第四章 核酸分离纯化

磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。

硅磁（Magnet ic Silic a Partic le）就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。

离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如DEAE，COO H）等，从而达到吸附核酸目的。

不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。

使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。

磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。

Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有’Mag-Bind’。

核酸分离与纯化的原则核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。

核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。

在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。

核酸分离与纯化的步骤大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。

每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。

1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。

细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。

(1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。

这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。

有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ～> 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。

(2) 化学作用:在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相。

上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍) 而获得。

核酸的分离纯化技术从细胞中提取核酸后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。

除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。

在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在0～4℃的低温条件下操作。

核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。

关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。

除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。

②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。

③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。

④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。

（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。

因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。

常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。

去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。

②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。

此法在分离纯化中也常反复使用。

③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA 或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。

（3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。

简述核酸分离纯化的主要步骤核酸分离纯化的主要步骤其实就是一场与基因的“亲密接触”。

我们就像是在进行一场精密的科学“约会”，只不过对象是DNA或RNA，而不是人。

好啦，咱们来看看这个过程如何进行的吧。

1. 材料准备
1.1 样品收集
首先，你得找点样品，可能是植物、动物，甚至是细菌。

想象一下，就像挑选食材一样，你需要挑选新鲜的“原料”。

1.2 细胞裂解
接下来，咱们要“破壳”了！通过加入一些裂解缓冲液，把细胞膜弄开，释放出里面的核酸。

这个过程就像是打开一个“宝箱”，哇，里面可真丰富！
2. 去除杂质
2.1 去除蛋白质
这一步，你得用一些蛋白酶，把细胞里的蛋白质都搞定。

想象一下，就像是把不需要的东西清理出去，只留下最闪亮的宝物。

2.2 沉淀核酸
然后，咱们需要加入酒精，通常是乙醇。

核酸会跟酒精“亲密接触”，沉淀下来。

这个时候你会发现，核酸就像是被请出舞池的主角，闪闪发光！
3. 洗涤与重溶
3.1 洗涤
在沉淀后的核酸上，加点洗涤液，就像给它洗个澡，把残留的杂质都冲走。

你得小心翼翼，别让它“滑了”！。

3.2 重溶
最后一步，是把洗净的核酸重新溶解在缓冲液中。

这个过程就像是给核酸穿上新衣服，焕然一新，准备出门见客！
完成这些步骤后，你的核酸就“出炉”啦！感觉就像是一场成功的约会，满载而归。

希望这个过程能让你对核酸分离纯化有个更轻松的了解。

就这样，你成功地和基因建立了“深厚的友谊”，为后续的实验打下了良好的基础！。

核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法包括以下几种常用方法：
1. 酚酸法（Phenol-Chloroform Extraction）：通过酚酸混合液溶解蛋白质，然后进行醚抽提，可分离出核酸。

该方法通常用于大量样品的纯化。

2. 高盐法（Salt Precipitation）：通过加入高浓度盐溶液，如氯化钠，使核酸在低温下形成沉淀，然后离心分离。

3. 硅胶柱法（Silica Column）：将核酸样品通过硅胶柱，利用硅胶对核酸的亲合性，使核酸固定在柱中，通过洗脱剂洗脱纯化的核酸。

4. 钠离子交换柱法（Sodium Ion Exchange Column）：利用柱内载体对核酸的亲合性，在一定的钠离子浓度下，核酸与载体结合，通过洗脱缓冲液洗脱纯化的核酸。

5. 凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：利用电场作用，将核酸样品在凝胶上进行分离和纯化。

根据核酸的大小，可选择琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。

核酸分离纯化的技术原理核酸提取是核酸检测实验的第一步，也是最关键的一步。

核酸提取的纯度、产量和质量是影响下游实验的关键。

核酸提取主要有两个步骤，分别是裂解和纯化，其中，裂解的目的是通过各种方法裂解细胞，将核酸释放到溶液中，纯化的目的则是将核酸分子从裂解液中特异性地分离出，从而避免裂解液中原有的蛋白分子、脂类、糖类、多肽、其他有机或无机分子对后续核酸检测实验的干扰。

在核酸提取过程中还应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；去除其他污染分子。

一、液相核酸分离纯化技术（一）胍硫氰酸酚-氯仿提取法盐类通常是核酸样本中最常见的杂质成分，因此，在将核酸样本进行下游处理和分析前，通常需要去除盐类成分。

因此，通常需一或多个分离和（或）纯化步骤来使样本脱盐。

核酸纯化的常规步骤包括细胞裂解，该步骤通过破坏细胞结构而形成细胞裂解液，同时灭活包括DNA酶和RNA酶在内的细胞内源性核酶，并最终从细胞碎片中获得纯净的核酸样本。

有机溶剂-苯酚-氯仿提取法正是基于上述原理最常见的核酸经典提取方法之一。

苯酚-氯仿-异丙醇按照一定比例混合后（即：25∶24∶1）可抵制RNA酶活性，从而克服单用苯酚无法抑制RNA酶活性的不足。

蛋白、脂质、碳水化合物和细胞碎片可通过提取苯酚和氯仿有机试剂混合物的水相而去除。

含有DNA样本的水相可通过加入2∶1或1∶1比例的乙醇或异丙醇沉淀，最后，沉淀下来的DNA用70%乙醇洗涤并最后溶解于TE缓冲液或无菌去离子水中。

异硫氰酸胍（guanidinium isothiocyanate）用于RNA提取的方法最早见于1977年，但是，由于该方法比较繁琐，后来逐步被称之为胍硫氰酸酚-氯仿提取法（guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）代替，该方法可一步完成RNA提取。

其基本原理是：硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚-氯仿抽提，使RNA 与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。

简述核酸分离纯化的主要步骤。

大家好，今天我们来聊聊核酸分离纯化这件事。

说到这个话题，很多人可能会觉得这就像是从泥巴里找金子，难得不得了，但其实只要掌握了步骤，简直就像是在玩一场化学版的捉迷藏。

核酸分离纯化是为了从各种样本中提取出我们的DNA或RNA，并且把它们从其他杂质中清理出来。

要做到这一点，我们得一步步来，每一步都不容马虎。

接下来，就让我带大家一起走进这个过程，看看如何让这些细小的分子从一堆混乱中脱颖而出。

2. 主要步骤详解2.1 样本准备首先，咱们得从头开始，准备好样本。

想象一下，我们要从一杯混合果汁中找出果肉，首先就得把这杯果汁倒进一个干净的容器里。

具体来说，我们通常会从细胞中提取核酸，所以需要将细胞破碎以释放出核酸。

这个过程就像是在打开一罐罐头，一切都要小心翼翼。

为了让细胞破裂，我们会用到一些化学试剂或者物理方法，比如用研磨机或者超声波处理。

就像是把一个充满秘密的小盒子打开，里面的核酸就这样被释放了出来。

2.2 核酸提取一旦细胞被破坏，释放出的核酸就是我们接下来要处理的对象。

这时候我们需要把这些核酸从其他杂质中分离出来。

这个步骤就像是在海滩上捡贝壳，我们需要把那些不起眼的沙子和海藻去掉，剩下的才是我们真正想要的。

核酸提取的方法有很多，比如利用试剂盒或者化学溶液。

常见的有酚氯仿提取法和柱纯化法。

酚氯仿法就像是用一招老派的武功，把核酸和蛋白质分开，而柱纯化法则像是用现代化的设备，让核酸在特定的柱子上游刃有余地被吸附下来。

2.3 核酸纯化好啦，提取出核酸之后，接下来就是纯化了。

纯化这一步，就像是用细网筛选掉杂质，只留下最珍贵的部分。

我们通常会使用一些化学试剂来清洗掉剩余的杂质，比如盐、酒精等。

这个过程有点像给你的衣服做干洗，把那些不干净的部分都清理干净。

纯化的目的是为了确保你得到的核酸足够干净，以便后续的实验能顺利进行。

3. 检测与保存3.1 检测最后一步，我们得检测一下核酸的质量，看看它是不是达到了要求。