下载文档原格式
核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述一、核酸的分离纯化技术1.超声破碎法超声破碎法是一种通过超声波的振动作用破碎细胞膜，释放细胞内的核酸分子的方法。
该方法操作简便，效果较好。
2.酚-氯仿提取法酚-氯仿提取法是一种经典的核酸提取方法，通过酚和氯仿相间重复萃取的方法，将细胞或组织中的核酸分子提取到有机相中，然后用酒精沉淀。
3.离心沉淀法离心沉淀法是利用不同物质在不同离心力下沉降速度的不同，将核酸从其他组分中分离出来的方法。
可通过高速离心使核酸沉淀到底部，将上清液中的其他杂质倒掉，最后用缓冲液重悬核酸。
4.配对离心法配对离心法是利用核酸的碱基配对性质，在特定的条件下使目标DNA 与特异性探针配对，然后通过离心将核酸-探针复合物从其他杂质中分离出来。
这种方法常用于核酸的富集和寡核苷酸修饰位点的分析。
二、核酸的鉴定技术1. 紫外-可见分光光度法（UV-Vis）紫外-可见分光光度法是通过核酸分子在紫外光或可见光波长范围内的吸收特性来确定其存在和浓度的方法。
根据核酸中含有的吸收波长为260 nm处的碱基特征吸光峰，可以判断核酸的纯度和浓度。
2.电泳分析法电泳分析法是通过核酸分子在电场中的迁移速率和特定条件下的尺寸分离效应来分析核酸的方法。
主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法。
核酸经电泳后可以观察到DNA或RNA在凝胶中的特征性带状图案，确定其分子大小、纯度和带电性。
3.PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种常用的核酸鉴定技术，通过特定引物和聚合酶的作用，在体外进行核酸的扩增以达到检测目的。
PCR可用于快速检测目标DNA的存在与否，以及定性和定量分析。
4.基因测序技术基因测序技术是指利用测序反应将核酸序列信息转化为比特（通常指二进制），然后通过计算机软件分析的方法对核酸序列进行鉴定。
常用的基因测序技术有dideoxy测序和串联反应测序。
三、应用核酸的分离纯化及鉴定技术广泛应用于生物医学研究、遗传学、分子生物学、基因工程和疾病诊断等领域。
核酸分离与纯化的技术路线与原则核酸包括DNA 、RNA两类分子，在细胞内均与蛋白质结合成核蛋白。
真核生物基因组中，95%DNA 为双链线性分子，存在于细胞核中，5%为双链环状分子，存在于细胞器中；原核生物DNA 及质粒DNA 为双链或单链环状分子；RNA 为单链线性分子，主要存在于细胞质中。
DNA 与RNA 性质的不同导致对其分离与纯化的条件也不相同。
一、核酸分离与纯化的原则(1)保证核酸一级结构的完整性。
生物的遗传信息全部贮存在核酸一级结构中，而且核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及和其他大分子结合的方式。
所以，所提取的核酸一级结构的完整性直接影响着后续实验中对其结构与功能研究的质量。
因此，在制备核酸的过程中，要做到：尽量简化操作程序，缩短提取过程；避免过酸、过碱等化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏，在pH 值4～10条件下进行操作；操作时动作要轻缓，提取的样品小包装保存，以免诸多的物理因素对核酸的降解；避免细胞内及环境中核酶对核酸的生物性降解。
(2)排除其他生物大分子的污染，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应尽可能降低到最低程度，特别是提取DNA 分子时应除去RNA 分子，反之亦然。
(3)排除核酸样品中有机溶剂和过高浓度的金属离子。
二、分离与纯化的技术路线(一)核酸的释放通常情况下DNA 及RNA 均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是制备单个细胞，再破碎细胞，从而释放核酸。
破碎细胞的方法包括机械法与非机械法两大类。
机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法；非机械法可分为干燥法与溶胞法。
由于溶胞法采用适宜的化学试剂与酶，能有效地裂解细胞，方法温和，能保证较高的核酸获得率，并能较好地保持核酸的完整性，从而得到广泛的应用。
(二)核酸的分离与纯化利用核酸与其他物质性质上的差异，可以分离与纯化核酸。
这种差异包括细胞定位与组织分布上的差异，物理、化学性质上的不同，以及各自独特的生物学特性。
操作过程中，既可以从复杂样品中抽提出核酸分子，也可以将样品中的非核酸成分(非核酸的生物大分子、非需要的核酸分子及在操作过程中加入的溶液与试剂)逐步清除。
核酸分离与纯化技术的实验操作步骤引言：核酸分离与纯化技术是现代生命科学研究中不可或缺的重要手段。
在分子生物学研究中，分离和纯化核酸的高效率和高质量是保证实验结果准确性的关键。
本文将介绍一种常用的核酸分离与纯化技术，并详细叙述其实验操作步骤。
材料与设备准备：首先，我们需要准备以下实验材料与设备：1. 厌氧蒸馏水：用于制备实验过程中所需的缓冲液和试剂；2. 离心管：用于收集和离心样品；3. 磁力搅拌器：用于在适当温度下进行试剂反应；4. 超低温冰箱：用于保存实验动物组织和细胞样品；5. 离心机：用于离心样品以分离细胞碎片和细胞核；6. 高速离心机：用于离心样品以分离核酸；7. 离心管架：用于固定离心管，防止其在离心过程中翻倒。
实验操作步骤：一、细胞收获与裂解1. 从培养皿中收集待处理的细胞，并用无菌生理盐水洗涤一次，去除培养基残留。
2. 加入适量的细胞裂解缓冲液（含有蛋白酶抑制剂）裂解细胞，在低温条件下搅拌1-2小时。
二、细胞碎片与细胞核的分离1. 将裂解后的细胞样品离心10分钟，离心速度2000g，室温，将上清液（上清液中包含细胞碎片和核糖核蛋白等）转移到新的离心管中。
2. 将上清液进行二次离心，离心速度10000g， 10分钟，4℃。
3. 丢弃上清液中的细胞碎片，在室温下用冷蒸馏水悬浮沉淀。
三、核酸的纯化1. 向沉淀中加入适量的核酸提取试剂，充分悬浮沉淀，并在室温下搅拌5-10分钟。
2. 通过离心的方式将沉淀分离，离心速度10000g，10分钟，室温。
3. 取出上清液（富含核酸）放入离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后放置于室温下搅拌10分钟。
4. 通过离心分离异丙醇上清液和沉淀，离心速度10000g，10分钟，室温。
5. 倒掉上清液，用70%无菌酒精洗涤沉淀。
将酒精去除后，用离心机低速离心，离心速度2000g，5分钟，即可获得纯化的核酸。
结论：通过上述实验操作步骤，我们可以成功地进行核酸的分离与纯化。
