K-B 纸片扩散法测定抗生素敏感试验

第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。

药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。

在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。

对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。

②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。

制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。

③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。

嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。

用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。

（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。

平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。

纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。

直径为90mm的平板可贴6张纸片。

纸片贴牢后应避免再移动。

平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。

（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。

培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。

kb纸片法药敏实验名词解释
KB纸片法是一种常见的药敏实验方法，用于测试细菌对抗生素的敏感性。

这项实验通常用于临床医学和微生物学领域。

下面我将从多个角度来解释这些名词。

首先，KB纸片法是指Kirby-Bauer纸片法，是一种半定量的抗生素敏感试验方法。

在这个方法中，细菌培养物被均匀涂布在琼脂平板上，然后在表面放置含有不同抗生素的纸片。

细菌在培养基上生长形成菌落，如果细菌对某种抗生素敏感，它们就不会在靠近含有该抗生素的纸片的区域生长，形成所谓的抑制圈。

通过测量这些抑制圈的直径，可以判断细菌对抗生素的敏感性。

其次，药敏实验是指药物敏感性试验，用于评估细菌或其他微生物对抗生素或其他药物的敏感性。

这项实验对于选择治疗感染性疾病的最佳药物非常重要，因为它可以帮助医生确定哪种药物对特定的病原体最有效。

综上所述，KB纸片法药敏实验是一种通过测量细菌对抗生素的敏感性来评估药物治疗效果的方法，它在临床医学和微生物学领域有着广泛的应用。

希望这些解释能够帮助你更好地理解这些名词。

纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。

中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。

药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。

试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。

（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。

（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。

纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。

中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。

药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。

试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。

（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。

（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。

纸片扩散法药敏试验纸片扩散法（K-B法）药物敏感试验是在涂有细菌的琼脂平板培养基上按照一定要求贴浸有抗菌药的纸片，培养一段时间后测量抑菌圈大小，并根据相关解释标准进行结果分析，从而得出受试菌株药物敏感性的结论。

中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论目录.1试验原理.2试验步骤.3结果分析.4注意事项基本信息中文名纸片扩散法药敏试验临床意义得出受试菌株药物敏感性的结论试验原理纸片扩散药敏试验的原理：将含有定量的抗菌药物的纸片贴在接种有待测菌的固体培养基上，通过抗菌药物在培养基上的扩散，观察是否出现抑菌环，推断是否抑制细菌的生长。

药物扩散的距离越远，药物浓度越低抑菌能力越强，因此可根据抑菌环的大小，判定药物对细菌的抑制作用强弱。

试验步骤1. 待测菌株接种物制备（1）通用情况：从过夜孵育的平板，优先选择哥伦比亚血琼脂平板上的菌落上挑取数个单个菌落，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

（2）特殊情况：嗜血杆菌属（本程序中所指的嗜血杆菌仅包括流感嗜血杆菌、副流感嗜血杆菌）：从过夜孵育的HTM平板，直接接种4.5%生理盐水制成菌悬液，使用比浊仪调整悬液的浊度使其达到0.5麦氏单位，使菌悬液中含有相当于ATCC 25922大肠埃希菌（1-2）*1012CFU/mL浓度。

2.接种平板（1）调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。

（2）用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部，均匀涂布，重复两次此过程（一共三次）每次旋转平板约60度，确保每次接种菌液均匀分布，最后在琼脂平板的边缘涂抹一圈，防止有流动的菌悬液，并使菌液涂布于整块平板的每个角落。

（3）涂布菌液完成的平板，可在室温放置一会（3-5分钟），以便在放置含有药物的纸片前使琼脂吸收表面多余的水分，但放置时间不应超过15分钟。

SOP_15-25 纸片扩散法（K-B法）抗生素敏感试验标准操作程序【目的】用于分离菌的抗生素敏感试验。

【适用范围】WHO推荐K-B法，其目的在于技术的简单和可重复性。

本法特别适用于肠杆菌科细菌，也可用于快速生长的致病菌，但不适用于其他细菌，如嗜血杆菌、奈瑟菌、专性厌氧菌及酵母样菌等。

无论用哪种方法接种，只要质控菌株的抑菌环在预期范围内，均可按同一解释标准报告结果。

【该SOP变动程序】本标准操作程序的改动,可由任一使用本SOP的工作人员提出,并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【试验用材料】1.培养基Kirby-Bauer法指定用Mueller-Hinton琼脂。

多年大量的有关敏感试验的方法学研究，均采用该培养基，维持细菌正常发育，绝大多数细菌在此培养基上生长良好。

此培养基不拮抗抗菌药物活性以及商品的批间差异等方面均优于其他培养基。

若检测肺炎链球菌的敏感性时，在培养基中加5％的脱纤维羊血，制成血平板。

测嗜血杆菌及淋病奈瑟菌的敏感性时，在培养基中须加入1％血红素和2.5mg/ml辅酶I后应校正pH 7.2～7.4。

制备MH琼脂平板应用直径90cm平皿。

在水平的实验台上倾制。

琼脂厚为4mm，允许误差为土lmm。

琼脂凝固后，应测一下pH是否正确。

琼脂于板应放4℃保存，在7日内用完。

2.药物纸片抗菌药物纸片直径约为6.00～6.35mm，每片的吸水量约20μl。

采用K-B法，纸片的药物含量必须与该法规定的一致，不得任意更改。

药物纸片可以购买，也可自制，用前必须做质量鉴定。

用以下两个指标判定纸片的质量：2.1片间差：是衡量不同纸片含药是否均一的指标。

测定方法：以质控菌株接种M-H琼脂平板，一块平板上贴6张相同的纸片。

35C过夜，培养后，记录6个抑菌直径，其最大和最小之差不应大于1～2mm。

2.2准确度:判定纸片的实际含药量与标量是否一致。

纸片的合理保存十分重要。

药物纸片必须在有干燥剂的容器内低温(-10℃以下)保存。

隐匿性肾炎的表现为单纯性血尿，类似于中医尿血，多因湿热下注所致。

金顺英等[14]将35例单纯血尿患者随机分组，治疗组每日服鲜车前草汁，对照组注意休息，预防感染，对症治疗。

8周后治疗组总有效率达85%以上，而对照组尿常规改变不明显，仅38.7%有效，二者有显著差异。

表明用此法治疗肾性血尿作用明显，且取材服用简便，久服未见毒副反应。

2.2.5 治疗阴道炎陈晓飞等[15]取新鲜车前草煎汁，对48例阴道炎患者进行浸泡治疗，结果29例外阴湿疹患者全部痊愈，l3例非特异性阴道炎及6例老年性阴道炎患者，治疗后症状明显减轻。

2.2.6 治疗急性乳腺炎急性乳腺炎为初产妇的常见病，分为未化脓型和化脓型两种。

陈福仁等[9]将捣烂的车前草捏成鼻孔大小的圆锥状，塞入患者鼻腔，15h/次，最多经3次治疗后，31例未化脓型者均可痊愈，但该法对化脓性乳腺炎无效。

王寿昌等[16]在10年期间对21例患者使用拍打尺泽穴加外敷车前草治疗急性乳腺炎，效果亦较好。

2.2.7 其他研究发现，车前草还可用来治疗运动性血红蛋白尿[17]、角膜翳[18]、痢疾[19]” 以及小儿迁延性肺炎、尿血、胃肠性感冒等儿科病症[20]，均取得了满意的结果。

3 小 结车前草资源丰富，用途广泛，且毒副作用小，随着现代技术的不断发展以及各学科间的不断完善，车前草会给人类带来更大的经济和社会效益。

参考文献[1] (魏)吴莆.神农本草经[J].北京:人民卫生出版社,1963:18.[2] 季大洪.中药车前研究与应用概况[J].药学实践杂志,2001,19(6):361-362.[3] 董杰明,袁昌鲁.车前草及芒苞车前草化学成分及其形态学研究[J].辽宁中医学院学报,2002,4(3):229-230.[4] 吴斐华,王奇志,梁敬钰,等.车前化学成分和保肝活性[J].中国天然药物,2006,4(6):435-439.[5] Toda S, Miylase T, Arichi H, et al. Natural antioxidants: 1l.Antiox-idative components isolated from seeds of plantago asiatica LINNE [J].Chem Pharm Bull,1985,33(3):1270.[6] Oshio H, Onouye H. Two new ifidoid ghucocides of plantago asiaticaLINNE[J].Plants Med ,1982,44(4):204.[7] Rava H, Nishibe S, Sasahara M, et al. Phenolic compounds fromplantago asiatica[J].Phytachem,1990,29(11):3627.[8] 回瑞华,侯冬岩,李铁纯,等. 中国车前草挥发性化学成分分析[J].分析实验室,2004,23(8).[9] 陈福仁,李小黎.新鲜车前草治疗急性乳腺炎31例疗效观察[J].浙江中西医结合杂志,1997,7(1):60.[10] 王寿昌,孙克勤.拍打尺泽穴加外敷车前草治疗急性乳腺炎[J].安徽中医临床杂志,1998,10(1):61.[11] 刘智成,刘正生,罗德云.车前草软膏治疗褥疮患者的护理[J].镇江医学院学报,1999,9(1):157.[12] 陈剑屏,袁启霞.车前草汤治疗慢性活动肝炎232例[J].上海中医药杂志,2002,11:18-19.[13] 青俐.车前草穴位贴敷治疗产后尿潴留[J].四川中医,2001,19(6):22-22.[14] 金顺英,张兴家,张世英,等.车前草治疗单纯血尿[J].长春中医学院学报,1997,13(6):16.[15] 陈晓飞,罗勤芬.车前草治疗阴道炎48例[J].中国实验方剂杂志,1998,4(2):40.[16] 王寿昌,孙克勤.拍打尺泽穴加外敷车前草治疗急性乳腺炎[J].安徽中医临床杂志,1998,10(1):61.[17] 孙神虎.我国是世界上最早利用车前草治疗行军尿的国家[J].甘肃中医,2002,15(3):75.[18] 周斌.车前草薰敷治疗角膜翳[J].中国民间疗法,1998.6:26-26.[19] 顾启梓.车前草治痢疾[J].中国民间疗法,1998,2:55-55.[20] 徐鑫.车前草儿科应用举隅[J].陕西中医,1998,19(1):376-377.K-B纸片琼脂扩散法检测细菌药物敏感试验的影响因素分析王亚霞 苏振杰 任凤秋【摘要】细菌药物敏感试验的结果是临床合理用药的重要依据，确保其结果的准确性，必须了解试验中培养基种类及质量、试验用药的纯度和菌液的浓度、药物的含量及孵育时间等诸多因素的影响。

纸片琼脂扩散法检测抗菌药物敏感试验方法分析抗菌药物敏感试验(AST)是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试验，纸片琼脂扩散法又称K－B法，是将含有一定量抗菌药物的纸片贴在已接种待测菌的琼脂平板表面，药物将在培养基中由纸片往周围扩散，且浓度递减。

在抑菌浓度范围内待测菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。

根据抑菌圈的大小可判断待测菌对测定药物的敏感程度[1]。

该法操作简便、选药灵活，适用于快速生长的需氧菌及兼性厌氧菌。

1 实验材料抗菌药物纸片选择直径6.35mm，吸水量20μL的专用药敏纸片，灭菌后，经逐片加样或浸泡的方法使每片的含药量相当于所示浓度。

纸片冷冻干燥后储藏于密封瓶内，－20℃保存。

日常工作用的少量纸片可保存于4℃冰箱内，1周内使用。

培养基水解酪蛋白(M－H)培养基是CLSI推荐采用的需氧菌和兼性厌氧菌药敏试验标准培养基，pH7.2～7.4，溶化后倾注平板(琼脂厚度为4 mm)。

使用前应将琼脂平板放入35℃孵育至表面干燥。

药敏试验菌液：浓度应为0.5麦氏比浊标准。

①生长法：挑取已分离纯化的菌落4～5个，接种于3～5mLM－H肉汤中，35℃孵育4h，用生理盐水或肉汤校正菌液浓度至0.5麦氏比浊标准。

②直接调制法：用接种环挑取纯菌落数个，混悬于生理盐水或肉汤中，充分混匀并调整浓度为0.5麦氏比浊标准[1]。

2 实验方法2.1接种以无菌棉拭子蘸取试验菌液，在管内壁旋转挤压除去多余的菌液后，涂布于整个M－H琼脂平板表面，涂布3次，每次旋转平板60°，最后沿平板边缘涂抹1圈。

盖上表面皿盖，置室温放置3～5min，使平皿表面稍干。

2.2 贴放药物纸片：用无菌镊子或纸片分配器将含药纸片平整地贴于平板表面，稍加按压使纸片贴紧。

注意纸片分布均匀，各纸片中心相距24mm以上，纸片距平板内缘应大于15mm。

纸片贴牢后切勿移动，否则会影响抑菌圈的形状。

2.3培养：贴好纸片后，须于15min内将平板置于35℃培养箱中，孵育至规定时间(一般为18～24h)。