免疫亲和纯化和免疫沉淀.ppt

淀现象。
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3
沉淀反应分两个阶段
第一阶段
第二阶段
抗原抗体特异性结 形成肉眼可见的大的 合，快速但不可见 免疫复合物。
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4
二、免疫沉淀试验的分类
液体内 沉淀试验
凝胶内 沉淀试验
环状沉淀试验
免疫扩散试验
絮状沉淀试验
免疫电泳技术
免疫浊度测定
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5
三、 免疫沉淀试验的特点
1. 阶段性 2. 特异性 3. 抗原性质：可溶性 4. 抗体的选择：2价
第六章 免疫沉淀试验
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1
教学目的
掌握：液相内沉淀试验、凝胶内沉淀试验 原理
熟悉：沉淀反应的特点、免疫电泳技术、 沉淀反应的应用
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2
第一节 免疫沉淀试验的基本原理
一、基本原理
免疫沉淀反应（immunoprecipitation
reaction）指可溶性抗原与相应抗体在
适当条件下发生特异性结合而出现的沉
电渗方向与样品运动方向不一致： 样品迁移率降低，甚至倒退
.
46
电泳载体： 琼脂 琼脂糖凝胶
常用浓度：0.8%-1.0% 特点:杂质少、接近电中性，常温易凝 固，色泽透明、质地均匀、富有弹性。
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47
蛋白质的两性解离性质：
--NH2 + H2O
--NH3+ + OH-
--COOH
--COO- +H+
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75
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57
（三）免疫电泳
原理：区带电泳＋双向扩散
1、将蛋白质抗原在凝胶中电泳分成肉眼
不可见的若干区带
2、沿电泳方向挖一与之平行的抗体槽，
加入相应抗血清进行双向扩散

明确实验目的和预期结果，设计合理 的实验方案。
检查所需的仪器设备是否齐全和正常 工作，如离心机、摇床、离心管等。
实验操作流程
抗体与蛋白质样品的结合
将抗体与蛋白质样品混合，确保抗体与目标 蛋白质充分结合。
共沉淀物的分离
通过离心或过滤等方法将共沉淀物与溶液分 离。
清洗非特异性结合
通过洗涤去除未结合的蛋白质和其他杂质。
结果分析方法
统计学分析
采用t检验或方差分析等统计学方法，对实验数据进行处理和分析，以确定共沉淀物之间的相互作用 是否具有统计学显著性。
生物信息学分析
利用在线生物信息学工具对共沉淀物进行功能注释、基因本体论（GO）分类和蛋白质相互作用网络 分析，以深入了解共沉淀物的生物学功能和相互作用关系。
结果解读与讨论
值的实验数据和结论。
未来可以对这些蛋白质复合物的 功能进行深入研究，探讨其在生 物学和医学中的意义和作用机制
。
同时，随着技术的不断进步和应 用领域的拓展，免疫共沉淀技术 还有望在更多领域发挥重要作用
。
未来研究方向与建议
1
进一步优化免疫共沉淀实验条件和方法，提高实 验的特异性和灵敏度，以分离和鉴定更多蛋白质 复合物。
结果解读
根据实验结果，分析共沉淀物的生物学 意义和功能，探讨它们与目标蛋白的相 互作用机制。
VS
结果讨论
结合已有研究，对实验结果进行深入讨论 ，提出可能的生物学模型或假设，为后续 研究提供思路和方向。同时，对实验的局 限性进行说明，并提出改进方向。
05
结论与展望
结论总结
免疫共沉淀技术是研究蛋白质相互作用的经典方法之一，在生物学和医学 研究中具有广泛应用。
பைடு நூலகம்

2）上样：血清让胶床表面几乎不留液层，然后小心注入床面 中央~2ml稀释血清，待样液几乎全部进入胶床表面后，关止 水夹，室温下样品与填料结合15min。
实验步骤
1. Protein A纯化：
3）冲洗：加2倍柱体积冲洗缓冲液，打开止水夹，控制流出 速度为2ml/min，并用试管收集流出液(记为W)，在床表面仅 有1毫米左右液层时，关止水夹，再加入2倍柱体积平衡缓冲 液冲洗填料，床表面仅有1毫米左右液层时，关止水夹， 。 4）洗脱收集：取刻度试管2支编号，柱床上面加3倍柱体积 洗脱缓冲液，控制止水夹流出1倍柱体积洗脱液后，关止水 夹，室温下柱料与洗脱液孵育15min，打开止水夹控制流出 速度为1ml/min收集2倍柱体积（记为E1），待床表面仅有1 毫米左右液层时再加入3倍柱体积洗脱缓冲液， 收集2倍柱体 积记为E2。 5）收集结束后，加入清洗液（6M NaOH）洗涤2cv，平衡 液5cv。
下面开始实验！
2.5ml
2.5ml
2.5 ml
4 ml
2.5ml
3.3 ml
10% SDS 100 μl
100 μl
100 μl
TEMED 10% AP
10 μl 10 μl 10 μl
100 μl 100 μl 100 μl
四、实验步骤
2.SDS-PAGE 纯度测定
3、按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5 cm左右， 之后加少许蒸馏水，静置30分钟。凝胶配制过程要迅速， 催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则凝结无法注胶。注 胶过程最好一次性完成，避免产生气泡。水封的目的是为 了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是 胶与水层之间形成清晰的界面。
特异性
许多IgGs 的Fc 片断 许多IgGs 的Fc 片断 特异的抗体 特异免疫球蛋白

盐析沉淀法 是最古老而又经典的蛋白质纯化 分离技术。由于方法简便、有效、不损害蛋白 抗原活性等优点，至今仍被广泛原理
因为蛋白质是亲水性大分子，所以在水溶液中有双电 层结构的水合膜，来保证分子的溶解度平衡并稳定存在。 当加入盐时，盐会电离成离子态，离子的电性破坏了蛋白 质的双电层的水合膜结构，从而使其沉降，析出。
凝胶过滤(分子筛层析)图示1
凝胶过滤(分子筛层析)图示2
离子交换层析柱
亲和层析
是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子 间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。 例如抗 原和抗体（免疫亲和层析）、 酶和酶抑制剂（或配 体）、酶蛋白和辅酶、激素和受体等之间有一种特殊 的亲和力，在一定条件下，它们能紧密地结合成复合 物。如果将复合物的一方固定在不溶性载体或共价结 合在一种惰性的微珠上，则可从溶液中专一地分离和 提纯另一方。与上述其他纯化方法相比，亲和层析能 产生相当高的纯化作用。另外，此法的优点是迅速， 有时仅一步即可达到纯化的目的。
生物工程下游技术：一般包括产物（一般为蛋白质） 的预处理及分离纯化；产品的成型加工和质量监控等一 系列单元操作和过程中的主要技术,其中生化产物及发 酵产物的分离纯化是其核心内容。下游技术是生物工程 重要组成部分,是生物高科技技术实现产业化的关键， 如：酶工程 , 发酵工程等（提取干扰素、胰岛素和酶 等）。
免疫亲和纯化技术
亲和纯化(affinity purification)是基 于目标分子与固定化配体的特异性 相互作用(如：抗原-抗体)。亲和技 术可用来从混和物中分离特定分子。 捕获目标分子用于相互作用研究, 或 从反应体系中去除某一成分。
免疫亲和纯化原理
免疫亲和纯化是一种分离各种生物大分子最有效的方法
免疫亲和纯化和免疫沉淀技术

液，沸水煮5分钟；
（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱 仪分析。
一、 样品处理：
二、 抗体-agarose beadsads复合物洗涤：
四、 鉴定 构的蛋白质一蛋白质相互作用。
量细胞裂解缓冲液（含蛋白 免疫共沉淀酶 适，与Western blotting或者ELISA相比容易出 用于免疫共沉淀的抗体不总是与操作相合 乙醇沉淀dna和异丙醇沉淀dna的区别 （6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱 质进行N端氨基酸序列分析，推断出相应的 但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。 （2）取少量裂解液以备Western blot分析， 但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。 二、 抗体-agarose beads孵育 疫复合物，然后分离该蛋白质，对该蛋白 用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该
缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在 DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的 乙醇漂洗DNA沉淀数次。
实验流程
（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适
量细胞裂解缓冲液（含蛋白 免疫共沉淀酶
抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于
量量细细胞 胞4裂裂°解解C缓缓冲冲，液液（（最含含蛋蛋大白白转免免速疫疫共共离沉沉淀淀心酶酶30 min后取上清； 将 包含活性物（质的2组）织取或细少量裂解液以备Western blot分析， 量选乙细未醇胞 知 ：剩液裂蛋沉余，解白淀缓会D裂4N冲遇A°液到乙解（障醇C液含碍是缓蛋。首加白慢选的1免摇有μ疫机g晃共溶相沉孵剂淀应，酶育对的盐过类抗夜沉体淀；少加，D入NA到沉淀细中所胞含裂的衡解量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。

机制。
研究疾病机制： 免疫共沉淀技术 可以用于研究疾 病机制，了解疾 病相关的蛋白质 相互作用和调控
机制。
实验流程及操作
实验材料：抗体、抗原、缓冲液、 离心管等
实验环境：无菌操作台、超净工作 台等
添加标题
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实验设备：离心机、显微镜、电泳 仪等
实验人员：具备相关实验技能和操 作经验的人员
关键因素：抗体浓 度、孵育时间、洗 涤次数、复溶缓冲 液
注意事项：避免非 特异性结合、防止 蛋白降解、确保实 验重复性
洗涤步骤：使用洗涤缓冲液洗涤，去除未结合的蛋白 洗涤次数：一般需要洗涤3-5次 检测方法：使用Western Blotting或ELISA等方法进行检测 检测结果：根据检测结果判断免疫共沉淀是否成功
有害气体
穿戴防护服、 手套、口罩等 个人防护用品
实验过程中， 避免直接接触 实验材料，使 用一次性手套
和镊子
实验结束后， 及时清理实验 台面，避免污
染环境
实验过程中， 如出现异常情 况，立即停止 实验，并报告 实验室负责人
实验结束后， 对实验材料进 行妥善处理， 避免污染环境
实验优化与拓展
抗体选择：针对目 标蛋白选择特异性 抗体
免疫共沉淀实验成功分离出目标蛋白 目标蛋白与相互作用蛋白结合，验证了实验假设 实验结果支持了目标蛋白在细胞信号传导中的作用 实验结果提供了对目标蛋白功能的新认识
实验注意事项及常 见问题
确保实验操作在无菌环境下进行，以避免污染。 注意使用新鲜的抗体，避免影响实验结果。 注意控制孵育时间和温度，以保证实验结果的准确性。 在洗涤过程中要彻底洗去未结合的蛋白质，以免干扰实验结果。
洗脱条件：优化洗 脱条件以减少非特 异性结合

3. 思索抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原， 过多那么就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂 太少那么不能溶解抗原，过多那么抗原被稀释。
Co-IP任务表示图
Co-immunoprecipitation
Y Y
binding
wash
elution
利用western blot 确定捕获蛋白
6. sds-page, western blotting或质谱仪分析。
实验本卷须知
〔1〕细胞裂解采用温暖的裂解条件，不能破坏细胞内存在的一切蛋 白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂〔np40或triton x-100)。 每种细胞的裂解条件是不一样的，经过阅历确定。不能用高浓度的变 性剂〔0.2 sds)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cocktailer。
优点
1. 相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的， 处于天然形状；
2. 蛋白的相互作用是在自然形状下进展的， 可以防止人为的影响；
3. 可以分别得到天然形状的相互作用蛋白复 合物。
缺陷
1. 能够检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－ 蛋白质相互作用
2. 两种蛋白质的结合能够不是直接结合，而 能够有第三者在中间起桥梁作用；
3. 如用western blot检验，必需在实验前预 测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗 体，假设预测就是抗体的性质。抗体不同和抗原结 合才干也不同，免染能结合未必能用在IP反响。建议仔 细检查抗体的阐明书。特别是多抗的特异性是问题。
2. 为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必需加蛋 白酶抑制剂，低温下进展实验。
经过质谱确定捕获的蛋白
实验步骤
1. 收获细胞，参与适量细胞裂解缓冲液〔含蛋白酶抑制剂〕， 冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°c， 最大转速离心30 min 后取上清；

3
生物工程技术
利用基因工程和蛋白质工程技术，开发具有高亲 和力和选择性的免疫亲和色谱配体，提高分离效 果。
提高免疫亲和色谱的特异性、灵敏度与重现性
优化免疫亲和色谱配体
通过蛋白质工程和基因工程技术，对免疫亲和色谱配体进行改造 和优化，提高其亲和力和选择性。
信号放大技术
结合酶促反应、化学放大等技术，提高检测信号的强度和灵敏度， 降低检测限。
免疫亲和色谱ppt课件
• 免疫亲和色谱简介 • 免疫亲和色谱的制备 • 免疫亲和色谱的操作流程 • 免疫亲和色谱的实际应用案例 • 免疫亲和色谱的未来发展与挑战
01
免疫亲和色谱简介
定义与原理
定义
免疫亲和色谱是一种基于抗原-抗 体特异性结合的分离分析技术。
原理
利用抗体或抗原与固定相上的配 基进行特异性结合，达到分离目 标物质的目的。
免疫亲和色谱的应用领域
01
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03
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生物药物分离纯化
用于分离纯化抗体、蛋白质、 酶等生物药物。
临床诊断
用于检测生物样本中的抗原、 抗体，辅助疾病诊断。
环境监测
用于检测环境中的有害物质， 如毒素、重金属等。
食品安全
用于检测食品中的有害物质、 农药残留等。
免疫亲和色谱的优势与局限性
优势
高特异性、高纯度分离、操作简便、 可重复使用等。
准确性。
样品纯化
去除样品中的杂质，提高样品的纯 度，以便更好地进行后续分析。
样品标记
对样品进行标记，以便在免疫亲和 色谱分离过程中进行追踪和检测。
免疫亲和色谱分离
抗体选择
选择针对目标分子的特 异性抗体，确保分离的
准确性和高效性。

抗体亲和层析柱的制备：
抗体与固相基质的连接： 1、最常用的基质为蛋白A和蛋白G微珠， 可与抗体的Fc功能区特异结合。 2、将抗体直接与一种活性微珠（表达活 性的反应基团）连接。
抗体与微珠的结合方法
试剂 优点 缺点 与抗体结合的基团
二甲基庚二酸酯 -NH2 蛋白A 抗体定向确切， 粒柱还能与其他无关 容易结合 的抗体结合，昂贵
法固然可结合较多的抗原，但增加了洗脱的困难性。
只有当所需的最终产物为变性蛋白时，才选用识别多 个表位的抗体。
免疫亲和纯化的关键：高亲和力与容易洗脱的优
化组合。
常见错误是将低亲和力和容易洗脱等同看待。
1．亲和层析支持物的选择:作为亲和层析支持物须 符合以下要求：①非特异性吸附低；②液体通过 时流速要快；③在各种pH和高浓度盐溶液中稳 定；④必须有合适的、丰富的化学基团，能有效
芽糖、糊精以及糖浆等。
③ 医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病。 ④ 基因工程的需要：DNA合成酶、RNA逆转录酶等。
超速离心 是分离亚细胞及蛋白质大分子的有效手
段，往往是进一步纯化的第一次过筛。超速离心又分
差速离心和梯度离心。用超速离心或梯度离心分离和 纯化抗原只是一种根据蛋白的比重特点分离的方法， 除个别成分外，极难将某一抗原成分分离出来。目前 仅用于少部分大分子抗原，如IgM、C1q、甲状腺球蛋 白等，以及一些比重较轻的抗原蛋白如载脂蛋白A、B 等。对于大量的中、小分子量蛋白质，多不适宜用超 速及梯度密度离心作为纯化手段。
影响免疫亲和层析纯化效果的因素
抗原初始相对浓度（即纯度）：是决定最终产物纯度 极为重要的因素。 抗原与抗体的亲和力：是免疫亲和纯化层析过程中最 麻烦的问题。高亲和力抗体（>10-8 mol/L)能在1 h以内