第五章+核酸分离与纯化技术

核酸的分离纯化及鉴定技术生化分析描述一、核酸的分离纯化技术1.超声破碎法超声破碎法是一种通过超声波的振动作用破碎细胞膜，释放细胞内的核酸分子的方法。

该方法操作简便，效果较好。

2.酚-氯仿提取法酚-氯仿提取法是一种经典的核酸提取方法，通过酚和氯仿相间重复萃取的方法，将细胞或组织中的核酸分子提取到有机相中，然后用酒精沉淀。

3.离心沉淀法离心沉淀法是利用不同物质在不同离心力下沉降速度的不同，将核酸从其他组分中分离出来的方法。

可通过高速离心使核酸沉淀到底部，将上清液中的其他杂质倒掉，最后用缓冲液重悬核酸。

4.配对离心法配对离心法是利用核酸的碱基配对性质，在特定的条件下使目标DNA 与特异性探针配对，然后通过离心将核酸-探针复合物从其他杂质中分离出来。

这种方法常用于核酸的富集和寡核苷酸修饰位点的分析。

二、核酸的鉴定技术1. 紫外-可见分光光度法（UV-Vis）紫外-可见分光光度法是通过核酸分子在紫外光或可见光波长范围内的吸收特性来确定其存在和浓度的方法。

根据核酸中含有的吸收波长为260 nm处的碱基特征吸光峰，可以判断核酸的纯度和浓度。

2.电泳分析法电泳分析法是通过核酸分子在电场中的迁移速率和特定条件下的尺寸分离效应来分析核酸的方法。

主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种方法。

核酸经电泳后可以观察到DNA或RNA在凝胶中的特征性带状图案，确定其分子大小、纯度和带电性。

3.PCR（聚合酶链式反应）PCR是一种常用的核酸鉴定技术，通过特定引物和聚合酶的作用，在体外进行核酸的扩增以达到检测目的。

PCR可用于快速检测目标DNA的存在与否，以及定性和定量分析。

4.基因测序技术基因测序技术是指利用测序反应将核酸序列信息转化为比特（通常指二进制），然后通过计算机软件分析的方法对核酸序列进行鉴定。

常用的基因测序技术有dideoxy测序和串联反应测序。

三、应用核酸的分离纯化及鉴定技术广泛应用于生物医学研究、遗传学、分子生物学、基因工程和疾病诊断等领域。

核酸分离与纯化的技术路线与原则核酸包括DNA 、RNA两类分子，在细胞内均与蛋白质结合成核蛋白。

真核生物基因组中，95%DNA 为双链线性分子，存在于细胞核中，5%为双链环状分子，存在于细胞器中；原核生物DNA 及质粒DNA 为双链或单链环状分子；RNA 为单链线性分子，主要存在于细胞质中。

DNA 与RNA 性质的不同导致对其分离与纯化的条件也不相同。

一、核酸分离与纯化的原则(1)保证核酸一级结构的完整性。

生物的遗传信息全部贮存在核酸一级结构中，而且核酸的一级结构还决定其高级结构的形式及和其他大分子结合的方式。

所以，所提取的核酸一级结构的完整性直接影响着后续实验中对其结构与功能研究的质量。

因此，在制备核酸的过程中，要做到：尽量简化操作程序，缩短提取过程；避免过酸、过碱等化学因素对核酸链中磷酸二酯键的破坏，在pH 值4～10条件下进行操作；操作时动作要轻缓，提取的样品小包装保存，以免诸多的物理因素对核酸的降解；避免细胞内及环境中核酶对核酸的生物性降解。

(2)排除其他生物大分子的污染，如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应尽可能降低到最低程度，特别是提取DNA 分子时应除去RNA 分子，反之亦然。

(3)排除核酸样品中有机溶剂和过高浓度的金属离子。

二、分离与纯化的技术路线(一)核酸的释放通常情况下DNA 及RNA 均位于细胞内，因此核酸分离与纯化的第一步就是制备单个细胞，再破碎细胞，从而释放核酸。

破碎细胞的方法包括机械法与非机械法两大类。

机械法又可分为液体剪切法与固体剪切法；非机械法可分为干燥法与溶胞法。

由于溶胞法采用适宜的化学试剂与酶，能有效地裂解细胞，方法温和，能保证较高的核酸获得率，并能较好地保持核酸的完整性，从而得到广泛的应用。

(二)核酸的分离与纯化利用核酸与其他物质性质上的差异，可以分离与纯化核酸。

这种差异包括细胞定位与组织分布上的差异，物理、化学性质上的不同，以及各自独特的生物学特性。

操作过程中，既可以从复杂样品中抽提出核酸分子，也可以将样品中的非核酸成分(非核酸的生物大分子、非需要的核酸分子及在操作过程中加入的溶液与试剂)逐步清除。

核酸分离与纯化技术的实验操作步骤引言：核酸分离与纯化技术是现代生命科学研究中不可或缺的重要手段。

在分子生物学研究中，分离和纯化核酸的高效率和高质量是保证实验结果准确性的关键。

本文将介绍一种常用的核酸分离与纯化技术，并详细叙述其实验操作步骤。

材料与设备准备：首先，我们需要准备以下实验材料与设备：1. 厌氧蒸馏水：用于制备实验过程中所需的缓冲液和试剂；2. 离心管：用于收集和离心样品；3. 磁力搅拌器：用于在适当温度下进行试剂反应；4. 超低温冰箱：用于保存实验动物组织和细胞样品；5. 离心机：用于离心样品以分离细胞碎片和细胞核；6. 高速离心机：用于离心样品以分离核酸；7. 离心管架：用于固定离心管，防止其在离心过程中翻倒。

实验操作步骤：一、细胞收获与裂解1. 从培养皿中收集待处理的细胞，并用无菌生理盐水洗涤一次，去除培养基残留。

2. 加入适量的细胞裂解缓冲液（含有蛋白酶抑制剂）裂解细胞，在低温条件下搅拌1-2小时。

二、细胞碎片与细胞核的分离1. 将裂解后的细胞样品离心10分钟，离心速度2000g，室温，将上清液（上清液中包含细胞碎片和核糖核蛋白等）转移到新的离心管中。

2. 将上清液进行二次离心，离心速度10000g， 10分钟，4℃。

3. 丢弃上清液中的细胞碎片，在室温下用冷蒸馏水悬浮沉淀。

三、核酸的纯化1. 向沉淀中加入适量的核酸提取试剂，充分悬浮沉淀，并在室温下搅拌5-10分钟。

2. 通过离心的方式将沉淀分离，离心速度10000g，10分钟，室温。

3. 取出上清液（富含核酸）放入离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后放置于室温下搅拌10分钟。

4. 通过离心分离异丙醇上清液和沉淀，离心速度10000g，10分钟，室温。

5. 倒掉上清液，用70%无菌酒精洗涤沉淀。

将酒精去除后，用离心机低速离心，离心速度2000g，5分钟，即可获得纯化的核酸。

结论：通过上述实验操作步骤，我们可以成功地进行核酸的分离与纯化。

医学课件-核酸的分离与纯化xx年xx月xx日•核酸的概述•核酸的分离技术•核酸的纯化技术目录•核酸分离与纯化的应用01核酸的概述1核酸的化学组成23核酸的基本组成单位，由碱基、戊糖和磷酸组成。

核苷酸以脱氧核糖为戊糖，主要分布在细胞核中，是细胞内遗传信息的主要载体。

脱氧核糖核酸（DNA）以核糖为戊糖，主要分布在细胞质中，参与蛋白质合成和其他细胞活动。

核糖核酸（RNA）03核酸的功能作为遗传信息的载体，参与蛋白质合成、基因表达调控等生命活动。

核酸的结构与功能01DNA的双螺旋结构由两条反向平行的多核苷酸链组成，互补碱基对之间的氢键连接维持其稳定性。

02RNA的结构多样性根据功能不同，RNA可形成单链、双链或复杂的三级结构，如核糖体、microRNA等。

分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。

核酸的分类与分布根据来源分为编码RNA和非编码RNA。

根据功能DNA主要分布在细胞核中，RNA 主要分布在细胞质中。

分布02核酸的分离技术低速离心机用于分离小分子物质，如蛋白质、核酸等。

高速离心机用于分离大分子物质，根据物质的不同密度和粒径进行分离。

微量离心机用于分离小量样品，如血液、组织等。

离心分离技术电泳分离技术凝胶电泳用于分离大分子物质，如蛋白质、核酸等。

聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离蛋白质、多肽等小分子物质。

等电聚焦电泳用于分离具有等电点的蛋白质等生物分子。

常用的色谱分离技术，可用于分离各种物质，如蛋白质、核酸等。

柱色谱将样品在薄层板上进行分离，适用于小量样品的分离。

薄层色谱一种高分离效能的色谱技术，可用于分离各种物质，如蛋白质、核酸等。

高效液相色谱色谱分离技术03核酸的纯化技术原理分子筛层析是一种根据分子大小不同对样品进行分离的方法。

它利用了分子筛的孔径大小，只有符合孔径大小的分子才能进入分子筛内部，从而达到分离效果。

分子筛层析应用分子筛层析在核酸纯化中广泛应用于分离和纯化DNA和RNA，特别是对于较大分子的分离效果更佳。

第4章基因操作的主要技术原理基因操作的方法包括:大分子DNA的提取、DNA分子的切割和连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、DNA序列分析、基因的人工合成、基因定点突变、PCR扩增等。

DNA分子的切割和连接是基因操作的核心技术。

一、核酸的分离和纯化技术核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中它们都是以与蛋白质结合的状态存在。

DNA：真核生物染色体DNA——双链线性；真核生物的细胞器DNA——双链环状；原核生物的核区DNA、质粒——双链环状。

RNA：RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子。

一般生物体基因组DNA大小为107-8bp。

DNA提取的目的（1）可用PCR从基因组中扩增基因；（2）作RAPD分析，区别两种物种之间的亲缘关系；（3）作Southern分析，检测是否转入基因；探测同源的基因；（4）作酶切图谱，用于DNA测序。

（一）总DNA的提取DNA在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0。

14 mol/L的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。

总DNA：一般来说是指基因组DNA ，即细胞核内的染色体DNA分子。

核DNA分子呈极不对称的线性结构，一条染色体为一个DNA分子。

其长度与直径的比例极不对称性，使其对极械力十分敏感。

分离纯化中DNA分子的断裂是很难避免的。

尽可能保持DNA分子的完整性是DNA分离技术的关键。

（1）有效制备大分子DNA的方法主要考虑两个原则：①防止和抑制内源DNase对DNA的降解；DNase 以Mg2+、Mn2+为辅助因子，只要加入一定的螯合剂，如EDTA（乙二胺四乙酸钠）、柠檬酸便可。

②尽量减少对溶液中DNA的机械剪切力。

动作轻柔、减少涡旋、使用大口吸管。

（2）DNA提取的主要操作过程（3）DNA提取的主要问题及解决方法：①DNA沉淀呈棕色，很难酶切或扩增；多酚、单宁、色素等氧化所致。

核酸的分讲义离纯化及鉴定技术生化分析详解核酸的分离纯化及鉴定技术在生化分析领域具有重要的应用价值。

核酸是生物体内重要的生物大分子，它们具有保存、传递和表达遗传信息的功能。

为了研究核酸的结构和功能，需要对其进行分离、纯化和鉴定。

本文将详细介绍核酸的分离纯化和鉴定技术的生物化学分析。

1.核酸的提取与分离核酸提取是获得核酸样品的第一步，通过破碎细胞膜和细胞壁来释放核酸。

核酸的提取方法主要包括酸性酚/氯仿提取法、盐酸酚/氯仿提取法以及商业化的核酸提取试剂盒等。

2.核酸的纯化核酸提取后，常常需要对核酸进行纯化。

纯化目的是去除杂质，使核酸得到高纯度、高浓度、完整和可靠的分离。

核酸纯化方法主要有：凝胶柱层析、离心柱层析、沉淀、电泳、凝胶电泳纯化、离心纯化、溶液法纯化等。

3.核酸的鉴定核酸的鉴定一般包括酶切鉴定、PCR扩增鉴定和测序鉴定等。

(1)酶切鉴定酶切鉴定是通过限制性内切酶作用分析核酸的序列和结构。

通过将样品与不同酶切加入，并经过酶切电泳后，观察电泳图的特征带，可以推测样品的核酸类型和纯度。

(2)PCR扩增鉴定PCR扩增鉴定是通过聚合酶链式反应（PCR）扩增特定片段的核酸。

通过选择特异的引物，可以扩增出目标核酸片段，从而确定核酸的存在和纯度。

(3)测序鉴定测序鉴定是通过测序技术研究核酸的序列。

常见的测序技术包括Sanger测序、下一代测序（NGS）和单分子测序等。

通过测序，可以确定核酸的准确序列，从而判断核酸的类型和功能。

整体而言，核酸的分离纯化及鉴定技术是生化分析中核心的内容。

通过这些技术，可以获得高纯度、高质量的核酸样品，并准确地鉴定核酸的存在和序列信息。

这些技术的应用广泛，包括基因组学、生物信息学、分子生物学、疾病诊断和药物研发等领域。

随着生化分析技术的不断发展，核酸的分离纯化及鉴定技术将越来越重要，为科学研究和生物医学领域的发展提供强有力的支持。

第五章核酸的分离纯化第五章核酸的分离纯化核酸分离纯化的原则:保持核酸一级结构的完整性尽可能提高核酸制品的纯度DNA与RNA在分子大小、理化性质等方面不同分离方法存在差异。

DNA和RNA是生物体中最重要的核酸分子，是分子生物学和分子诊断的研究对象DNA和RNA的分离与纯化技术是分子生物学研究中重要的基本技术。

核蛋白：核酸+蛋白质DNP：DNA+蛋白质RNP：RNA+蛋白质第一节核酸分离纯化的设计及原则（一）材料与方法的选择不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度有不同的要求。

需考虑制备核酸所需的时间与成本应选择安全的试剂与制备方案（二）选择原则1.保持核酸碱基序列的完整性2.尽量清除其它分子的污染，保证核酸纯度3.保持核酸的完整性尽量简化分离纯化步骤，缩短提取时间尽量避免各种有害因素对核酸的破坏二、技术路线的设计（一）核酸的释放DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。

（二）核酸的分离与纯化应该清除的杂质主要包括:1.非核酸的大分子污染物蛋白质、多糖及脂类物质等2.非需要的核酸分子分离某一核酸分子时，其它核酸皆为杂质3.加入的有机溶剂和某些金属离子（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀是浓缩核酸最常用的方法常用的盐类:醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵、氯化钠、氯化钾及氯化镁常用的有机溶剂:乙醇、异丙醇和聚乙二醇核酸沉淀常常含有少量共沉淀的盐，需用70%～75%的乙醇洗涤去除三、核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定1.浓度鉴定（1）紫外分光光度法：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm。

DNA或RNA的定量OD260=1.0相当于：50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA（或RNA）33μg/ml寡核苷酸适用于>0.25μg/ml的核酸溶液（2）荧光光度法：A:溴化乙锭（EB)核酸的荧光染料溴化乙锭（EB)嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV 激发下发出红色荧光。