小鼠尾静脉取血和脾淋巴细胞分离

肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。

2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。

3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。

4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。

5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。

6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。

7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。

2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。

4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。

5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。

2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。

2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

从小鼠脾脏中分离淋巴细胞
方法一:
１用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液。

２另取无菌试管，先加入淋巴细胞分离液，然后将试管倾斜，略放平，吸取刚刚制备的细胞悬液缓慢的加入试管中，一般分离液和细胞悬液的体积比为１：２，要轻要慢，不要冲破了淋巴细胞分离液和细胞悬液的界面。

室温水平离心2000转/分钟，30分钟。

３离心后取出试管，可以看到不同的分层，一般上面是非细胞成分和细胞碎片，接下来是单个核细胞，再往下是红细胞等。

吸走上层非细胞层弃之，吸出单个核层在另外无菌试管中，因为淋巴细胞分离液对细胞有毒性作用，加入PBS离心洗两遍（1000转/分钟，10分钟）。

４倾倒上清，用RPMI-1640重悬细胞。

方法二：
用注射器内芯或者研棒研磨过100目筛网，Hank’s液冲洗，收集分离的脾细胞悬液，2000r/min离心3min，弃上清。

加红细胞裂解液8mL，混匀脾细胞，静置5-6min，待红细胞完全破碎，2000r/min离心3min，弃上清去除红细胞，Hank’s液洗1-2遍，用RPMI-1640（含10%胎牛血清）重悬细胞。

小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。

红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。

1、配制的percoll工作液：配制15 ml100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。

2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。

3、小鼠脾脏细胞分离（1）颈椎脱臼处死小鼠。

75%酒精浸泡10min（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。

（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。

（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。

（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。

“小鼠免疫器官摘取及淋巴细胞分离”实验过程
1.培养皿加入纱布，在纱布上滴2ml淋巴细胞分离液。

2.脱颈处死小鼠，在75%酒精中浸泡30s(示意消毒小鼠)。

3.无菌条件下将腹部剪开，脱皮。

(2min)
4.选取小鼠腹部左侧，剪开腹膜，深红色细长组织即脾脏（淋巴细胞组织）
5.用镊子从下方夹取脾脏，，剔除结缔组织和脂肪后，将组织置于滴有小鼠淋巴细胞分离液的纱布上。

6.脾脏用弯头镊子在纱布上研磨至无血色组织后，纱布上加入1ml淋巴细胞分离液，再用移液器吸取研磨的液体，移至1.5ml离心管内。

(3min)
7.离心（1500rpm,3min）留上清，移入新的15ml离心管中，去除红细胞，此时可以取胸腺。

(可以做到这里停止，示意淋巴细胞和免疫器官胸腺)
8.在装有上清的离心管中加入3ml 1640培养基，离心1500rpm，3min，取沉淀，弃上清，重复清洗2次。

（6min）
9.在显微镜下将细胞浓度调为5×106
个/ml备用。

1/ 1。

小鼠全脾分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离全脾：取脾，横切约1mm厚放入固定液，作为组化样本，其余组织放入1ml 5% FCS 1640.3.脾淋巴细胞的分离：1)脾脏处理：将脾脏置于200目滤网上，用5mL注射器内芯轻轻研磨，不断向组织上滴加2ml 5% FCS 1640，直至组织内绝大部分细胞被分离，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)红细胞裂解：加入1ml 红细胞裂解液，轻轻吹打混匀，室温裂解2分钟至红细胞完全破碎。

4)500g，5min，弃上清。

5)洗涤1次：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；6)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640的量。

7)加入适量10% FCS 1640调整细胞浓度至1×107/mL，置于4ºC备用。

小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取实验步骤：1.杀鼠：将小鼠颈椎脱臼处死，70%酒精喷涂表面，无菌条件下剖开小鼠腹腔2.分离淋巴结：取腋下，腹股沟，肠系膜淋巴结，其中腋下淋巴结置固定液中送组化，其余淋巴结放入1ml 5% FCS 1640.3.淋巴结淋巴细胞的分离：1)淋巴结处理：将淋巴结漂浮于3ml 5% FCS 1640（玻璃平皿）中，用无菌大镊子紧捏淋巴结，并用5mL注射器内芯轻轻研磨，绝大部分淋巴细胞游离置培养基中，1ml注射器抽吸滤过，将细胞收集于5ml离心管中。

.2)500g，3min，弃上清。

3)洗涤：加入1ml 5% FCS 1640，重悬沉淀，500g，3分钟，弃上清。

加入1mL 10% FCS1640重悬，取出15μL计数；4)台盼蓝染色细胞计数：1:20稀释细胞悬液，与0.4%台盼蓝染液9:1混合，计数；计算终浓度为1×107/mL所需加入10% FCS 1640 的量。

小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1. 熟悉细胞分离的基本原理2. 掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3. 掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞，胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。

丧失活性或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。

通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。

2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官。

人的脾脏位于左季肋区的后外侧部，呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器，能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。

三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0.2%台盼蓝染液8.显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死——用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。

2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤，剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织。

（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。

用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中；2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。

弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。

然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀，加PBS缓冲液至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。

(放置冰上)4.取100uL至EP管中，进行计数和活力测定（建议5倍稀释）5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。

小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。

3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。

4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。

二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。

2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。

离心。

3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。

4加入1640培养液进行培养。

、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。

肝脏免疫学实验室淋巴细胞分离技术肝脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取肝脏。

2．将肝脏放在200目钢丝网上自边缘开始研磨，转至15ml离心管中。

3．650rpm×1min离心，将上层液体转至15ml离心管中。

4．1500prm×5min离心后弃上清，重复洗两次。

5．6ml 40% Percoll 溶液重悬沉淀，将3ml 70% Percoll溶液加于其底层，2000rpm×20min，升6降2。

6．吸取两层Percoll溶液之间的白细胞层至15ml离心管中，加满PBS后2000rpm×5min 离心收集细胞。

7．1ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

脾脏淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后剪开颈动脉处死，摘取脾脏。

2．用载玻片的粗糙面将脾脏一点一点磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．8ml PBS重悬细胞沉淀，在底层加入3ml Ficoll , 2000rpm×20min，升6降2。

4．吸取两层溶液之间的白细胞层至15ml离心管，加满PBS后2000rpm×5min离心收集细胞。

5．6-8 ml PBS 重悬细胞后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

胸腺淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后，剪开颈动脉处死，摘取胸腺。

2．将胸腺放在200目钢丝网上研磨，将收集的研磨悬液通过尼龙网过滤至15ml离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

3．6-8ml PBS 重悬细胞沉淀，再次通过200目尼龙网过滤后，吸取10ul细胞悬液，按照1：1的比例与台盼蓝混匀后计数。

淋巴结淋巴细胞分离1．小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取淋巴结。

2．用载玻片的粗糙面将淋巴结磨碎，将收集的研磨悬液通过200目尼龙网过滤至15ml 离心管中，1500rpm×5min离心收集细胞。

小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告一、引言淋巴细胞是免疫系统中重要的细胞成分，其在免疫应答和抗体产生中发挥着关键作用。

为了研究淋巴细胞的功能和特性，需要将其从组织中分离出来并进行计数。

本实验旨在通过对小鼠脾脏进行淋巴细胞分离和计数，来获取关于淋巴细胞数量和纯度的信息。

二、材料与方法1. 实验动物：使用C57BL/6小鼠。

2. 仪器与试剂：离心管、离心机、PBS缓冲液、0.83%氯化铵溶液。

3. 实验步骤：A. 准备工作：i. 将离心管预冷至4℃。

ii. 准备PBS缓冲液，并保持在4℃。

B. 小鼠准备：i. 用无菌技术将小鼠安全固定在手术台上。

ii. 使用无菌器械，剪开腹部皮肤和腹壁，暴露脾脏。

iii. 小心取出脾脏并放入含有PBS缓冲液的离心管中。

C. 细胞分离：i. 使用无菌器械，将脾脏组织切碎至细胞悬浮液状态。

ii. 将细胞悬浮液通过70μm滤网过滤，以去除大块组织残渣。

iii. 向过滤后的细胞悬浮液中加入等体积的0.83%氯化铵溶液，进行红细胞溶解。

iv. 用PBS缓冲液洗涤淋巴细胞沉淀，重复此步骤2-3次。

D. 细胞计数：i. 取适量的淋巴细胞悬浮液，加入等体积的尝试涂片溶剂进行稀释。

ii. 在尝试涂片上使用布朗管计数室计数淋巴细胞数量。

三、结果根据实验操作所得数据，我们得到了以下结果：1. 成功分离出小鼠脾脏中的淋巴细胞。

2. 经过红细胞溶解和洗涤步骤后，淋巴细胞沉淀呈现白色悬浮液状态。

3. 在计数室中观察到淋巴细胞的形态特征，如小型、圆形和较大的核。

四、讨论本实验成功地分离出了小鼠脾脏中的淋巴细胞，并通过计数室观察到了其形态特征。

然而，有一些潜在问题需要考虑和改进：1. 纯度问题：尽管我们成功分离出淋巴细胞，但在实验过程中是否存在其他细胞类型的污染仍需进一步验证。

可以通过流式细胞术等技术来评估纯度。

2. 细胞活力：在实验过程中，我们没有对淋巴细胞进行活力测试。

小鼠脾脏单个核细胞的分离一、实验目的1。

熟悉细胞分离的基本原理2。

掌握小鼠脾脏单个核细胞的分离的方法3。

掌握流式细胞术检测细胞表面标志的方法二、实验原理1.台盼蓝染色：正常的活细胞,胞膜结构完整，能够排斥台盼蓝，使之不能够进入胞内。

丧失活性或细胞膜不完整的细胞,胞膜的通透性增加,可被台盼蓝染成蓝色。

通常认为细胞膜完整性丧失，即可认为细胞已经死亡。

2.脾是人和脊椎动物最大的淋巴器官.人的脾脏位于左季肋区的后外侧部,呈卵圆形，脾是血循环中重要的滤过器,能清除血液中的异物、病菌以及衰老死亡的细胞，特别是红细胞和血小板。

三、实验材料小鼠手术器械（剪刀、镊子）、酒精喷壶、杀鼠板平皿，尼龙膜指套、研磨棒、吸管、试管、EP管、移液器和tipsPBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK）细胞计数板0。

2%台盼蓝染液8。

显微镜四、实验步骤（一）取小鼠脾脏1.小鼠颈椎脱位处死-—用拇指和食指往下按住鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉,使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离。

2.取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交界处皮肤,剪取脾脏并尽量将去除脂肪及筋膜组织.（二）制备单个核细胞悬液：1.将脾脏置于盛有5mLPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中。

用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指套悬浮于平皿中;2.吸取平皿中细胞悬液（再次用尼龙指套过滤）置于刻度离心管中，加PBS缓冲液（可冲洗培养皿）至10mL，以1500rpm离心5min。

弃去上清，弹散细胞沉淀，加ACK2ml，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。

然后加PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；3.弃去上清，弹散细胞沉淀,加PBS缓冲液至2ml,吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞悬液。

(放置冰上）4.取100uL至EP管中,进行计数和活力测定（建议5倍稀释)5.以1500rpm离心5min，根据计数结果稀释到合适的浓度a)注：减少操作的时间，并放置冰上或低温离心机里以保证细胞活力（三）计算细胞浓度1.将上述细胞悬液做一定倍数的稀释；（建议5倍稀释）。

小鼠脾细胞的分离原理
小鼠脾细胞的分离原理基本上可分为以下几个步骤：
1. 选择性切除脾脏：将小鼠固定在手术台上，进行全麻手术，使用消毒的手术刀仔细切开腹部皮肤，暴露脾脏。

根据需要，将脾脏切除并置于冷盐水或试管中。

2. 细胞解聚：将脾脏置于含有细胞解聚酶（例如胰蛋白酶）的消化液中，用温和的消化条件进行消化。

消化时间和消化液浓度可根据需要进行调整。

3. 细胞过滤：将消化后的细胞悬液通过细胞过滤器进行过滤，以去除大块组织碎片和残留的不可消化物质。

过滤器的孔径大小可根据实验需求选择。

4. 细胞沉降：通过离心将细胞悬液离心沉淀，移除上清液并保留沉淀。

沉淀中的细胞主要是小鼠脾脏中的淋巴细胞和其他免疫细胞。

5. 细胞分离：使用细胞分离液（例如离心梯度离心液）对细胞沉降物进行离心梯度离心。

离心梯度离心液可使不同细胞类型在不同密度层次上分布。

根据需要，可使用手动或自动离心设备进行离心。

6. 细胞收集：从离心管中收集位于所需密度梯度上层的细胞组分，并将其洗涤与培养基中以去除离心梯度离心液的残余物质。

7. 细胞计数与培养：使用显微镜和细胞计数板来计数和评估分离的细胞的数目和纯度。

接下来，将细胞移植至培养皿或试管中进行后续细胞培养或实验。

小鼠脾脏淋巴细胞分离与计数实验报告1. 引言小鼠脾脏淋巴细胞是免疫系统中重要的组成部分，它们在抵御病原体侵袭和保护机体免受自身免疫疾病侵害中发挥着关键的作用。

因此，为了研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能，我们需要将其从脾脏中分离出来并进行计数。

本实验旨在描述小鼠脾脏淋巴细胞的分离与计数方法。

2. 材料与方法2.1 实验材料•小鼠脾脏样品•细胞培养基•消化酶•离心管•细胞计数板•显微镜2.2 实验方法2.2.1 小鼠脾脏样品的获取1.选择适龄的小鼠，以确保其脾脏发育成熟。

2.用消毒工具将小鼠颈部暴露，进行脾脏的解剖。

3.将脾脏置于无菌的容器中，迅速将其转移到实验室。

2.2.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离1.将小鼠脾脏放置在无菌离心管中，并加入足够的细胞培养基。

2.使用搅拌器或离心机将脾脏组织均匀分散于培养基中。

3.加入消化酶，按照说明书中的浓度和时间进行消化。

4.在消化结束后，用细胞培养基冲洗脾脏组织，以去除余留的消化酶。

2.2.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数1.取适量的脾脏细胞悬液，加入细胞计数板中。

2.在显微镜下观察并计数细胞计数板中的淋巴细胞数量。

3. 实验结果3.1 小鼠脾脏样品的获取从适龄的小鼠身上成功解剖出脾脏，并将其转移到实验室。

3.2 小鼠脾脏淋巴细胞的分离经过消化酶的作用，小鼠脾脏细胞成功地被分离并悬浮于培养基中。

3.3 小鼠脾脏淋巴细胞的计数通过显微镜观察，我们计数了细胞计数板中的淋巴细胞数量，并记录了结果。

具体数据如下： 1. 格子1：20个淋巴细胞 2. 格子2：18个淋巴细胞 3. 格子3：22个淋巴细胞 4. 格子4：19个淋巴细胞根据计数结果求平均值，得到平均每格淋巴细胞数目为19.75个。

4. 结论根据我们的实验结果，我们成功地分离出小鼠脾脏淋巴细胞，并进行了有效的计数。

通过计数结果，可以推断小鼠脾脏淋巴细胞的数量在每格约为19.75个左右。

这些实验结果为进一步研究小鼠脾脏淋巴细胞的特性和功能提供了基础数据。

小鼠脾脏分离方法
小鼠脾脏分离的方法大致分为以下几个步骤：
1. 准备实验器材和试剂：包括小鼠、手术器械（注射器、剪刀、镊子等）、培养介质等。

2. 麻醉小鼠：将小鼠固定在麻醉机的透明密闭室中，在室内添加气体麻醉剂（如异氟醚）使其麻醉，直到小鼠没有任何反应。

3. 消毒和剪毛：用75%酒精和消毒棉球彻底消毒小鼠的腹部。

将小鼠放在消毒台上，使用剪刀修剪腹部的毛发。

4. 制备手术器械：将手术器械放在消毒台上，使用消毒液进行消毒。

5. 手术操作：使用剪刀和镊子，小心地切开小鼠的腹腔。

找到脾脏，并用剪刀和镊子将其取出。

6. 分离脾脏细胞：将脾脏放入含有适宜培养液的离心管中。

用剪刀和镊子将脾脏分成小块。

7. 细胞过滤：将分块的脾脏组织用细胞过滤器过滤，以去除大块组织和残渣。

8. 细胞计数：使用显微镜和细胞计数板，将过滤后的细胞进行计数。

9. 实验操作：根据实验的需要，将分离的脾脏细胞进行相应的实验操作，如培养、染色等。

10. 实验结束：在实验完成后，将剩余的细胞进行妥善保存或处理，清洗实验器材，并按规定进行废弃物处理。

小鼠脾脏淋巴细胞分离方法需要提前准备的材料：提前高压灭菌：手术器械，200目尼龙网，除菌过滤：8.5%和0.85%的Nacl溶液各40ml，1XPBS溶液，hanks液40ml。

红细胞裂解液，六孔板，培养皿，75%酒精，100ml烧杯，无菌注射器5-10ml，15ml、50ml 离心管，4mlEP管，离心机等。

1、配制的percoll工作液：配制15 ml100%percoll液（简称工作液）：13.5ml percoll原液+1.5 ml 8.5%Nacl溶液混匀备用。

2、配制6个梯度，每个梯度2ml，实际配制3ml70%percoll液（1.090g/ml）：2.1 ml工作液+0.9 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用60%percoll液（1.077g/ml）：1.8 ml工作液+1.2 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用50%percoll液（1.067g/ml）：1.5 ml工作液+1.5 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用40%percoll液（1.050g/ml）：1.2 ml工作液+1.8 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用30%percoll液（1.043g/ml）：0.9 ml工作液+2.1 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用20%percoll液（1.031g/ml）：0.6 ml工作液+2.4 ml 0.85%Nacl溶液混匀备用找一只15ml离心管，从低到高（20% percoll液→70%percoll液）依次装入，装好备用。

3、小鼠脾脏细胞分离（1）颈椎脱臼处死小鼠。

75%酒精浸泡10min（2）无菌条件下取出小鼠脾脏，去除筋膜等置于Hanks’ 液中，将脾脏放入2ml离心管中剪碎。

（3）将200目尼龙网置于六孔板上，用注射器头研磨，过程中不停加Hanks’ 液冲洗。

（4）收集脾细胞悬液置于离心管中，1500rpm 10min，弃上清。

（5）加10ml？红细胞裂解液混悬沉淀，室温静置10min，再1500rpm 10min（6）洗三遍，1500rpm 5min，离心去上清（7）加入2ml 0.85%Nacl溶液混悬沉淀。

小鼠脾脏淋巴细胞检测方法说实话小鼠脾脏淋巴细胞检测这事儿，我一开始也是瞎摸索。

我试过好多种方法，走了不少弯路呢。

我最早的时候，那就是按照一些书上的基本步骤来。

先得把小鼠处死，这一步可得小心点，千万不要把脾脏什么的给弄破弄坏了，就好比你拆一个特别精密的小零件，得小心翼翼的，不然就全乱套了。

然后取脾的时候，我就出过岔子。

有次取脾太着急，结果把旁边的一些组织也带出来了不少，这就会影响后面步骤的准确性。

我后来就明白了，得用镊子特别小心地把脾脏完整地分离出来才好。

取出来脾脏之后就要研磨来制备细胞悬液。

我研磨的时候一开始总是掌握不好力度，要么就是研磨得太轻了，细胞没有完全释放出来，就像你榨果汁，但是力气小了，好多果肉还在果渣里一样；要么就是研磨得太重，把细胞弄破了一些，这就惨了。

经过好多回试验，我才逐渐掌握了那个合适的力度，就像你慢慢找到了开锁的正确手感一样。

制备好细胞悬液后下面就是分离淋巴细胞了。

有密度梯度离心法，可这方法里那个离心的转速啊，就像一个神秘的数字，我试了好几个不同的转速，才找到了最适合的那个数值，能把淋巴细胞比较干净地分离出来。

刚开始的时候要么转速不对，淋巴细胞和别的细胞混在一起分不开，要么就是纯度不够。

对于检测淋巴细胞数量和活性这一步，我以前用过台盼蓝染色的方法。

但这个染液的量得用好，有一次染液加多了，结果看细胞都花了眼，都辨不清死活了。

后来知道就只能加那么一点点，就够覆盖细胞就好，然后在显微镜下仔细看蓝的就是死细胞，没着色的就是活细胞。

而且这个观察的时候，也得有耐心，要多个视野都看看统计，不能就看一眼就下结论。

这就像你数一堆东西一样得仔细都数到。

还有用流式细胞术检测淋巴细胞的各种亚群，这个仪器老高级了，但操作起来参数设置很关键，我一开始也是晕头转向的，老是测不准。

后来向做过的同事请教，又自己不断尝试不同的参数组合，才慢慢能得到准确的结果。

比如说那个门的设置，就像是给不同的人群划区域，要是划得不好，就把类型分错了。

从小鼠脾脏平分别淋巴细胞
１小鼠断颈处逝世,酒精浸泡５分钟,超净台内打开左侧腹部皮肤,当心分别皮下组织和腹部肌肉吐露出脾脏,提起,剪去四周结缔组织,放入有PBS的小瓶中.无菌镊子夹碎,挤压脾脏,将获得的细胞悬液移入无菌试管中.２另取无菌试管,先参加淋巴细胞分别液,然后将试管竖直,略放平,汲取方才制备的细胞悬液迟缓的参加试管中,一般分别液和细胞悬液的体积比为１：２,要轻要慢,不冲要破了淋巴细胞分别液和细胞悬液的界面.选用合适本身分别目标细胞的离心力和时光进行离心.小我用1500转/分钟,20分钟.３离心后掏出试管,可以看到不合的分层,一般上面长短细胞成分和细胞碎片,接下来是单个核细胞,再往下是红细胞等.吸走上层非细胞层弃之,吸出单个核层在别的无菌试管中,因为淋巴细胞分别液对细胞有毒性感化,参加PBS 离心洗两遍（PBS1000转/分钟,10分钟）.４,洗好的细胞参加１６４０造就液和２０％的血清中重悬,迟缓参加已经制备好的尼龙毛柱子中,封好,放３７度孵育一小时.一小时后掏出,超净台内将柱子立起,针头下面放无菌试管（我们的柱子是用大号打针器做的）,以HANKS液和血清先后迟缓冲洗,巨噬细胞贴在尼龙毛上不下来,B细胞也相对吸附冲洗下来的不久不多,所以冲洗来的大多是T细胞,纯度可打到８０％到９０％,再次冲洗并且用力挤压,如许得到的就是B细胞.得到的细胞可以以１６４０加血清配制的造就液进一步造就或做它用.但是淋巴细胞分别液得到的细胞只能算是粗分,假如试验请求高最好选用磁珠或
流式分别.。