第四章 核酸分离纯化

磁珠法核酸纯化技术采用了纳米级磁珠微珠，这种磁珠微珠的表面标记了一种官能团，能同核酸发生吸附反应。

硅磁（Magnet ic Silic a Partic le）就是指磁珠微珠表面包裹一层硅材料，来吸附核酸，其纯化原理类型于玻璃奶的纯化方式。

离心磁珠是指磁珠微珠表面包裹了一层可发生离心交换的材料（如DEAE，COO H）等，从而达到吸附核酸目的。

不同性质的磁珠微珠所对应的纯化原理是不一致。

使用磁珠法来纯化核酸的最大优点就是自动化。

磁珠在磁场条件下可以发生聚集或分散，从而可彻底摆脱离心等所需的手工操作流程。

Omega拥有全面的磁珠法核酸分离试剂盒，基于这种技术的试剂盒，名称前都有’Mag-Bind’。

核酸分离与纯化的原则核酸在细胞中总是与各种蛋白质结合在一起的。

核酸的分离主要是指将核酸与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开。

在分离核酸时应遵循以下原则:保证核酸分子一级结构的完整性;排除其他分子污染。

核酸分离与纯化的步骤大多数核酸分离与纯化的方法一般都包括了细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。

每一步骤又可由多种不同的方法单独或联合实现。

1. 细胞裂解:核酸必须从细胞或其他生物物质中释放出来。

细胞裂解可通过机械作用、化学作用、酶作用等方法实现。

(1) 机械作用:包括低渗裂解、超声裂解、微波裂解、冻融裂解和颗粒破碎等物理裂解方法。

这些方法用机械力使细胞破碎,但机械力也可引起核酸链的断裂,因而不适用于高分子量长链核酸的分离。

有报道超声裂解法提取的核酸片段长度从< 500bp ～> 20kb 之间,而颗粒匀浆法提取的核酸一般< 10kb。

(2) 化学作用:在一定的p H 环境和变性条件下,细胞破裂,蛋白质变性沉淀,核酸被释放到水相。

上述变性条件可通过加热、加入表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 、CTAB、sar-cosyl 、Chelex-100 等) 或强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍、肌酸胍) 而获得。

核酸的分离纯化技术从细胞中提取核酸后，仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。

除去这些“杂质”的过程，也就是核酸提纯过程。

在核酸的分离纯化时，为防止核酸大分子的变性降解，必须在0～4℃的低温条件下操作。

核酸酶的水解作用，是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍，现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+，就可以抑制核酸酶的活性，保证在提纯过程中核酸大分子的完整。

关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法，分别介绍如下：（1）肝糖元、淀粉及粘多糖，由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处，常在提取液中残存下来。

除去的方法常有：①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大大减少。

②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。

③在浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机层中。

④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理，使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸附DNA，使之与多糖分离。

（2）蛋白质的除去：由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在，不论采用哪种方法提取核酸，蛋白质都不同程度地存在于体系中。

因此，除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。

常用方法有下列几种：①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。

去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用，效果更加理想。

②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶液中。

此法在分离纯化中也常反复使用。

③苯酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA 或DNA，残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。

（3）不同类型核酸的分离：两种类型核酸的制备过程中，DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。

简述核酸分离纯化的主要步骤核酸分离纯化的主要步骤其实就是一场与基因的“亲密接触”。

我们就像是在进行一场精密的科学“约会”，只不过对象是DNA或RNA，而不是人。

好啦，咱们来看看这个过程如何进行的吧。

1. 材料准备
1.1 样品收集
首先，你得找点样品，可能是植物、动物，甚至是细菌。

想象一下，就像挑选食材一样，你需要挑选新鲜的“原料”。

1.2 细胞裂解
接下来，咱们要“破壳”了！通过加入一些裂解缓冲液，把细胞膜弄开，释放出里面的核酸。

这个过程就像是打开一个“宝箱”，哇，里面可真丰富！
2. 去除杂质
2.1 去除蛋白质
这一步，你得用一些蛋白酶，把细胞里的蛋白质都搞定。

想象一下，就像是把不需要的东西清理出去，只留下最闪亮的宝物。

2.2 沉淀核酸
然后，咱们需要加入酒精，通常是乙醇。

核酸会跟酒精“亲密接触”，沉淀下来。

这个时候你会发现，核酸就像是被请出舞池的主角，闪闪发光！
3. 洗涤与重溶
3.1 洗涤
在沉淀后的核酸上，加点洗涤液，就像给它洗个澡，把残留的杂质都冲走。

你得小心翼翼，别让它“滑了”！。

3.2 重溶
最后一步，是把洗净的核酸重新溶解在缓冲液中。

这个过程就像是给核酸穿上新衣服，焕然一新，准备出门见客！
完成这些步骤后，你的核酸就“出炉”啦！感觉就像是一场成功的约会，满载而归。

希望这个过程能让你对核酸分离纯化有个更轻松的了解。

就这样，你成功地和基因建立了“深厚的友谊”，为后续的实验打下了良好的基础！。

核酸分离纯化方法
核酸分离纯化方法包括以下几种常用方法：
1. 酚酸法（Phenol-Chloroform Extraction）：通过酚酸混合液溶解蛋白质，然后进行醚抽提，可分离出核酸。

该方法通常用于大量样品的纯化。

2. 高盐法（Salt Precipitation）：通过加入高浓度盐溶液，如氯化钠，使核酸在低温下形成沉淀，然后离心分离。

3. 硅胶柱法（Silica Column）：将核酸样品通过硅胶柱，利用硅胶对核酸的亲合性，使核酸固定在柱中，通过洗脱剂洗脱纯化的核酸。

4. 钠离子交换柱法（Sodium Ion Exchange Column）：利用柱内载体对核酸的亲合性，在一定的钠离子浓度下，核酸与载体结合，通过洗脱缓冲液洗脱纯化的核酸。

5. 凝胶电泳法（Gel Electrophoresis）：利用电场作用，将核酸样品在凝胶上进行分离和纯化。

根据核酸的大小，可选择琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。

核酸分离纯化的技术原理核酸提取是核酸检测实验的第一步，也是最关键的一步。

核酸提取的纯度、产量和质量是影响下游实验的关键。

核酸提取主要有两个步骤，分别是裂解和纯化，其中，裂解的目的是通过各种方法裂解细胞，将核酸释放到溶液中，纯化的目的则是将核酸分子从裂解液中特异性地分离出，从而避免裂解液中原有的蛋白分子、脂类、糖类、多肽、其他有机或无机分子对后续核酸检测实验的干扰。

在核酸提取过程中还应遵循以下原则：保证核酸分子一级结构的完整性；去除其他污染分子。

一、液相核酸分离纯化技术（一）胍硫氰酸酚-氯仿提取法盐类通常是核酸样本中最常见的杂质成分，因此，在将核酸样本进行下游处理和分析前，通常需要去除盐类成分。

因此，通常需一或多个分离和（或）纯化步骤来使样本脱盐。

核酸纯化的常规步骤包括细胞裂解，该步骤通过破坏细胞结构而形成细胞裂解液，同时灭活包括DNA酶和RNA酶在内的细胞内源性核酶，并最终从细胞碎片中获得纯净的核酸样本。

有机溶剂-苯酚-氯仿提取法正是基于上述原理最常见的核酸经典提取方法之一。

苯酚-氯仿-异丙醇按照一定比例混合后（即：25∶24∶1）可抵制RNA酶活性，从而克服单用苯酚无法抑制RNA酶活性的不足。

蛋白、脂质、碳水化合物和细胞碎片可通过提取苯酚和氯仿有机试剂混合物的水相而去除。

含有DNA样本的水相可通过加入2∶1或1∶1比例的乙醇或异丙醇沉淀，最后，沉淀下来的DNA用70%乙醇洗涤并最后溶解于TE缓冲液或无菌去离子水中。

异硫氰酸胍（guanidinium isothiocyanate）用于RNA提取的方法最早见于1977年，但是，由于该方法比较繁琐，后来逐步被称之为胍硫氰酸酚-氯仿提取法（guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction）代替，该方法可一步完成RNA提取。

其基本原理是：硫氰酸胍是蛋白质强变性剂，能裂解组织细胞，释放RNA，抑制RNA酶的活性，同时与RNA形成可溶性复合物，经过酚-氯仿抽提，使RNA 与组织中的DNA和蛋白质分离开，达到分离提取总RNA的目的。

简述核酸分离纯化的主要步骤。

大家好，今天我们来聊聊核酸分离纯化这件事。

说到这个话题，很多人可能会觉得这就像是从泥巴里找金子，难得不得了，但其实只要掌握了步骤，简直就像是在玩一场化学版的捉迷藏。

核酸分离纯化是为了从各种样本中提取出我们的DNA或RNA，并且把它们从其他杂质中清理出来。

要做到这一点，我们得一步步来，每一步都不容马虎。

接下来，就让我带大家一起走进这个过程，看看如何让这些细小的分子从一堆混乱中脱颖而出。

2. 主要步骤详解2.1 样本准备首先，咱们得从头开始，准备好样本。

想象一下，我们要从一杯混合果汁中找出果肉，首先就得把这杯果汁倒进一个干净的容器里。

具体来说，我们通常会从细胞中提取核酸，所以需要将细胞破碎以释放出核酸。

这个过程就像是在打开一罐罐头，一切都要小心翼翼。

为了让细胞破裂，我们会用到一些化学试剂或者物理方法，比如用研磨机或者超声波处理。

就像是把一个充满秘密的小盒子打开，里面的核酸就这样被释放了出来。

2.2 核酸提取一旦细胞被破坏，释放出的核酸就是我们接下来要处理的对象。

这时候我们需要把这些核酸从其他杂质中分离出来。

这个步骤就像是在海滩上捡贝壳，我们需要把那些不起眼的沙子和海藻去掉，剩下的才是我们真正想要的。

核酸提取的方法有很多，比如利用试剂盒或者化学溶液。

常见的有酚氯仿提取法和柱纯化法。

酚氯仿法就像是用一招老派的武功，把核酸和蛋白质分开，而柱纯化法则像是用现代化的设备，让核酸在特定的柱子上游刃有余地被吸附下来。

2.3 核酸纯化好啦，提取出核酸之后，接下来就是纯化了。

纯化这一步，就像是用细网筛选掉杂质，只留下最珍贵的部分。

我们通常会使用一些化学试剂来清洗掉剩余的杂质，比如盐、酒精等。

这个过程有点像给你的衣服做干洗，把那些不干净的部分都清理干净。

纯化的目的是为了确保你得到的核酸足够干净，以便后续的实验能顺利进行。

3. 检测与保存3.1 检测最后一步，我们得检测一下核酸的质量，看看它是不是达到了要求。

核酸分离纯化的主要步骤1. 什么是核酸分离纯化？嘿，大家好！今天我们来聊聊核酸分离纯化这回事。

说白了，它就是从细胞里提取出DNA或RNA的过程。

就像是把美味的汤从锅里倒到碗里，确保里面没有杂质。

咱们的细胞里有很多东西，像是蛋白质、脂类和水分，真是五花八门。

但我们只想要那个最重要的核酸，嘿，这可是一项技术活哦！2. 核酸分离纯化的主要步骤2.1 细胞裂解第一步，就是把细胞搞破。

这听起来有点狠，但其实这是必须的，像个忍者一样，咱们得悄悄潜入细胞的世界。

我们用一种叫做裂解缓冲液的东西，里面有各种化学物质，可以把细胞膜弄得稀巴烂。

想象一下，把一个坚硬的蛋壳敲开，里面的蛋黄蛋白就可以流出来啦！这时候，细胞里的东西就会全部跑出来，嘿嘿，包括咱们要找的核酸。

2.2 细胞碎片去除接下来，咱们要把那些不需要的“杂物”清理掉。

细胞里面可不是清汤挂面，咱们得把破碎的细胞膜和其它大块的东西滤掉。

这个过程可以用离心来搞定，像旋转木马一样，把重的东西甩到边上，让核酸跟着跑到上面。

然后小心翼翼地把上面的液体吸出来，这可得细心，别把宝贝也给弄丢了！2.3 核酸沉淀好啦，经过一番折腾，咱们终于把核酸从那些杂七杂八的东西里解救出来了。

可是，这时候核酸还没完美地展现出来，咱们还需要进一步把它沉淀下来。

这里就要用到乙醇或异丙醇，咱们把它们加入到提取液中，就像给核酸穿上一件漂亮的外衣。

等一会儿，核酸就会像小颗粒一样沉到瓶底，真是美得不要不要的！3. 清洗和重悬核酸3.1 清洗核酸在沉淀出核酸后，我们还得给它洗个澡，别让它沾上那些脏东西。

再加点冷的乙醇，把沉淀的核酸轻轻洗一遍，像给小狗洗澡一样，既要温柔又要彻底。

洗完后，再把它离心一遍，剩下的就会是干净的核酸，闪闪发光，简直美丽动人！3.2 重悬核酸最后一步，就是把干净的核酸放到一个适合它的环境中，让它重新“生活”起来。

咱们用合适的缓冲液把它溶解开，确保它能够活跃地工作。

就像小鸟飞回温暖的家，核酸终于回到了它该待的地方。

《核酸分离纯化》课件一、课件概述核酸分离纯化是分子生物学和生物技术领域中的一项基本技术，其目的是从复杂的生物样品中提取和纯化出高质量的核酸，以便进行后续的分析和应用。

本课件将介绍核酸分离纯化的基本原理、方法和步骤，帮助学生掌握这一技术。

二、课件内容1. 核酸分离纯化的意义核酸是生物体内重要的遗传物质，其分离纯化对于研究基因表达、基因调控、基因突变等方面具有重要意义。

核酸分离纯化是进行基因克隆、基因测序、PCR等实验的基础步骤。

2. 核酸分离纯化的基本原理核酸的物理化学性质：核酸具有一定的溶解度、吸附性、变性温度等。

核酸与蛋白质、RNA、DNA等分子的差异：通过特定条件下对不同分子的相互作用进行分离。

利用核酸的特异性：通过特定酶的作用，实现对核酸的分离纯化。

3. 核酸分离纯化的方法盐析法：利用核酸在高盐浓度下的溶解度降低，将核酸与其他物质分离。

有机溶剂沉淀法：利用有机溶剂（如酚、氯仿等）与水相不相溶的性质，将核酸与其他物质分离。

吸附法：利用特定吸附剂（如硅胶、纤维素等）对核酸的选择性吸附，将核酸与其他物质分离。

透析法：利用透析袋的选择性透过性，将核酸与其他大分子物质分离。

酶法：利用特定酶（如DNA酶、RNA酶等）对核酸的降解作用，实现对核酸的分离纯化。

4. 核酸分离纯化的步骤样品处理：取适量生物样品，加入适量裂解液，进行充分搅拌，使细胞破碎并释放核酸。

核酸提取：将样品转移至离心管中，进行高速离心，将核酸沉淀与其他物质分离。

核酸纯化：根据核酸的物理化学性质，选择适当的分离方法（如盐析、有机溶剂沉淀等），将核酸与其他物质分离。

核酸洗涤：用适量的洗涤液对核酸沉淀进行洗涤，去除残留的杂质。

核酸重悬：加入适量的溶解液，将核酸沉淀重悬，以便进行后续分析或应用。

5. 实验操作注意事项实验操作应在生物安全柜中进行，避免交叉污染。

实验过程中应使用无RNA酶、无DNA酶的试剂和工具。

实验操作过程中应注意个人防护，避免接触核酸样品。

《核酸的分离纯化》课件课程目标：1. 理解核酸分离纯化的意义和重要性。

2. 掌握核酸分离纯化的基本原理和步骤。

3. 学习核酸分离纯化的实验操作技巧。

4. 了解核酸分离纯化在科学研究和临床诊断中的应用。

第一部分：核酸分离纯化的意义和重要性1. 核酸的定义和功能核酸是生物体内携带遗传信息的分子，包括DNA和RNA。

核酸在遗传信息的传递、基因表达调控和疾病发生中起着重要作用。

2. 核酸分离纯化的意义核酸分离纯化是研究核酸结构和功能的基础。

核酸分离纯化有助于研究基因表达调控、基因突变和基因功能。

核酸分离纯化在临床诊断和疾病治疗中具有重要意义，如病原体检测、基因突变筛查和个体化治疗。

第二部分：核酸分离纯化的基本原理和步骤1. 核酸分离纯化的基本原理根据核酸的物理化学性质，如大小、电荷、亲和性和稳定性等，进行分离纯化。

常用的分离纯化方法包括离心、电泳、亲和色谱和质谱等。

2. 核酸分离纯化的基本步骤样品处理：收集含有核酸的样品，如细胞裂解、核提取等。

核酸释放：通过机械或化学方法将核酸从样品中释放出来。

核酸沉淀：通过盐析、酒精沉淀等方法将核酸从溶液中沉淀下来。

核酸洗涤：去除沉淀中的杂质，如蛋白、RNA等。

核酸纯化：通过柱层析、亲和色谱等方法进一步纯化核酸。

核酸鉴定：通过紫外线吸收、琼脂糖凝胶电泳等方法检测核酸的质量和数量。

第三部分：核酸分离纯化的实验操作技巧1. 样品处理技巧细胞裂解：使用酶或化学方法裂解细胞，释放核酸。

核提取：使用盐水或缓冲液提取核酸。

2. 核酸沉淀技巧盐析：加入高盐浓度使核酸沉淀。

酒精沉淀：加入酒精使核酸沉淀。

3. 核酸洗涤技巧离心：使用离心机去除沉淀中的杂质。

洗涤缓冲液：选择适当的洗涤缓冲液去除杂质。

4. 核酸纯化技巧柱层析：使用固定相和流动相进行核酸纯化。

亲和色谱：利用核酸与特定配体之间的亲和力进行纯化。

5. 核酸鉴定技巧紫外线吸收：测量核酸在紫外线波段的吸光度。

琼脂糖凝胶电泳：将核酸样品在琼脂糖凝胶上进行电泳，观察核酸的迁移率和条带形状。