为一循环，每一循环的产物可作为下一循环的模板。
如图所示，理论上PCR合成的数量经过每轮循环都将增加一倍，应按2n的指数方式递增。
PCR经30轮循环后，PCR扩增量应达到230个拷贝，约109个拷贝，但由于DNA聚合酶的质量、待扩增片断的序列及反应体系的条件等诸多因素的影响，实际扩增效率比预期的要低，一般可达106～107个拷贝。
三、实验流程1、目的基因的PCR扩增2、PCR产物的电泳检测四、实验试剂1、Taq DNA聚合酶：5 U/μl。
2、dNTP：4种dNTP按等比例混合，每种2.5mmol/L。
3、MgCl2：，与缓冲液混在一起，无需单独配置。
4、PCR引物：稀释为一定的浓度，扩增时用量为1～2μl反应体积。
5、缓冲液：10×PCR缓冲液浓度如下，使用时按比例稀释：250～500mmol/L KCl100～500mmol/L Tris-Cl （pH 8.4）0.5% Tween-201mg/L BSA6、琼脂糖凝胶：根据待分离样品分子质量的大小选择不同浓度的凝胶。
7、溴化乙锭（EB 10mg/ml）在20ml双蒸水中溶解0.2g溴化乙锭，混匀后4℃避光保存，溴化乙锭是一种诱变剂，操作时应注意安全。
8、上样Buffer：0.25％的溴酚蓝，使用时需加入一定浓度的甘油或蔗糖聚蔗糖，以使样品沉入加样槽。
五、实验步骤1、PCR反应体系反应体系组成加样体积（μl）模板DNA 2.010×PCR缓冲液（含Mg2+） 2.5dNTP（各2.5 mmol/L） 2primer 1（10μmol/L） 1.0primer 2（10μmol/L） 1.0Taq酶（2.5U/μl）0.5ddH2O 16合计25.02、循环参数设定（1）94℃5min 94℃ 30sec 58℃ 45sec72℃ 1min72℃延伸10min（2）反应体系终止后。
1.5％琼脂糖电泳（溴化乙锭染色）a、用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。
b、根据核酸分子质量的大小配置不同浓度的琼脂糖凝胶，一般200～400bp的DNA片段，可配置1.2～1.7％浓度的琼脂糖用于电泳。
c、在锥形瓶中配置0.5×TAE电泳缓冲液100ml，称取一定量的琼脂糖粉放入沸水浴中或微波炉内加热熔化。
冷却至60℃（需要时可加入溴化乙锭），倒入电泳槽中，待凝固。
d、向电泳槽中倒入配置好的凝胶，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子。
如样品孔内有气泡，应设法除去。
e、在DNA样品中加入1/5体积的上样缓冲液，混匀后，加入样品孔内。
f、接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负）。
电压为1～5V/cm（长度以两个正极之间的距离计算）。
g、根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。
一般200～400bp的PCR产物50V电压，电泳20～40分钟即可。
h、溴化乙锭染色后，紫外灯上观察电泳带的及其位置，并与标准分子质量核酸比较扩增产物的大小。
附：DNA的琼脂糖凝胶电泳：1、琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的基本方法。
该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶（Ethidium bromide, EB）染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。
此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。
琼脂糖可以制成各种形状、大小和孔隙度的凝胶。
琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。
琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。
琼脂糖主要在DNA 电泳中作为一种固体支持基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。
在电场中，中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移，其迁移速率由下列多种因素决定：（1）DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移越慢。
（2）琼脂糖浓度一个给定大小的线状DNA分子，其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。
琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围（3）DNA分子的构象分子量相同，构象不同的DNA分子在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的，超螺旋DNA移动最快，而线状双链DNA移动最慢。
如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带，难以确定是质粒DNA不同构象引起，还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。
（4）电源电压在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。
但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。
要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。
（5）嵌入染料的存在荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强，还会使线状DNA迁移率降低15％。
（6）离子强度影响电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。
在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶)，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
对于天然的双链DNA，常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成浓缩母液，储于室温。
