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高效液相色谱

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高效液相色谱

高效液相色谱
低压梯度： 只用一个高压泵， 在泵前安装了一个比例阀，混 合就在比例阀中完成。
二、 进样系统
将样品溶液准确送入色谱柱的装置 ——手动方式、自动方式
进样器要求
密封性好、死体积小、重复性好、进样时 引起色谱系统的压力和流量波动要很小。
常用手动进样器——六通阀进样器，
二、 进样系统
六通阀进样
Load
Inject
分析对象及范围 能气化、热稳定性好、 G 且沸点较低的样品，占 C 有机物的20% 流动相的选择 操作条件
流动相为有限的几种 加温常压 “惰性”气体，只起运 操作 载作用，对组分作用小
溶解后能制成溶液的样 H 流动相为液体或各种液 品，高沸点、高分子量、 P 体的混合。它除了起运 室温、高 难气化、离子型的稳定 L 载作用外，还可通过溶 压下进行 或不稳定化合物，占有 C 剂来控制和改进分离。 机物的80%
经典LC HPLC
固定相颗粒>100μm,不均匀 固定相颗粒<10μm,均匀 常压下输送流动相 柱效较低（H↑，n↓） 高压下输送流动相 柱效较高（H↓，n↑）
分析周期长 无法在线检测
分析周期短 可以在线检测
2. HPLC与GC的比较
相同：均为高效、高速、高选择性的色谱方法，兼
具分离和分析功能，均可以在线检测
高分子多孔微球：YSG
一、固定相
3. 常用固定相
化学键合固定相
以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子
以共价键连接在硅醇基上
(硅酯化) Si OH R OH Si O R
SOCl 2
(酰氯化) Si OH SOCl2 Si Cl RLi 或RMgCl Si R (硅烷化) Si OH R3 SiCl Si O SiR3 HCl

高效液相色谱法

高效液相色谱法

2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;

高效液相色谱和超高效液相色谱

高效液相色谱和超高效液相色谱

高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。

它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。

本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。

一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。

不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。

在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。

固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。

样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。

分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。

二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。

（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。

常用的注射器有手动注射器和自动进样器。

手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。

（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。

其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。

常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。

恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。

梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。

（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。

常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。

20-高效液相色谱

20-高效液相色谱
16
5. 离子色谱
其分离原理与离子交换色谱原理一样， 电导检测器检测。 问题：由于流动相都是强电解质，其电导率比 待测离子约高 2 个数量级，这种强背景电导会完
全掩盖待测离子信号。
1975年Small提出，在离子交换柱之后，再串结一根
抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交 换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具 有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相， 从而可用电导检测器检测各种离子的含量。
在反相色谱法中，通过调节流动相的pH，抑制样品组 分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离 有机弱酸、弱碱的目的，称为离子抑制色谱法（ISC）
（1）适用范围 弱酸 3.0≤pKa≤ 7.0 弱碱 7.0≤pKa≤ 8.0
（2）抑制剂 弱酸（乙酸）、弱碱（氨水）或缓冲盐 （3）影响k的因素 a．与流动相的极性有关（同反相色谱） b．与流动相pH有关：弱酸 pH≤pKa k↑， tR↑ 弱碱 反之
由苯乙烯与二乙烯苯交联而成
21
20.4.2 化学键合相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； 一般的键合相用硅胶为载体： a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C (ODS）
1. 非极性键合相 键合相表面基团为非极性烃基， 如C18 、C8、 C1 和苯基等。一般用于反相色谱
33
选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）使用前需要用微孔滤膜过滤，除去固体颗粒。
（3）流动相使用前最好脱气。
34
20.6 高效液相色谱仪
35
记录系统
输液系统

高效液相色谱

高效液相色谱

高效液相色谱高效液相色谱，又称高压液相色谱（HPLC，High Performance Liquid Chromatography），是一种重要的色谱技术，广泛应用于药物分析、食品安全检测、环境监测等领域。

相较于传统液相色谱，高效液相色谱具有分离效果好、分析速度快、灵敏度高等优势，因此成为现代分析实验的核心技术之一。

高效液相色谱的原理基于物质在不同相互作用力下的差异，通过样品在固定相上的分配行为，实现对不同成分的分离和分析。

其核心部分是色谱柱，包括固定相、流动相和样品分子。

其中，固定相是一种特定的固体或液体材料，具有一定的孔隙结构和表面特性，用于捕获和分离样品成分。

流动相则由溶剂组成，可以通过与固定相的相互作用调节分离效果。

而样品分子则根据其在固定相上的亲疏性，相继被吸附、扩散和解吸，最终实现分离。

高效液相色谱的分离过程包括样品进样、柱温控制、流速调节等步骤，每个步骤都需要严格控制，以保证分离效果和结果准确性。

在样品进样之前，通常需要采用样品前处理方法，如固相萃取、溶剂萃取等，以去除杂质和提高分析物的浓度。

然后，样品通过进样器进入色谱柱，通过控制流速和柱温，使样品成分在固定相上发生分配行为，从而实现分离。

最后，通过采集柱洗脱出来的物质，并通过检测器检测其浓度变化，得到分析结果。

高效液相色谱的关键是选择适当的固定相和流动相。

不同的样品性质和分析要求需要选择不同的固定相。

常见的固定相包括疏水相、离子交换相、亲水相等。

此外，流动相的选择也非常重要，常见的流动相溶剂有水、有机溶剂（如甲醇、乙腈）等。

合理选择固定相和流动相能提高分离效果，提高检测灵敏度。

高效液相色谱有多种检测器可供选择，常用的有紫外-可见光谱检测器（UV-Vis）、荧光检测器、质谱检测器等。

通过检测器的信号，可以得到样品的浓度信息，从而进行定量分析。

高效液相色谱在药物分析中的应用广泛。

例如，针对不同药物的检测需求，可以选择不同的色谱柱和流动相，在合适的检测器下进行分析。

高效液相色谱法

高效液相色谱法

（2）化学键合固定相 ） B. 极性键合相 极性键合相指键合有机分子 中含某些极性基团，与空白硅胶相比， 中含某些极性基团，与空白硅胶相比，其极性 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 常用的极性键合相有氨基、氰基等。 常用的极性键合相有氨基、氰基等。氨基键合 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈-水 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈 水
二、液相色谱的流动相
1. 流动相特性
（mobile phases of LC） ）
（2）化学键合固定相 ）
化学键合固定相是应用最广的色谱法。 化学键合固定相是应用最广的色谱法。将固定液的官能团键
合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 一般认为有分配与吸附两种功能。 一般认为有分配与吸附两种功能。 a. 硅氧碳键型： 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 硅氧硅碳键型： 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂， c. 硅碳键型： 硅碳键型： d. 硅氮键型： 硅氮键型： ≡Si—C ≡Si—N
4.6
高效液相色谱法
高效液相色谱法(high pressure Liquid 高效液相色谱法 chromatography，HPLC)是利用物质在两 ， 是利用物质在两 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 当两相作相对移动时， 当两相作相对移动时，被测物质在两相之间做 反复多次的分配， 反复多次的分配，这样使原来微小的差异产生 了很大的分离效果，达到分离、 了很大的分离效果，达到分离、分析和测定一 些理化常数的目的。 些理化常数的目的。

高效液相色谱法


正相色谱：以极性物质做固定相，非极性物质作
流动相，即流动相的极性<固定相的极性。正相色 谱适用于极性化合物的分离，极性小的先出柱， 极性大的后出柱。（反之为反相色谱）
高效液相色谱仪
压力表 储液器 高压泵
进样器
梯度洗 提装置
色 谱 柱
记录仪 检测器
馏分收集器
一 高压输液系统 1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni 合金)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行 泵内。 2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。 3.高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
二 分离和进样系统 （一）进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱 本身所产生的峰形展宽相对要小些。即， HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些 因素包括：进样系统、连接管道及检测器 的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装 置简单、死体积小。但进样量小且重现性 差。
2．化学发光检测器
是近年发展起来的高选择性、高灵敏度
（二）荧光检测器（FD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光 光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池 的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达 1× 10-10g ／ ml ，比紫外检测 器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生 物能发荧光的物质。
主要用于氨基酸、
多环芳烃、维生素、 甾体化合物、酶类、 黄曲霉素、卟啉类 化合物、农药等的 检测。
利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解
度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般 为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段

高效液相色谱HPLC简介.ppt


种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
2
操作过程图示
3
色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
4
项目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
14
液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
15
液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
16
色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
9
检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、 灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。

高效液相色谱法


31
特点： 特点： 氰基键合相选择性与硅胶类似 键合相选择性与硅胶类似， ① 氰基键合相选择性与硅胶类似， 但极性更小。相同流动相， 但极性更小。相同流动相，组分保留 时间小于硅胶。 时间小于硅胶。 氨基键合相 主要用于糖类分析， ② 氨基键合相 主要用于糖类分析， 糖类分析专用柱 分析专用柱。 是糖类分析敏度： 紫外、荧光、电化学、 紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏 度检测器使用。 度检测器使用。 最小检测量： 最小检测量： 10-9 ~10-11 g 4. 高度自动化： 高度自动化： 采用色谱专家系统为核心的色谱智 能化和仿真优化技术， 能化和仿真优化技术，使 HPLC不仅能 不仅能 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 自动处理数据，绘图和打印分析结果， 而且还可以自动控制色谱条件。 而且还可以自动控制色谱条件。
32
2. 流动相极性与容量因子的关系 流动相极性大，洗脱能力增加， 流动相极性大，洗脱能力增加， k 减小，tR 减小；反之， k 与 tR 均 减小， 减小；反之， 增加。 增加。 极性小的组分先出柱
33
四、正、反相色谱法 正相HPLC（normal phase HPLC） （ 正相 ） 固定相： 固定相：极性 常用：改性硅胶 硅胶、 常用：改性硅胶、氰基柱 流动相: 非极性（或弱极性） 流动相 非极性（或弱极性） 常用： 正己烷 常用： 流动相极性小于固定相极性
11
第二节 分离机制 一、液-固吸附色谱法 固吸附色谱法
(Liquid-Solid Chromatography)
（一）吸附机理 根据吸附剂对样品中各组分的吸 根据吸附剂对样品中各组分的吸 附能力差异而分离 而分离。 附能力差异而分离。 吸附过程是被分离组分的分子 与流动相分子争夺吸附剂表面活性 中心(active center)的结果。 的结果。 中心 的结果

高效液相色谱法


60年代研制出气动放大泵、注射泵及低流量往复式 柱塞泵，但后者的脉冲信号很大，难以满足高效液 相色谱的要求。1970年代，往复式双柱塞恒流泵， 解决了这一问题1970年代后，科克兰制备出全多孔 球形硅胶，平均粒径只有7μm，具有极好的柱效， 并逐渐取代了无定形微粒硅胶。之后又制造出的键 合固定相使柱的稳定性大为提高，多次使用成为可 能。1970年后，适合分离生物大分子的填料又成为 研究的热点。1980年后，改善分离的选择性成为色 谱工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动 相的组成是提高选择性的关键
• 流程：如左图所示，流 动相贮器⑴中的流动相 被泵⑵吸入，经梯控制 器按一定的梯度进行混 合然后输出，测其压力 和流量，导入(3）进样 阀（器）经（4）色谱柱 后到（5）检测器检测， 由（7）记录仪记录色谱 图，（6）为废液。
特点（高效液相色谱法有“四高一广”的特点）：
①高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受 到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必 须对载液加高压。 ②高速：分析速度快、载液流速快， 较经典液体色谱法速度快得多，通常 分析一个样品在15～30分钟，有些样 品甚至在5分钟内即可完成，一般小于 1小时。
HPLC已在环境监测中得到广泛应用,特别 适用于分子量大、挥发性低、热稳定 性差的有机污染物的分离和分析如多 环芳烃、酚类、多环联苯、邻苯二甲 酸酯类、联苯胺类、阴离子表面活性 剂有机农药、除草剂等,其中多数属于 美国环保局(EPA)清洁水法案中颁布的 114项优先有机污染物范围。
5.在药品检验中的应用: 现在,在药品质量标准中,对有关物质检查的要 求越来越高,一个药物从合成原料到制备有 关的制剂,再经过贮备、运输、使用,要经过 一段较为复杂和漫长的过程,在此期间,每一 个过程都有可能产生有关的物质,如生产中 可能带入原料、试剂、中间体、副产物和 异构体等;在贮备和运输过程中,可能产生降 解产物,聚合物等。为了保证药物的安全有 效。同时也要考虑到生产的实际情况。因 此,对药物的研究,可以允许有一定量的无害 或低毒性的有关物质液相仪器各厂家的仪 器展。还有对药品的含量测定
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具有一定孔径的多孔性凝胶。
第五节 流动相
R
π
⋅
α
(
−1)(
k2
)
4 α 1+ k2
•
在HPLC中，溶剂不同，与分子间作用力不同，有可能使
组分的R不同，改变溶剂的极性，对组分的洗脱能力改变，tR 改变，实验时可适当配比，以至得到较适宜的R。
• 对流动相的要求：
• 1、不与固定相反应 2、对样品的溶解度适当（控制R2~5） • 3、与检测器匹配 4、粘度小
总之，pH应在2~8，超出将会腐蚀仪器，流路系统。
4、用途：
（1）有机弱酸或弱碱与两性化合物的 分离。
（2）有机弱酸或弱碱与分子型化合物 的分离。
注 意 ： 对 于 pKa<3 的 酸 、 pKa>8 的 碱 不 能用此色谱。
第四节 固定相
一、L～S色谱
1.硅胶： （1）表孔硅胶：（薄壳玻球YBK） 特点：易装柱，但柱效不高，柱容量小（η1000~5000）
② 传质阻抗项引起板高：C=Cm+Csm+Cs
由于目前大都使用数学键合相，以Cs可忽略。
a、引起部分：Hs=
Cs1dp Ds
2
•u
—忽略
Cs—常数与颗粒内空隙体积分数及容量因子有关。
dp填料直径 Ds—组分在固定相中扩散系数。 固定相的粒度dp对物质抗项也有影响
b、由流动相引起部分：Hm=
Cm2 dp2 u , Dm
极性键合相：键合极性基团（氨基、氯基）
1、非极性键合相：键合相表面基团为非极性基团。 常用：ODS键合相（十八烷基键合相） ①载体：全多孔YWG，YQG、堆积硅球，作为ODS键合 相与载体。
国产如：YWG-C18（5，10μm）， YWG-C6（5，10μm） ②表面覆盖度： 参加反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例为
3、光电二极管陈列检测器： 通过吸收池的光经光栅分光200-699nm，分光的光进入
由500个单元组成的光电二极管陈列上。可同时测每隔1nm 的光线，因此UV（200~380nm）及VIS（381~699nm）的谱 线瞬间（约60msec）就可测出。信号经处理后记录仪打出 三维空间图，或是平均吸光度色谱图。
1、高效填料：5μm 10μm 高效 （经典LC75-590μm）
2、高压泵输液：
高压
3、高灵敏度的检测器：
仪器化
HPLC特点：
1、适用范围广 2、高效 3、高速 4、高灵敏度（主要用UV 5×10-10g/ml） 5、流动相选择范围宽 6、柱可以反复使用（可用1-2年） 7、流动组分易收集 8、安全
正相
反相
固定相极性
大
小
流动相极性
小
大
流动顺序
极性小的组分先流出 极性大的组分先流出
∵反相主要用于分离非极性及中等极性各类分子型化合物。 正相色谱:固定相：氰基与氨基化学键合相
流动相：与以硅胶为固定相的吸附色谱选法一致。 反相色谱:固定相如：十八烷基键合相（ODS；orC18表示）
流动相：甲醇-水or乙腈-水 pH2-8
•
优化及选择自学（不要求）。
第六节 仪器
输液泵→进样器→色谱柱→检测器→记录
一、输液泵：—— 往复泵
二、色谱柱与进样器：
1、进样器：早期用隔膜进样阀，带压进样，操作困难， 进样器易反弹出而损坏。
六通阀： 优势：进
样量准确， 重现性好， 可带压进样。
பைடு நூலகம்
2.色谱柱： 由柱管和固定相组成。 柱管：不锈钢管 φ2-5mm L10~30cm 常量柱 φ1~1.5mm L10~20cm 常微量柱 装柱是一项技巧性很强的技术，它直接影响柱效。当填
四、离子抑制色谱ISC
在前边所述的反相色谱法中，调节流动相的pH，抑制组分 离解，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离有机弱酸， 弱碱的目的。
1、适用范围：3.0≤Pka≤7.0 的弱酸
7.0≤Pka≤8.0 的弱碱 而pKa<3的酸，pKa>8的碱应用离子对色谱。 PKa>8 pKb>pH-pKa
2、柱外展宽： 进样器联结管边等死体积越小越好。 HPLC φ2-6mm 10-30cm 死体积约1ml
记：由H=A+Cµ，在HPLC中可近似认为板高 与速成正比（直线关系）μ↑，H↑，n↓， 为了兼顾柱效和分析速度，一般采用较低流 速，多用1ml/min流量。
二、分离度及影响因素：
( ) R = tR2 − tR1
b、提高装柱技术（均匀） c、流动相η↓（∵低粘度流动相可以增大Dm） （Dm 组分在流动相速扩散） d、线速度u↓（减小传质阻抗引起H） e、增加柱长L（但太长，柱压大，寿命短）
第三节
近年来新的HPLC法应运而生
各类HPLC法
HPLC 高效液相
LSC 液固
LLC 液液
IEC 离子交换
SEC 空间排阻
第二十一章
高效液相色谱
§1. 概述 §2. 基本原理 §3. 各类HPLC法 §4. 固定相 §5. 流动相 §6. 仪器 §7. 定性、定量分析
第一节 概述
经典LC GC
优 适用范围广
高效、高速， 高灵敏度、自动化
缺 效率低
300多万化合物中 仅20%能用GC
HPLC：由经典液相色谱→HPLC有三个突破
表孔硅胶(YBK)
无定形全多孔硅胶（YWG） 硅胶
球形全多孔硅胶（YQG）
堆积硅珠
特点
易装柱，柱效不高，柱容量小 （η1000~5000）
柱效高，柱容量大，价廉，但
要匀浆η8000-100000）
具YWG的优，具涡流扩散小， 渗透性好 传质阻抗小，柱容量大 （η>800000）
2、高分子多孔小球：YSG （柱效低η103） 又称有机胶：苯乙烯与二乙烯苯交联而成。 用途：分离芳烃、杂环、甾体、生物碱……
Hsm=
Cm1
dp 2 Dm
•u
,
（Hsm—静态流动相物质阻抗项）
Cm—流动相的物质阻抗系数，与填充物质结构有关 ∴HPLC的范氏方程：
H=A+cu=2λdp+（ Cs1dp2 + Cs1mdp2 ）u
Ds
Dm
Cs
Csm
(1) dp↓，H↓，n↑
(2) Dm↑，流动相粘度增大，H↓，n↑
(3) 要使λ↓，H↓填充要均匀。
2、抑制剂
弱酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液
3、k及其影响因素： (1)凡在反向色谱中的影响因素，此处同样影响。 (2)pH的影响
弱酸：pH<pKa时，k↗,tR 增大（以分子形式在固定相中多） pH>pKa时，k↘,tR (以离子形式为主，流动相中多)
弱碱与上恰相反。pH<pKb tR↘ pH>pKb tR↗
对还原性物质检测限1×10-12g/ml。缺：不能测不能氧化还原 的物质。
第二节 基本原理
一、范氏方程：
1、柱内展宽： H=A+B/μ+Cμ (A涡流扩散 B纵向扩散 C传
质阻抗) 在前述气相GC中B=2rDm中Dm比HPLC中大105倍
在HPLC中第二项可忽略，故高效液相色谱的范氏方程 为：
H = A + Cμ
H=A+Cμ
① 涡流扩散项：A=2λdp（λ-不规则因子 dp填充物直径）
优：可鉴别重叠峰，确认峰纯度，比较各峰化学结构， 并可从几个通道同时进行峰面积计算，提供最佳定量标准。
（二）其它检测器 1、荧光检测器： 样品应有荧光，灵敏度比紫外更高。检测限1×10-10g/ml 2、示差检测器： 利用组分与流动相的折射率之差，类似气相热导、利用
组分与载气热导率不同，进行检测。 缺：对多数物质检测限较低。环境、温度对其均有影响。 3、电化学检测器： 利用组分氧化还原反应，产生电流或电压变化进行检测。
分离碱（RNH2），流动相pH3~3.5
K=
[
RNH
+ 3
⋅
PICB]s
[
RNH
+ 3
⋅
PICB]m
分离酸（RCOOH）
pH≈7.5
K=
[RCOO− ⋅ PICA]s [IRCOO− ⋅ PICA]m
注：①凡在反相色谱中影响K的因素，此处同样。
②离子对试剂C链↑，K↑，k↑。
此离子对色谱在药物分析中对有机酸、生物碱及抗生素 应用较广。但有试剂价格贵，且流动相因有一定pH，对泵和 流路有腐蚀。
（2）无定形全多孔硅胶：YWG、5~10μm 特点：柱效高，柱容量大，但要匀浆装柱。价格便宜 （η80000~100000）
（3）球形全多孔硅胶：YQG 3~10μm 特点：除具有YWG的优点外，还具涡流扩散项小及渗透
性好等特点。 （4）堆积硅珠：SiO2 溶胶+凝胶剂聚结而成。3~5μm
特点：传质阻抗小，柱容量大（η>80000）
（一）紫外检测器： 优：灵敏度高，精密度、线性范围好，可用于梯度洗脱。 缺：①样品组分应吸收紫外光 ②要考虑溶剂的极限波长
1、固定波长型： 光源：254nm低压汞灯，此类检测器光源强度大，灵敏
度高，检测限可达1×10-9g/ml，是一种简便实用的检测器。 2、可变波长检测器
可选择λmax（类似于可见—紫外分光光度计），将波 长调在ε最大的λmax处进行检测，以增加灵敏度。（有些 配置较好的还可同时扫出紫外光谱），现多数HPLC配这种 检测器。
AC 亲和色谱
CE
毛细管电泳
BPC
化学键合相
NPBC 正—
RBPC 反—
PIC 离子对
我们仅讲其中部分内容：
ISC 离子抑制
一、液-固吸附色谱：LSC